基于響應(yīng)面的余甘果脫澀工藝優(yōu)化

梁惠芬，曾鑫海，冼宇婷，陳慧霞，林梓琳，王潔如，張振霞，鄭玉忠

（韓山師范學(xué)院，廣東 潮州 521041）

余甘果（phyllanthusemblicaL.） 又名牛甘果、余甘子、油甘果、油柑等，為雙子葉植物綱、大戟科葉下珠屬植物[1,2]。余甘果喜光，主要分布在福建、臺灣、廣東、廣西、貴州、云南等熱帶、亞熱帶地區(qū)[1-3]。同時余甘果適應(yīng)性強，并且耐干旱[4]，根系發(fā)達，有利于保持水土，有利于維護生態(tài)環(huán)境的正常。對余甘果的資源保護、開發(fā)、研究有著重要的意義。余甘果具有抗衰老[5]、抗壞血酸[6]、抗腫瘤[7]、降血壓[8]、降血脂等功效，潤肺化痰，生津止渴，增進食欲，可治喉炎和乙肝肝炎[9]功效，能明顯治療和預(yù)防胃癌[1]。治療咽喉不適、煙酒過度、膽道蛔蟲絞痛等[4]，更是立竿見影。果肉含有豐富的維生素C[10]、E、B、Cu[11]等多種微量元素以及超氧化物歧化酶（SOD）[12,13]。其果果味先苦后甘，肉厚、纖維少、營養(yǎng)豐富、產(chǎn)量高、效益好等特點。果實中含有多酚，生物堿，黃酮等多種生物活性物質(zhì)[14-16]。

目前，國內(nèi)對然已有對余甘果的加工的研究報告，但是對其脫澀工藝的優(yōu)化研究鮮有報道。余甘果中含有多酚，生物堿，黃酮等多種生物活性物質(zhì)，其中多酚含量最高，而多酚中以單寧為主要成分[17]。單寧是果實中澀味的重要代表物，脫澀程度越高，果實中的單寧含量越低。因此，本實驗以新鮮余甘果為原料，采用分光光度法測定單寧提取率，并以單寧的提取率作為指標，利用響應(yīng)面法對余甘果脫澀工藝進行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為新鮮余甘果，2019 年7 月中旬采購于廣東省潮州市農(nóng)貿(mào)市場，置于4℃冰箱短期冷藏。

實驗試劑包括單寧酸、乙醇、丙三醇、鄰二氮菲、冰醋酸、乙二胺四乙酸二鈉、六合水三氯化鐵、無水乙酸鈉，均為分析純。

實驗儀器：超聲波清洗儀（S22H，致微廈門有限公司）、電子天平（BSA224S，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）、恒溫水浴鍋（XMTD203，金壇市科析儀器有限公司）、臺式高效冷凍離心機（H1850R，湖南湘怡實驗儀器開發(fā)有限公司）、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9140A 型，上海精宏實驗設(shè)備有限公司）、紫外可見分光光度計T6新世紀（北京普析通用儀器有限公司）、高速多功能打粉機（CS-700, 永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線繪制

精密稱取單寧酸5mg，置于25 mL 容量瓶中，用蒸餾水溶解定容，作為0.1mg/mL 單寧標準溶液，分 別 取0μL、400μL、 800μL、 1200μL、1600μL、2000μL 單寧標準溶液于6 個25 mL 棕色容量瓶中，加入5 mL 蒸餾水和125μL 的0.1 mol/L FeCl3溶液，靜置20min，再加入5 mL 鄰二氮菲緩沖溶液 [m（0.015mol/L 鄰二氮菲）∶m（NaAc 緩沖溶液）∶m（0.05mol/L EDTA） =10∶5∶1]定容，靜置10min，在510nm 處測定各濃度的吸光度。以吸光度為縱軸，單寧濃度為橫軸繪制標準曲線，得Y=0.2862X+0.0346，R2=0.9925。每次測定提取液獲得吸光度值帶入標準曲線方程，再換算成余甘果中單寧含量。

1.2.2 試樣制備

準確稱量40 g 余甘果，烘干至恒重再稱量，得出干重比。稱取5.0 g 鮮果打碎，以m（水） ∶m（甘油） =9∶1 作為提取溶劑，提取時間為30 min，提取功率為100 W，多次提取，至溶液顏色清澈，合并濾液，抽取部分檢測，通過鄰二氮菲分光光度法[18,19]測定單寧含量。加入0.1mol/L FeCl3溶液與樣品液反應(yīng)，再加入鄰二氮菲溶液反應(yīng)，在510nm 處用分光光度計對反應(yīng)后的溶液進行吸光度檢測，根據(jù)單寧標準曲線計算余甘果中總單寧含量。

2 單因素試驗

2.1 比較不同提取溶劑對單寧提取率的影響

將余甘果切半處理，以時間60 min、溫度為40℃、功率為100 W，料液比為1∶40（g/mL） 為提取條件，比較水、乙醇、水+甘油（4∶6）、乙醇+甘油（4∶6） 作為提取溶劑的提取效率。經(jīng)數(shù)據(jù)處理后，結(jié)果如圖1 所示。

五種提取溶劑提取率依次為：乙醇+甘油（13.91%）、水+甘油（11.83%）、乙醇（10.25%）、甘油（4.63%）、水（2.31%）。其中，乙醇+甘油的提取率最高，雖然比水+甘油的提取率高2.08%，但考慮環(huán)境和成本問題，選擇水+甘油作為單寧提取劑。通過分析數(shù)據(jù)，可得出，甘油的加入后，提取率明顯提高。

圖1 不同提取溶劑對單寧提取率的影響Fig.1 Effects of different extraction solvents on the yield of tannins.

2.2 水和甘油混合溶劑的配比對單寧提取率的影響

為優(yōu)選出水和甘油的最佳混合比例對單寧提取率的影響。準確稱取余甘果14 g，中間切半處理，以時間為60 min，溫度為40℃、功率為100 W 作為提取條件，考察甘油與水混合比例分別為：2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4 對單寧提取率的影響，進一步確定水和甘油的混合比例對單寧提取率的影響。結(jié)果如圖2 所示。分析數(shù)據(jù)后，確定m（甘油） ∶m（水） =4∶6 的單寧提取率最高。

圖2 不同混合比例對單寧提取率的影響Fig.2 Effects of different mixing ratios on the extraction yield of tannins.

2.3 料液比、溫度、時間對單寧提取率的影響

精確稱取14 g 新鮮余甘果，中間切半處理，提取溶劑為水+甘油，按下列提取條件提取，每次重復(fù)3 次試驗。

1） 料液比（g/mL） 分別為20∶1、40∶1、60∶1，時間為60 min，溫度為40℃、功率為100 W；

2） 提 取 時 間 分 別 為60min、100min、140 min，料液比1∶40，溫度為40℃、功率為100 W；

3） 提取溫度分別為20℃、40℃、60℃，料液比1∶40，時間為60℃、功率為100 W。

2.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)Box-Benhnken 試驗設(shè)計原理，以單因素試驗結(jié)果為參考，把單寧提取率（%） 作為響應(yīng)值，選取料液比（g/mL）、提取時間（min）、提取溫度（℃） 3 個影響因素為自變量，采用三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化以上因素，水平及因素編碼如表1 所示。

表1 響應(yīng)面水平及因素編碼Tab.1 Response surface level and factor coding.

3 結(jié)果與分析

3.1 三因素的試驗結(jié)果

3.1.1 提取溫度對單寧溶出率的影響

根據(jù)圖3 可知，單寧溶出率隨著提取溫度的增加而增大，60℃的提取溫度比40℃的提取溫度的單寧提取率略大。當(dāng)提取溫度為60℃時單寧提取率最高?？紤]單寧受熱易分解的特點，選擇提取溫度為20、40、60℃作為響應(yīng)面考察條件。

圖3 提取溫度對單寧溶出率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on tannin dissolution rate

3.1.2 提取時間對單寧溶出率的影響

根據(jù)圖4 可知，單寧溶出率隨著時間的增加先增大后減少。

圖4 提取時間對單寧溶出率的影響Fig.4 Effect of extraction time on tannin dissolution rate

當(dāng)提取時間達到100 min 是單寧提取率最高。再增加提取時間，單寧提取率略有下降趨勢。時間過短，單寧類物質(zhì)不能完全溶出，單寧提取率低下。時間過長，可能導(dǎo)致其他一些雜質(zhì)成分溶出，損耗人力物力，并造成單寧提取率下降。根據(jù)以上結(jié)果分析，綜合考慮，選擇提取時間為60、100、140 min 作為響應(yīng)面考察條件。3.1.3 料液比對單寧溶出率的影響

根據(jù)圖5 可知，單寧溶出率隨著料液比的變化先增大后減少。

圖5 料液比對單寧溶出率的影響Fig.5 Effect of ratio of feed to liquid on tannin dissolution rate

在料液比為1∶40（g/mL） 時，單寧提取率達到最大。如果料液比太小，則單寧溶出不夠充分；而料液比太，單寧溶出率反而降低，可能由于樣品中溶出某些雜質(zhì)導(dǎo)致的。除此之外，提取溶劑用量過大不僅增加生產(chǎn)成本，后期相應(yīng)的提取處理工作的難度也會增加，從而降低單寧的提取率。綜合實際分析，選擇料液比為1∶20、1∶40、1∶60（g/mL） 作為響應(yīng)面水平。

3.2 響應(yīng)面優(yōu)化余甘果中單寧的提取工藝

以單因素試驗結(jié)果作為參考依據(jù)，以單寧提取率作為響應(yīng)值，選取表2 中的三因素作為響應(yīng)面優(yōu)化因素，每次試驗均重復(fù)3 次。應(yīng)用Design Expert 8.0.6 軟件對響應(yīng)面試驗結(jié)果進行回歸擬合分析，可得出單寧得率=16.66-0.71×A-1.26×B+0.69×C-0.96×A×B+1.21×A×C+0.070×B×C-1.98×A2-0.99×B2+1.16×C2，公式中：A 為提取溫度（℃），B 為料液比（g/mL），C 為提取時間（min）。

3.2.1 回歸方差數(shù)據(jù)結(jié)果

通過相關(guān)系數(shù)與方差分析結(jié)果來檢測回歸方程的準確性和有效性，考察該數(shù)學(xué)模型是否可靠。由表3 可知P< 0.01，說明回歸模型達到顯著水平，失擬項P=0.1772>0.05，表現(xiàn)為“不顯著”，說明失擬項對于純誤差不顯著，表明該模型是合適的。變異系數(shù)CV (%) =7.05<10，說明試驗可重復(fù)性較好。相關(guān)系數(shù)R2=0.8652，大于0.8，可知擬合程度很好，表明響應(yīng)值單寧提取率實際值與預(yù)測值之間具有較好的擬合度，能較好地對響應(yīng)值進行分析。從表3 得出，料液比表現(xiàn)為對余甘果單寧提取率影響顯著，提取溫度的二次項表現(xiàn)為對余甘果單寧提取率影響極顯著，根據(jù)F 值的大小可得出各因素對余甘果單寧提取率影響的順序為：提取料液比（B） ＞溫度（A） ＞提取時間（C）。

表2 余甘果單寧提取中心組合試驗方案及結(jié)果Tab.2 Combination test scheme and results of tannin extraction center of acanthopanaxdfficinalis

表3 回歸方程分析表Tab.3 Regression equation analysis table

3.2.1 響應(yīng)面試驗因素相互影響分析

響應(yīng)面曲面坡度平滑時，表明響應(yīng)值受變量交互作用的影響小。反之，當(dāng)響應(yīng)面曲面坡度陡峭時，則表明響應(yīng)值受變量交互作用的影響大。根據(jù)回歸模型，以提取溫度、提取時間、料液比中的兩個因素固定為零水平，就可以得出另外兩個因素的交互作用。模型的響應(yīng)面如圖6～圖8 所示。A（提取溫度） 與B（料液比） 之間的響應(yīng)面曲面坡度最陡，表明提取溫度與料液比的交互作用對余甘果單寧提取率的影響顯著。其次，A（提取溫度） 與C（提取時間） 響應(yīng)面曲面坡度較陡峭。C（提取時間） 與B（料液比） 響應(yīng)面曲面坡度較平滑，說明該兩種因素的交互作用對余甘果單寧提取率的影響不顯著。

圖6 提取時間與料液比兩因素之間的交互作用Fig.6 Interaction between extraction time and feed ratio

圖7 料液比與提取溫度兩因素之間的交互作用Fig. 7 Interaction between material ratio and extraction temperature

圖8 提取時間與提取溫度兩因素之間的交互作用Fig. 8 Interaction between extraction time and extraction temperature

3.2.2 最佳提取工藝的驗證與確立

運用響應(yīng)面分析結(jié)果，可以得到余甘果單寧提取工藝的最佳提取工藝參數(shù)為：提取時間為56.64℃，料液比為1∶22.47（g/mL），提取時間為110 min，超聲波功率為100 W 的條件下單寧提取率的理論值為19.04%。為了驗證結(jié)果的真實性、可靠性與實際操作的方便性，將實際提取工藝參數(shù)調(diào)整為提取時間為57℃，料液比為1∶23（g/mL），提取時間為110 min，超聲波功率為100 W。在此提取條件下，進行3 次平行試驗，得出實際單寧提取率平均值為14.83%，與理論值19.04%幾乎吻合，誤差在5%以內(nèi)，表明該回歸模型真實可靠，具有實際應(yīng)用價值。

4 結(jié)論與分析

本試驗嘗試將單寧提取的方法引用到脫澀工藝上，并且也得到了不錯的效果。不僅能將澀味極重的單寧在簡便的脫澀工藝下快速的果實中提取出來。經(jīng)文件檢索后，此前一般以余甘果粉末為試驗原材料，無法保證果實完整性。本試驗采用余甘果鮮果進行單寧提取，能較大的保留著果實的完整性，減少其營養(yǎng)成分的流失。而在脫澀工藝上所運用到的甘油是良好的單寧提取溶劑并且具有價格低廉、安全無毒等特性。此前，國內(nèi)使用甘油作為單寧的提取溶劑提取單寧的文章鮮有所見。

通過單因素試驗，比較并確立最佳的提取溶劑為40%甘油。在確定最佳的提取溶劑基礎(chǔ)上，對提取溫度、提取時間、提取料液比進行試驗。試驗結(jié)果顯示提取溫度為60℃、提取時間為100 min、提取料液比為1∶40 的提取效率較高。根據(jù)以上實驗，運用Design Expet8.06 設(shè)計響應(yīng)面并分析比對提取時間、提取溫度、提取料液比3 個因素。經(jīng)過分析最終確定最佳的提取工藝為：40%的甘油為提取溶劑，提取時間為57℃，料液比為1∶23（g/mL），提取時間為110 min，得到余甘果單寧的提取率為14.83%，誤差在5%以內(nèi)。

單寧提取率稍微偏低，其一，由于采用不同月份余甘果果實進行重復(fù)性實驗，不同時期的果實成熟度不同，果實的軟硬程度對實驗存在一定的影響。其二，響應(yīng)面提供的理論結(jié)果與實驗結(jié)果本身存在一定的偏差。但總體偏差在誤差范圍內(nèi)，說明該回歸模型真實可靠，具有實際應(yīng)用價值，可作為單寧提取的一種優(yōu)化方法。