Ac-SDKP對TGF-β1誘導的大鼠腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化的影響

黃鳳璋 覃玉花 梁鳴*

(1.廣州醫(yī)科大學附屬市一人民醫(yī)院腎內(nèi)科; 2.廣西醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院風濕免疫科,廣東 廣州 510180)

腎小管間質(zhì)纖維化常表現(xiàn)為小管萎縮和擴張、間質(zhì)白細胞浸潤、成纖維細胞聚集以及間質(zhì)基質(zhì)沉積等[1]。EMT是一種固有的上皮標記物丟失而獲得間質(zhì)特征的現(xiàn)象，可根據(jù)其發(fā)生的生物環(huán)境被細分為三類(1型、2型和3型)，其中2型EMT與纖維化有關(guān)，在腎臟中可以發(fā)生在腎小球的足細胞、壁層上皮細胞及腎小管上皮細胞內(nèi)。TGF-β1已經(jīng)被證明是EMT的最佳觸發(fā)劑，也最強烈的致纖維化因子，其在腎小管上皮細胞內(nèi)通過激活R-Smads通路誘導腎小管上皮細胞EMT[2]。Tβ4的降解產(chǎn)物Ac-SDKP已經(jīng)證明能通過抑制 TGF-β1誘導的Smad2磷酸化發(fā)揮抗腎臟纖維化的作用，有研究指出Tβ4在硬化腎小球中表達升高[3].因此，為探究在腎臟纖維化中Ac-SDKP與Tβ4的關(guān)系。本實驗通過檢測TGF-β1刺激誘導體外大鼠腎小管上皮細胞發(fā)生EMT后Tβ4的表達及予不同濃度的Ac-SDKP共同作用后Tβ4表達的變化，進一步探討Tβ4在腎小管上皮細胞發(fā)生EMT后的表達及Tβ4和Ac-SDKP的相互作用對EMT的影響，為阻斷和逆轉(zhuǎn)腎間質(zhì)纖維化探尋新的、合理有效的方法尋找實驗依據(jù)，為腎臟纖維化的藥物治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑 兔多克隆Tβ4抗體(abcam公司)；兔多克隆a-SMA抗體(北京博奧森生物有限公司)；重組人TGF-β1蛋白(廣州佰浩生物技術(shù)有限公司)；Ac-SDKP(Abbiotec公司)；卡托普利(廣州齊云生物科技有限公司)；兔EnVision二步法檢測試劑盒(DAKO公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞的傳代及藥物刺激 往培養(yǎng)皿中加入胰蛋白酶溶液1ml，輕輕搖晃培養(yǎng)皿使所有細胞表面覆蓋有消化液，1～2 min后，在顯微鏡下見細胞間隙增大，細胞變圓，吸走消化液終止消化。加入培養(yǎng)液，反復吹打細胞使細胞分開，脫落成為單細胞懸液，以2×105個/mL的密度種植于6孔板里，隨機分為6組：①空白對照組，②TGF-β1(5 ng/mL)刺激組，③TGF-β1(5 ng/mL)+卡托普利(1 μmol/L)，④TGF-β1(5 ng/mL)+Ac-SDKP(0.1 nmol/L)+卡托普利(1 μmol/L)組，⑤TGF-β1(5 ng/mL)+Ac-SDKP(1 nmol/L)+卡托普利(1 μmol/L)組，⑥TGF-β1(5 ng/mL)+Ac-SDKP(10 nmol/L)+卡托普利(1μmol/L)，每組做三個復孔，培養(yǎng)48 h。加卡托普利為防止Ac-SDKP的降解。

1.2.2培養(yǎng)細胞的Envision免疫組化二步法實驗步驟

1.2.2.1 細胞爬片 培養(yǎng)瓶中的細胞長到2×105個細胞/ ml 時，用胰蛋白酶消化制成細胞懸液；在滅菌的六孔板中每孔鋪上一塊蓋玻片；取細胞懸液分別滴到玻片上，讓細胞貼片30 min左右；然后在培養(yǎng)皿中補加完全培養(yǎng)液，放于37 ℃、5%CO2μmol/L培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；待細胞長到70%～80%后換不含血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細胞處于G0期。

1.2.2.2 細胞免疫組化染色 取出細胞，PBS沖洗 5 min×3次→4%的多聚甲醛固定20 min；PBS沖洗 5 min×3次→0.3%的TritoonX-100通透20 min；PBS沖洗 5 min×3次→3%的過氧化氫孵育15 min；PBS沖洗 5 min×3次→分別加入一抗兔抗人Tβ4(1∶800)和兔抗人α-SMA(1∶100)，置于濕盒中4℃冰箱孵育過夜(14～16 h)；PBS沖洗5 min×3次→加DAKO ChemMate EnVision/HRP，Rabbit/Mouse (ENV) 二抗，置于 37 ℃溫箱孵育30 min；取出細胞，PBS沖洗5 min×3次；加入DAKO公司的DAB顯色液，現(xiàn)配現(xiàn)用，顯微鏡下觀察，3 min后用自來水終止顯色反應，自來水洗5min；蘇木素復染細胞核2 min，自來水洗1 min；鹽酸酒精分化5 s后用水洗2 min；溫水2 min返藍，風筒吹干，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.3Tβ4和α-SMA細胞免疫組化染色結(jié)果的半定量分析 采用Image Pro-plus6.0病理圖像分析系統(tǒng),通過光學顯微鏡放大200倍攝取圖像,輸入圖像分析系統(tǒng)內(nèi),對圖像進行灰度變換,使陽性面積與背景分開,進行自動測量。需要測量每張照片選擇區(qū)域的面積(area)與累積光密度(IOD),方法步驟如下：① 攝片,每張切片在200倍鏡下選擇6個不重復的視野。② 軟件算出每張照片的IOD和area,之后對染成藍色的細胞核計數(shù)，作為細胞數(shù)N，以O(shè)D=IOD/(N×area)作為免疫組化染色半定量指標。③ 計算同一實驗組切片各照片OD值的平均值及標準誤。④ 用統(tǒng)計學方法分析各實驗組的OD值之間是否有顯著性差異。

1.3 統(tǒng)計學分析

用IPP6.0圖像分析軟件計算出各組的OD值，數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)±標準誤表示；組間均數(shù)比較前，經(jīng)Levene檢驗總體方差，如方差齊選用方差分析，方差不齊選用近似t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義；對有相關(guān)趨勢的變量，采用Pearson相關(guān)分析，P<0.01為有差異統(tǒng)計學意義。所有數(shù)據(jù)由SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析處理。

2 結(jié)果

2.1 腎小管上皮細胞的形態(tài)改變

正常的大鼠腎小管上皮細胞成圓形或類圓形，呈鵝卵石樣排列；TGF-β 1(5 ng/mL)刺激48h后細胞形態(tài)明顯拉長，呈梭長形，似成纖維細胞；予Ac-SDKP干預后，濃度為0.1和1 nmol/L時，細胞形態(tài)未見明顯變化，10 nmol/L時細胞形態(tài)似有恢復類圓形，但未達到正常的細胞形態(tài)。(見圖1)

ABCDEF

A.空白對照組 B TGF-β1C TGF-β1+卡托普利 D TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(0.1 nmol/L) E TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(1 nmol/L) F TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(10 nmol/L)

圖1 TGF-β 1(5 ng/mL)刺激腎小管上皮細胞48 h后細胞形態(tài)變化(光鏡×400)

2.2 細胞免疫組化染色結(jié)果

2.2.1腎小管上皮細胞中Tβ4的表達變化 空白對照組細胞漿與細胞核內(nèi)Tβ4呈弱陽性表達，OD值為(0.203±0.009)；TGFβ-1陽性對照組與空白對照組比較，腎小管上皮細胞胞漿及胞核內(nèi)Tβ4的表達(褐色)明顯增加，OD值為(0.346±0.016)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；TGFβ-1+卡托普利組褐色稍有減少，但變化不明顯，OD值為(0.337±0.021)，與TGF-β1陽性對照組比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；0.1 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L Ac-SDKP+TGF-β1+卡托普利共同作用組與TGFβ-1陽性對照組比較，Tβ4表達均降低，10 nmol/L降低最顯著，OD值分別為(0.321±0.013)、(0.297±0.018)、(0.237±0.008)，與TGF-β1陽性對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；0.1 nmol/L、1 nmol/L分別與10 nmol/L組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(見圖2、3)

2.2.2腎小管上皮細胞中α-SMA 的表達變化 空白對照組胞漿內(nèi)α-SMA僅有微量表達，OD值為(0.184±0.007)；TGF-β1陽性對照組與空白對照組比較，腎小管上皮細胞胞漿內(nèi)α-SMA的表達(褐色)明顯增加，OD值為(0.345±0.008)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；加入卡托普利后α-SMA的表達稍降低，但與TGF-β1陽性對照組相比下降不明顯，OD值為(0.334±0.023) ，與TGF-β1陽性對照組比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；0.1 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L Ac-SDKP+TGF-β1+卡托普利共同作用組與TGF-β1陽性對照組比較，α-SMA表達均降低，10 nmol/L降低最顯著，OD值分別為(0.312±0.015)、(0.304±0.016 )、(0.225±0.018)，與TGFβ1陽性對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；0.1 nmol/L、1 nmol/L組分別與10 nmol/L組比較，差異均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。(見圖4、5)

ABCDEF

A.空白對照組；B.TGF-β1;C.TGF-β1+卡托普利;D.TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(0.1 nmol/L);E.TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(1 nmol/L); F.TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(10 nmol/L)

圖2 免疫組化染色顯示TGF-β 1單獨作用及與不同濃度Ac-SDKP共同作用48 h后大鼠腎小管上皮細胞Tβ4的表達(×400)

A.空白對照組;B.TGF-β1;C.TGF-β1+卡托普利;D.TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(0.1 nmol/L);E.TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(1 nmol/L);F.TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(10 nmol/L)

圖3 各組細胞Tβ4免疫組化染色的半定量分析

ABCDEF

A.空白對照組;B.TGF-β1;C.TGF-β1+卡托普利;D.TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(0.1 nmol/L);E.TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(1 nmol/L);F.TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(10 nmol/L)

圖4 免疫組化染色顯示TGF-β 1單獨作用及與不同濃度Ac-SDKP共同作用48 h后大鼠腎小管上皮細胞α-SMA的表達(×400)

A.空白對照組;B.TGF-β1;C.TGF-β1+卡托普利;D.TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(0.1 nmol/L);E.TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(1 nmol/L);F.TGF-β1+卡托普利+Ac-SDKP(10 nmol/L)

圖5 各組細胞a-SMA免疫組化染色的半定量分析

2.2.3Tβ4和α-SMA在TGFβ-1刺激大鼠腎小管上皮細胞EMT后表達量的相關(guān)性分析 Tβ4和α-SMA在腎小管上皮細胞的表達存在直線正相關(guān)關(guān)系且差異具有計學意義(r=0.995，P<0.01)。(見圖6)

0.3500.3000.2500.2000.150α-SMA陽性信號的平均OD值0.2100.2400.2700.3000.330Tβ4陽性信號的平均OD值RSqLinear=0.99

圖6 Tβ4和 α-SMA在TGF-β1誘導大鼠腎小管上皮細胞EMT后表達量的相關(guān)分析

3 討論

纖維化是慢性腎臟疾病進展的一個關(guān)鍵因素，EMT在成熟組織纖維化期間成纖維細胞的發(fā)生過程中起重要作用，來自于腎臟纖維化的研究證據(jù)表明，有超過三分之一的成纖維細胞起源于腎小管上皮細胞[2]。細胞極性消失和細胞間緊密連接消失、上皮細胞的表型標志物E-鈣粘素的表達下調(diào)，并表達波形纖維蛋白、α-SMA、成纖維細胞特異蛋白1(Fibroblast-specific proteinl,FSP1)，是腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化的標志。

Hong KO等[4]通過體外培養(yǎng)的口腔鱗癌細胞證明過表達Tβ4可使E-鈣粘素表達下調(diào)和波形纖維蛋白表達上調(diào)，據(jù)此推測Tβ4是口腔鱗癌中EMT樣表型的重要調(diào)節(jié)者。Tβ4是由44個氨基酸殘基組成的結(jié)構(gòu)高度保守的水溶性酸性多肽，是β胸腺肽家族中含量最高的成員，被認為是人的血小板內(nèi)主要的球形肌動蛋白(G-肌動蛋白)結(jié)合肽[5]。Tβ4經(jīng)過兩步水解反應最終釋放Ac-SDKP，而Ac-SDKP幾乎唯一的被血管緊張素轉(zhuǎn)換酶水解[6]。在一些體內(nèi)實驗和臨床試驗中證明，Ac-SDKP能夠阻止高血壓和慢性腎臟病中膠原蛋白的合成[7]及逆轉(zhuǎn)心肌梗死后心臟的炎癥和纖維化[8]。在一些體外研究中，Ac-SDKP已經(jīng)被證明能夠抑制腎臟成纖維細胞的增生、阻止腎髓質(zhì)纖維化[9]和抑制心臟成纖維細胞增殖、膠原蛋白的產(chǎn)生[10]。但是Ac-SDKP對體外腎小管上皮細胞的作用的研究尚未見報道。

本實驗中予TGF-β1刺激后，大鼠腎小管上皮細胞發(fā)生形態(tài)改變，細胞由類圓形變成梭形，同時α-SMA的表達也上調(diào)，提示腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細胞。在正常的腎小管上皮細胞內(nèi)Tβ4呈弱陽性表達，α-SMA僅有微量的表達，TGF-β1刺激后，Tβ4和α-SMA的表達均顯著增加，證實在TGF-β1(5 ng/mL)時可誘導腎小管上皮細胞出現(xiàn)EMT；加入卡托普利與TGF-β1共同作用后，Tβ4和α-SMA的表達與TGF-β1刺激后誘導Tβ4和α-SMA的表達量相比變化不大，提示雖然卡托普利部分是通過抑制Ac-SDKP的降解而發(fā)揮抗腎臟纖維化的作用，但內(nèi)源性Ac-SDKP的濃度不足以達到抗纖維化的效應，通過加入外源性Ac-SDKP，Tβ4和α-SMA的表達下降，濃度為10 nmol/L時抑制作用最強，與TGF-β1刺激組相比均差異有統(tǒng)計學意義，與Hongmei Peng等[11]所報道的相符。Tβ4隨Ac-SDKP濃度的增加而下調(diào)，10 nmol/L時Tβ4降低最顯著，推測Ac-SDKP通過影響Tβ4的表達，進而影響Tβ4介導腎小管上皮細胞EMT，Ac-SDKP通過何種機制調(diào)節(jié)Tβ4的表達尚不能確定。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)Tβ4和α-SMA之間存在直線正相關(guān)關(guān)系，提示Ac-SDKP的發(fā)現(xiàn)可以為抗纖維化藥物的研究提供新的方向，可通過抑制Tβ4的表達，從而抑制EMT，也許是治療腎間質(zhì)纖維化的一個新途徑。