激光剝蝕-電感耦合等離子體質(zhì)譜分析缺鋅脅迫玉米根尖微量元素空間分布

張金堯，宋書會(huì)，郭 偉，徐芳森，汪 洪*

[1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物營(yíng)養(yǎng)與肥料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全肥料源性因子風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室 (北京)，北京 100081；2 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，湖北武漢 430070]

鋅 (Zn) 是植物生長(zhǎng)發(fā)育的必需營(yíng)養(yǎng)元素[1]，缺鋅會(huì)導(dǎo)致植株節(jié)間縮短、葉綠素合成受阻、葉片脈間失綠或白化、發(fā)育推遲、籽粒瘦小等，進(jìn)而造成減產(chǎn)[2-3]。營(yíng)養(yǎng)元素在植物根系不同組織、細(xì)胞及亞細(xì)胞水平上分布不同[4]，這種空間信息對(duì)于揭示植物體內(nèi)礦質(zhì)元素穩(wěn)態(tài)平衡與吸收轉(zhuǎn)運(yùn)規(guī)律等具有重要意義。

近年來(lái)，應(yīng)用能量色散X射線光譜和質(zhì)子激發(fā)X熒光光譜等技術(shù)開展超積累植物體內(nèi)重金屬元素積累成像研究[5-6]。激光剝蝕-電感耦合等離子體質(zhì)譜法 (laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry，LA-ICP-MS) 是將激光剝蝕進(jìn)樣系統(tǒng)與電感耦合等離子體質(zhì)譜儀聯(lián)用，通過激光剝蝕固體樣品生成氣溶膠后直接進(jìn)入ICP-MS中進(jìn)行元素含量測(cè)試，通過成像軟件實(shí)現(xiàn)固體樣品元素定位分布[7-8]。LA-ICP-MS因其易組裝、測(cè)定元素范圍廣 (涵蓋周期表中大部分元素)、所需樣品少 (只需幾微克)、空間分辨率高 (最小分辨率達(dá)2～5 μm)、靈敏度好等優(yōu)點(diǎn)[7,9]，成為植物樣品中痕量元素分析的重要手段。利用LA-ICP-MS對(duì)玉米根系橫截面元素分布研究表明，汞離子不能橫跨根系內(nèi)胚層障礙[10]。對(duì)兩個(gè)甘藍(lán)型油菜栽培品種根系與根際土壤磷 (P) 分布成像分析表明，土壤中P沿根軸向分布并于根尖擴(kuò)散，且兩個(gè)油菜品種對(duì)P的吸收效率不同[11]。對(duì)小麥籽粒中錳(Mn)、銅(Cu)、Zn和P的空間分布分析結(jié)果顯示小麥籽粒中Mn、Cu、Zn和P在籽粒不同部位的含量分布差異很大。Cu、Zn和P含量以糊粉層最高，胚乳最低，胚居中；Mn在胚中較多，胚乳中分布較低，糊粉層居中。籽粒不同部位元素的含量變化存在明顯的同步性，說(shuō)明不同元素在向籽粒不同部位運(yùn)輸和積累過程中存在密切相關(guān)性[12]。Saatz等[13]利用LA-ICP-MS和飛行時(shí)間二次離子質(zhì)譜 (ToF-SIMS)分析了稀土元素釓 (Gd) 和釔 (Y) 脅迫下玉米根系橫向薄層切片Gd和Y的細(xì)胞水平分布信息，發(fā)現(xiàn)在玉米根系表皮中具有高濃度Gd和Y斑點(diǎn)，而在皮層以內(nèi)Gd和Y含量較低，相關(guān)稀土元素可能束縛于根表鐵膜。

本研究通過營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)玉米植株，利用LA-ICPMS技術(shù)，研究缺Zn脅迫下玉米根尖Fe、Mn、Cu、Zn元素的分布定位，以期從組織水平揭示作物中Zn的轉(zhuǎn)運(yùn)富集規(guī)律及缺Zn對(duì)微量金屬元素吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，為缺Zn影響玉米植株生長(zhǎng)與生理代謝的機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植株材料培養(yǎng)

以‘鄭單958’玉米作為試驗(yàn)品種，取飽滿一致的玉米種子經(jīng)10% H2O2浸泡消毒15 min，超純水洗3遍，浸泡24 h后，轉(zhuǎn)移到鋪有濕紗布的培養(yǎng)皿中，上蓋一層濕紗布，25℃黑暗中催芽1天。選擇發(fā)芽一致的種子放入洗凈的石英砂中，培養(yǎng)箱25℃育苗。一周后 (兩葉一心)，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗，去掉胚乳，移栽到500 mL玻璃培養(yǎng)管中，每管1株，玻璃培養(yǎng)管直徑為5 cm，高20 cm，外用黑色布包裹避光，超純水 (超純水機(jī)，北京優(yōu)普時(shí)代科技有限公司) 培養(yǎng)一天，然后進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)液直接培養(yǎng)。幼苗培養(yǎng)在光照培養(yǎng)箱 (PRX-350D，寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠) 中進(jìn)行，控制條件為光照時(shí)間12 h，光照強(qiáng)度18000 lx，白天溫度25℃、夜間20℃，相對(duì)濕度70%。

基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)液配方 (mol/L) 為：Ca(NO3)22.0 ×10-3；K2SO47.5 × 10-4；MgSO46.5 × 10-4；KH2PO42.5 ×10-4；EDTA-Fe (Ⅱ) 1.0 × 10-4；H3BO31.0 × 10-6；CuSO41.0 × 10-7；MnSO41.0 × 10-6；(NH4)6Mo7O24·4H2O 5.0 × 10-9。設(shè)置缺鋅和正常供鋅 (1 μmol/L) 兩個(gè)處理。鋅元素以ZnSO4形式供給，每個(gè)處理3次重復(fù)。營(yíng)養(yǎng)液pH用NaOH或HCl調(diào)到6.0，每隔2天更換1次營(yíng)養(yǎng)液。

培養(yǎng)15 d后采集根系，超純水浸泡清洗3遍，切取距離根頂端0.3 cm長(zhǎng)的根段，貼于載玻片上，105℃殺青后烘干，固定于激光剝蝕系統(tǒng) (LA) UP213(213nm Nd：YAG固體激光器，美國(guó)New Wave公司) 樣品臺(tái)上，進(jìn)行LA-ICP-MS測(cè)定。

1.2 根系標(biāo)準(zhǔn)樣品制備

在6個(gè)不同鋅濃度 (0、0.1、1、10、50、100 μmol/L) 營(yíng)養(yǎng)液直接培養(yǎng)玉米植株15天，采集植株根系，超純水浸泡清洗3遍，電熱鼓風(fēng)干燥箱(BGZ140，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司) 烘干，研磨儀(MM400，德國(guó)Retsch公司) 研磨成粉，混合均勻。取研磨后自制的根系粉末樣品及柑橘葉成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)粉末各0.1 g (精確至0.0001 g)，加入6 mL優(yōu)級(jí)純濃HNO3和2 mL H2O2，利用微波消解儀消煮，程序升溫為120℃ 5 min，160℃ 5 min，180℃ 15 min，消煮結(jié)束后利用超純水定容至50 mL，利用電感耦合等離子體質(zhì)譜 (ICP-MS) (Agilent7700x，Agilent，USA) 測(cè)定待測(cè)液中 Zn、Fe、Mn、Cu 含量，得到自制根系標(biāo)樣中元素含量。柑橘葉成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) (GSB-1，鋼研納克檢測(cè)技術(shù)有限公司)測(cè)定結(jié)果控制檢測(cè)過程準(zhǔn)確度。利用LA-ICP-MS測(cè)定自制根系標(biāo)樣信號(hào)強(qiáng)度與標(biāo)樣中元素實(shí)際含量進(jìn)行相關(guān)分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取50 mg研磨后的根系粉末樣品，利用壓片機(jī)(769YP-15A&24B，天津市科器高新技術(shù)公司) 壓成直徑為5 mm的薄圓片，置于激光剝蝕樣品池內(nèi)，作為自制的根系標(biāo)準(zhǔn)樣品，將試驗(yàn)玉米根尖樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品同時(shí)置于激光剝蝕池內(nèi)，在同一試驗(yàn)條件下利用LA-ICP-MS測(cè)定。利用上述標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)玉米根尖樣品中元素含量進(jìn)行定量分析。

1.3 LA-ICP-MS 儀器測(cè)定條件

LA系統(tǒng)采用Nd∶YAG激光器 (波長(zhǎng)213 nm)，測(cè)定時(shí)聚焦激光束按行掃描根系樣品及標(biāo)樣壓片，灼燒后的樣品物質(zhì)由載氣Ar送入ICP，檢測(cè)66Zn、56Fe、63Cu、55Mn及13C的離子強(qiáng)度。LA-ICP-MS檢測(cè)參數(shù)見表1。

1.4 數(shù)據(jù)及圖像軟件分析

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析，采用Sufer10.0進(jìn)行元素分布圖像制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 缺鋅脅迫下玉米根系微量金屬元素含量

缺鋅脅迫下玉米根系鋅元素含量顯著降低，僅為正常植株的27.78%；缺鋅根系中Mn和Cu含量升高，分別為加鋅處理的4.19倍和1.94倍，F(xiàn)e含量差異不顯著 (表2)。

2.2 內(nèi)標(biāo)元素穩(wěn)定性檢測(cè)

為了補(bǔ)償激光剝蝕進(jìn)樣量不均勻?qū)π盘?hào)強(qiáng)度的影響，選擇13C作為內(nèi)標(biāo)元素，對(duì)各元素強(qiáng)度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。本試驗(yàn)對(duì)6個(gè)自制標(biāo)準(zhǔn)壓片玉米根系樣品和柑橘葉成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品13C進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，其信號(hào)波動(dòng)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值均低于10%，信號(hào)較為穩(wěn)定 (圖1)。

表1 LA-ICP-MS檢測(cè)參數(shù)Table 1 Optimized experimental parameters of LA-ICP-MS

表2 缺鋅脅迫下根系微量金屬元素含量 (n = 6)Table 2 Trace element content in the root under Zn deficiency

圖1 根系自制樣品壓片標(biāo)樣及柑橘葉內(nèi)標(biāo)13C信號(hào)穩(wěn)定性Fig. 1 Signal stability of 13C in self-made root standard samples and citrus leaves[注（Note）：圖注中標(biāo)樣1至標(biāo)樣6分別代表經(jīng)6個(gè)不同鋅濃度(0、0.1、1、10、50、100 μmol/L) 營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)獲得的根系自制樣品 The standard samples from 1 to 6 in the legend represent the selfmade samples of maize roots cultivated with of 6 different zinc concentrations solutions in 0, 0.1, 1, 10, 50 and 100 μmol/L,respectively.]

2.3 自制標(biāo)樣標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)

將自制玉米根系壓片樣品進(jìn)行LA-ICP-MS測(cè)定，檢測(cè)信號(hào)值CPS (66Zn/13C)與樣品中實(shí)際Zn含量間呈良好的線性關(guān)系 (y = 0.018x + 0.0335，R2=0.9995)，從而得到LA-ICP-MS測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線 (圖2)。按此標(biāo)準(zhǔn)曲線，LA-ICP-MS測(cè)定柑橘葉GSB-11中Zn含量為17.80 mg/kg，與該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)參考值(18 ± 2) mg/kg 相吻合。

2.4 缺 Zn 脅迫下玉米根系元素空間分布

圖2 自制根系壓片標(biāo)準(zhǔn)樣品LA-ICP-MS測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 2 Standard curve of root samples measured using LA-ICP-MS

用LA-ICP-MS系統(tǒng)定量成像玉米根尖Zn的空間分布。玉米根尖頂端Zn含量分布較多，由表皮向內(nèi)鋅含量逐漸增加，最高處在50 mg/kg以上 (圖3A-a)。相對(duì)于正常鋅培養(yǎng)條件，缺Zn處理根尖Zn含量降低，根尖頂端Zn分布明顯減少，普遍低于40 mg/kg(圖3B-a)。利用LA-ICP-MS檢測(cè)CPS信號(hào)強(qiáng)度值對(duì)Fe、Mn、Cu元素在根尖中的分布進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在根尖前端信號(hào)強(qiáng)度較高，由表向內(nèi)逐漸增加，與Zn分布類似；缺鋅處理下，根尖中Fe、Mn、Cu信號(hào)強(qiáng)度均有不同程度增加 (圖3-A、B)。

3 討論

LA-ICP-MS定量測(cè)定植物組織中的元素分布關(guān)鍵在于標(biāo)準(zhǔn)品的制備，在動(dòng)物組織切片相關(guān)研究中，常將動(dòng)物組織勻漿后加入標(biāo)準(zhǔn)液混勻作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，研究動(dòng)物組織切片元素空間分布[7,9]。向植物干樣粉末中外源添加不同梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)液，振蕩、烘干后壓片，制作標(biāo)準(zhǔn)樣品，進(jìn)行LA-ICP-MS測(cè)定[7-8]，但此類標(biāo)樣目標(biāo)元素濃度均勻性較差，內(nèi)標(biāo)元素穩(wěn)定性低，影響掃描結(jié)果。Huelga-Suarez等[14]利用標(biāo)準(zhǔn)溶液浸泡濾紙，以此作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，但此方法中標(biāo)樣和實(shí)際待測(cè)樣品基體性質(zhì)不同，可能對(duì)測(cè)定產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)利用不同濃度含鋅營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)玉米植株，獲得根系樣品后，進(jìn)行烘干、粉碎、混勻、壓片，將其分為兩份，一份利用硝酸消煮，ICP-MS測(cè)定，獲得樣品中實(shí)際Zn元素含量，制作適于LACP-MS測(cè)定的玉米根系標(biāo)準(zhǔn)樣品。將此標(biāo)準(zhǔn)樣品與待測(cè)根尖樣品放入LA樣品池中，13C作為內(nèi)標(biāo)元素，開展缺鋅脅迫下玉米根尖中鋅元素分布特征的定量成像研究，發(fā)現(xiàn)正常施鋅玉米根尖中鋅、鐵、錳、銅分布呈現(xiàn)出由表皮向中柱增加的趨勢(shì)。

圖3 正常 (A) 及缺鋅脅迫下 (B) 根尖微量金屬元素分布Fig. 3 Distribution of microelements in root tips under normal (A) and zinc deficiency (B) conditions[注（Note）：a—Zn含量分布Zn content distribution；b—Fe CPS比分布Fe CPS ratio distribution；c—Mn CPS比分布Mn CPS ratio distribution；d—Cu CPS比分布Cu CPS ratio distribution；左側(cè)箭頭方向代表根尖頂端 The direction of the left arrow represents the apex of the root tip.]

研究生物樣品中元素分布技術(shù)還有質(zhì)子激發(fā)X射線分析 (PIXE)[15]、同步輻射X射線熒光 (SRXRF)[16]、二次電離質(zhì)譜 (SIMS)[17]、基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜 (MALDI-MS)[18]等，相比而言，LA-ICPMS通過激光剝蝕對(duì)固體樣品表面原位采樣，提供直觀的固體表面空間分辨信息，具有多元素測(cè)定、高靈敏度、寬數(shù)量級(jí)、樣品制備需樣量少、易操作、定量分析簡(jiǎn)潔以及可進(jìn)行同位素分析等優(yōu)點(diǎn)[19]。但是LA-ICP-MS技術(shù)目前在植物學(xué)研究上還存在一些不足：缺少與植物樣品基質(zhì)相近的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；分析過程中存在著激光與樣品相互作用、樣品氣溶膠傳輸及氣溶膠顆粒在ICP中離解時(shí)產(chǎn)生的分餾效應(yīng)影響元素定量分析；雙電荷和多原子離子產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)會(huì)干擾某些元素的測(cè)定，影響定量測(cè)定結(jié)果[19]。更加精細(xì)的樣品室的設(shè)計(jì)、進(jìn)樣方式的改進(jìn)、飛秒級(jí)激光的應(yīng)用，可以提升在微米級(jí)更小尺度上植物元素定量分布成像精度與檢出限。

本文利用LA-ICP-MS成像結(jié)果表明，缺鋅脅迫下玉米根尖鋅含量顯著降低，鐵、錳、銅不同程度積累。缺Zn脅迫下，植物Fe轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因IRT1、ZIP4表達(dá)上調(diào)，擬南芥等植物對(duì)Fe的吸收運(yùn)輸增多[20-21]。植物體內(nèi)金屬忍耐家族蛋白 (MTP蛋白)和自然抗性相關(guān)巨噬家族蛋白 (NRAMP蛋白) 可同時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)Zn和Mn，缺Zn時(shí)上述兩類蛋白上調(diào)表達(dá)，可能是缺鋅導(dǎo)致根系Mn含量增加的原因[22]。煙酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (NA蛋白) 是Zn、Cu及Fe的胞間和長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)鞍?，多?shù)研究者認(rèn)為缺Zn時(shí)NA蛋白的表達(dá)上調(diào)，可能會(huì)促進(jìn)Cu在缺鋅植物體內(nèi)積累[23-24]。

4 結(jié)論

本研究利用不同濃度加鋅營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)玉米植株獲得了可適用于LA-ICP-MS定量分析的自制根系標(biāo)準(zhǔn)樣品，以13C作為內(nèi)標(biāo)元素進(jìn)行缺鋅脅迫下玉米根尖鋅元素分布特征的定量成像及鐵、錳、銅微量金屬元素的定性成像研究。成像結(jié)果顯示，正常施鋅玉米根尖中鋅、鐵、錳、銅分布呈現(xiàn)出由表皮向中柱增加的趨勢(shì)；缺鋅脅迫下根尖鋅含量顯著降低，鐵、錳、銅不同程度積累。本研究表明，LA-ICPMS可在植物營(yíng)養(yǎng)機(jī)理研究中發(fā)揮重要作用。