解毒護(hù)肝方對(duì)APAP肝損傷大鼠HSP70蛋白表達(dá)的影響

王 茜，張一昕，郭秋紅，郝 蕾，韓 雪，石 鋮，劉 宇

(河北中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，河北 石家莊 050200)

熱休克蛋白(HSPs)是在生物進(jìn)化過(guò)程中高度保守的多肽蛋白，而HSP70則是最保守、最重要的一族，在應(yīng)激反應(yīng)中最敏感[1]。對(duì)乙酰氨基酚(APAP)是目前國(guó)際上常用的肝炎、藥物性肝損傷模型用藥之一，其可降低肝細(xì)胞的抗氧化能力，從而使肝細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激性損傷[2]。研究顯示，小鼠在注射對(duì)乙酰氨基酚后24 h，肝臟轉(zhuǎn)氨酶活性達(dá)到峰值，HSP70的表達(dá)量也達(dá)到高峰，說(shuō)明HSP70的表達(dá)變化可作為評(píng)價(jià)肝損傷或修復(fù)過(guò)程中的重要指標(biāo)[3]。解毒護(hù)肝方為課題組治療肝損傷的臨床效用方，本實(shí)驗(yàn)主要研究其基于HSP70的保肝作用機(jī)制。

1 材料及試劑

1.1 動(dòng)物

Wistar大鼠，清潔級(jí)，雌雄各半，體重180～220 g，共70只，由北京維通利華生物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：11400700181914，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于恒溫恒濕環(huán)境中[溫度：(23±2) ℃，相對(duì)濕度：60% ～ 70%]，12 h明/暗交替，動(dòng)物自由進(jìn)食水[SYXK(冀)2016-0047]。

1.2 藥物

解毒護(hù)肝方由柴胡、醋香附、炒白芍、五味子、黃芪、白術(shù)、茵陳、黃芩、丹參、楮實(shí)子、生甘草組成。方中所用藥物均為免煎顆粒，由四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司提供。水飛薊賓膠囊(每粒含水飛薊賓35 mg，批號(hào)：750709172)，由天津天士力圣特制藥有限公司生產(chǎn)；對(duì)乙酰氨基酚片(每片含對(duì)乙酰氨基酚0.5 g，批號(hào)：016171002)由石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司提供。

1.3 試劑

天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測(cè)定試劑盒(AST，批號(hào)：AUZ3645)，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測(cè)定試劑盒(ALT，批號(hào)：AUZ3689)由貝克曼庫(kù)爾特實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司提供；總膽紅素試劑盒(TBIL，批號(hào)：A005)，直接膽紅素試劑盒(DBIL，批號(hào)：A006)由長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司；蘋(píng)果酸脫氫酶試劑盒(MDH，SEH673Ra，Cloud-Clone Corp)、谷氨酸脫氫酶試劑盒(GLDH，SEA293Ra，Cloud-Clone Corp)、精氨酸酶試劑盒(ARG，SEB120Ra，Cloud-Clone Corp)，HSP70抗體(rabbit，17T01602)購(gòu)自abcam公司，二抗(rabbit，K166-918D)以及DAB(K172410E)均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.4 主要儀器

Humalyzer2000半自動(dòng)生化儀(德國(guó)豪邁)；DP73數(shù)碼顯微鏡(Olympus)；HMIAS-2000顯微圖像分析系統(tǒng)(武漢同濟(jì)醫(yī)科大學(xué))；酶標(biāo)儀(BIO-TEK，ELx800)；低溫離心機(jī)(Sigma，德國(guó))；高速離心機(jī)(上海醫(yī)用分析儀器廠)等。

2 方法

2.1 分組給藥

將大鼠按體重隨機(jī)分為正常組，模型組，水飛薊賓陽(yáng)性對(duì)照組，解毒護(hù)肝方高、中、低劑量組，共六組，其中正常組10只，其余每組各12只，雌雄各半。各組大鼠的給藥劑量按照人與大鼠體表系數(shù)法進(jìn)行換算，解毒護(hù)肝方低劑量組為成人等效劑量，中劑量組為等效劑量的2倍，高劑量組為等效劑量的4倍，每天上午8∶00模型組和各給藥組給予對(duì)乙酰氨基酚1 000 mg·kg-1(用40 ℃生理鹽水配制)1次，正常組給予生理鹽水灌胃；每天下午2∶00正常組和模型組給予生理鹽水灌胃，各給藥組給予相應(yīng)藥液灌胃，給藥體積均為1 mL/100 g，連續(xù)灌胃30天。每7天稱重，自由進(jìn)食水。

2.2 樣本采集

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，3.5%水合氯醛(1 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，全血分別置于清潔試管中，分別以4 000 r/min，離心10 min，分離血清，分裝后置于-80 ℃冰箱保存，待檢相關(guān)肝功能指標(biāo)。取血后迅速取固定部位肝組織2份，一份置于4%多聚甲醛液中固定，待觀察肝組織HSP70蛋白表達(dá)情況。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 一般情況觀察 給藥后觀察大鼠精神狀態(tài)、行為活動(dòng)、飲食情況、二便情況、皮膚毛色。

2.3.2 血清指標(biāo)檢測(cè) 由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程有動(dòng)物死亡，每組選取8個(gè)樣本，利用半自動(dòng)生化分析儀按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清AST、ALT、DBIL、TBIL的含量；利用酶標(biāo)儀根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清MDH、GLDH、ARG的含量。

2.3.3 肝組織HSP70蛋白表達(dá)檢測(cè) 用免疫組化法進(jìn)行觀察，每組取6例，每例測(cè)5個(gè)視野。由計(jì)算機(jī)算出所測(cè)陽(yáng)性反應(yīng)物相對(duì)含量的灰度值及面積，由積分光密度值(IOD)和平均光密度值(MOD)來(lái)表示。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.5軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用方差分析，方差齊選用LSD，方差不齊選用Dunnett T3。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 解毒護(hù)肝方對(duì)肝損傷大鼠一般情況的影響

正常組大鼠毛發(fā)滑順，有光澤，精神狀態(tài)良好，行動(dòng)靈活，二便正常；對(duì)乙酰氨基酚大鼠體重減輕，毛發(fā)無(wú)光澤，精神狀態(tài)欠佳，喜臥。解毒護(hù)肝方和水飛薊賓對(duì)照組大鼠能不同程度地改善大鼠的毛發(fā)光澤度、精神狀態(tài)、體重情況以及行動(dòng)靈活性情況。

3.2 解毒護(hù)肝方對(duì)藥物性肝損傷大鼠肝功能指標(biāo)的影響

給予大鼠對(duì)乙酰氨基酚灌胃30天后，ALT、AST、DBIL水平顯著升高(P<0.01)；水飛薊賓組和中、低劑量組能顯著降低肝損傷大鼠的ALT、AST活性(P<0.01，P<0.05)，低劑量組能顯著降低肝損傷大鼠的DBIL含量(P<0.05)；解毒護(hù)肝方各劑量組之間中劑量組對(duì)ALT、AST活性的影響較高劑量組明顯(P<0.05)。但各劑量組之間對(duì)總膽紅素(TBIL)含量的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

組別ALT(U/L)AST(U/L)DBIL(μM)TBIL(μM)正常組72.81±9.83187.67±30.251.56±0.122.58±0.34模型組97.51±18.79△△236.49±41.32△△2.42±0.34△△3.19±0.81水飛薊賓組80.36±14.07▲190.46±29.98▲2.12±0.38△2.70±0.74高劑量組91.64±15.34△□□200.05±21.00□2.00±0.512.85±0.79中劑量組69.33±10.57▲▲159.27±24.76▲▲2.05±0.712.92±0.88低劑量組81.18±20.71▲198.32±54.37▲□1.80±0.45▲2.51±0.39

注：與正常組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與中劑量組比較，□P<0.05，□□P<0.01。

3.3 解毒護(hù)肝方對(duì)藥物性肝損傷大鼠血清生物標(biāo)志物的影響

大鼠給予對(duì)乙酰氨基酚藥液30天后，血清PON1、ARG、GLDH、MDH、PNP的含量均顯著升高(P<0.05，P<0.01)，高劑量組能顯著降低肝損傷大鼠血清PON1、MDH含量(P<0.05)，而對(duì)血清ARG、GLDH含量有降低趨勢(shì)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。中劑量組均能降低肝損傷大鼠血清PON1、ARG、GLDH、MDH、PNP含量，其中對(duì)于肝損傷大鼠血清ARG、MDH的含量降低最為明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。低劑量組僅對(duì)血清PON1、MDH、PNP有降低趨勢(shì)(P>0.05)，而對(duì)其他指標(biāo)無(wú)影響。見(jiàn)表2。

組別ARGGLDHMDH正常組63.53±14.6116.21±1.7513.39±2.97模型組79.69±11.75△20.62±3.55△20.31±2.66△△水飛薊賓組67.16±11.1119.50±3.5921.22±4.78△△高劑量組66.33±12.1817.90±3.3516.26±1.45▲□□中劑量組62.49±14.16△▲17.64±4.4416.81±1.57△▲□□低劑量組78.08±15.6320.65±3.16△18.11±1.72△△□

注：與正常組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與水飛薊賓組比較，□P<0.05，□□P<0.01。

3.4 解毒護(hù)肝方對(duì)藥物性肝損傷大鼠肝臟HSP70蛋白表達(dá)的影響

大鼠給予對(duì)乙酰氨基酚藥液30天后，肝組織HSP70蛋白表達(dá)的IOD和MOD值顯著升高(P<0.05，P<0.01)；各給藥組均能顯著降低肝損傷大鼠的IOD和MOD值(P<0.01)；中、低劑量組HSP70蛋白表達(dá)較水飛薊賓對(duì)照組明顯降低(P<0.05，P<0.01)；各劑量組之間，以高、中、低劑量組對(duì)肝損傷大鼠HSP70蛋白表達(dá)的修復(fù)作用有一定的量效關(guān)系，以高、中劑量組效果較好(P<0.01)。見(jiàn)表3，圖1、圖2、圖3、圖4、圖5、圖6。

組別 積分光密度(IOD) 平均光密度(MOD)正常組38.99±13.680.085 4±0.0124模型組375.68±28.78△△0.198 5±0.0281△△水飛薊賓組264.69±41.85△△▲▲0.109 9±0.0158▲▲高劑量組247.20±30.63△△▲▲0.084 0±0.0219▲▲中劑量組220.85±17.16△△▲▲□0.127 2±0.0223△△▲▲※※低劑量組339.11±26.41△△▲□□※※●●0.1599±0.0279△△▲▲□□※※●●

注：與正常組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與水飛薊賓組比較，□P<0.05，□□P<0.01；與高劑量比較，※P<0.05，※※P<0.01；與中劑量組比較，●P<0.05，●●P<0.01。

圖1 各組大鼠肝組織HSP70蛋白表達(dá)情況(組化，×20)

4 討論

藥物性肝損傷由于其特殊性若能早期診斷，早期停藥治療則能在很大程度上提高患者的生活質(zhì)量。臨床常用血清轉(zhuǎn)氨酶和膽紅素的升高作為肝損傷的主要評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，但這些指標(biāo)主要用于肝損傷發(fā)生后的診斷檢測(cè)。因此，尋找靈敏度高、特異性好的潛在生物標(biāo)志物是需要亟待解決的問(wèn)題。

近年來(lái)許多學(xué)者均致力于發(fā)現(xiàn)能早期診斷，且具有良好穩(wěn)定性的肝損傷生物標(biāo)志物，認(rèn)為存在于肝臟的一種線粒體酶GLDH，在人體內(nèi)水平較為穩(wěn)定，其靈敏性高于ALT[4]；而存在于肝臟一種催化反應(yīng)酶ARG，則在診斷膽管損傷方面敏感度最高[5]。MDH為三羧酸循環(huán)中參與草酰乙酸與蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶，若該循環(huán)被破壞，則肝細(xì)胞中的MDH迅速釋放進(jìn)入血清，而此時(shí)ALT并未發(fā)生變化[6]。朱平生團(tuán)隊(duì)通過(guò)用四氯化碳、對(duì)乙酰氨基酚、酒精復(fù)制不同類型的肝損傷模型，發(fā)現(xiàn)血清GLDH，ARG，嘌呤核苷酸磷酸化酶(PNP)，α-谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(α-GST)聯(lián)合評(píng)價(jià)，對(duì)于及早發(fā)現(xiàn)肝損傷靈敏性更強(qiáng)[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中ALT、AST、DBIL、MDH、GLDH、ARG含量顯著升高。解毒護(hù)肝方各劑量組能夠降低模型大鼠血清中ALT、AST、TBIL、DBIL、MDH、GLDH、ARG含量，提示解毒護(hù)肝方對(duì)APAP誘導(dǎo)的藥物性肝損傷具有良好的保護(hù)作用。

HSP70 具有分子伴侶的作用，在蛋白質(zhì)發(fā)生構(gòu)象異常變化時(shí)，可避免其內(nèi)部非疏水性氨基酸與一些肽、核酸分子或大分子發(fā)生不良的相互作用[8-9]。當(dāng)肝臟受到藥物刺激，發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，可能會(huì)刺激肝臟內(nèi)部的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，HSP70通過(guò)不斷的和蛋白質(zhì)結(jié)合或釋放，修復(fù)損傷的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而促進(jìn)肝組織的修復(fù)發(fā)揮保肝作用[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)乙酰氨基酚大鼠HSP70蛋白表達(dá)升高，而解毒護(hù)肝方各劑量組均能不同程度的降低模型組大鼠的HSP70表達(dá)。綜上所述，解毒護(hù)肝方有較好的護(hù)肝作用，不僅能降低轉(zhuǎn)氨酶和膽紅素等傳統(tǒng)肝功能指標(biāo)的水平，還能降低早期標(biāo)志物的水平，因此能起到一定的防治作用，其作用機(jī)理通過(guò)降低HSP70蛋白表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。但藥物所致的肝損傷是否影響了肝臟內(nèi)部某蛋白構(gòu)象的變化以及解毒護(hù)肝方是否通過(guò)調(diào)節(jié)HSP70蛋白表達(dá)修復(fù)蛋白構(gòu)象發(fā)揮保肝作用，還需進(jìn)行深入研究。