云南蠶區(qū)58個家蠶品種對家蠶質(zhì)型多角體病毒的抗性調(diào)查及聚類分析

邵榆嵐，張一川，唐芬芬，張永紅，朱 峰，白興榮

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661101)

【研究意義】家蠶質(zhì)型多角體病毒(BombyxmoriCytoplasmic Polyhedrosis Virus，BmCPV)，基因組由10個dsRNA片段組成，屬呼腸孤病毒科(Reoviridae)[1-2]，能形成光學(xué)顯微鏡下可見的病毒多角體，其形態(tài)多樣，常見四角形、三角形等，而且大小不一。由該病毒感染引起的家蠶質(zhì)型多角體病毒病成為云南蠶區(qū)重要家蠶病害之一，典型病癥是發(fā)病后期解剖病蠶能看見中腸后端乳白色褶皺，在生產(chǎn)上常見于5齡后期發(fā)病，給蠶農(nóng)造成嚴重損失[3]。本研究利用云南蠶區(qū)保存的豐富家蠶品種資源，開展家蠶品種對家蠶質(zhì)型多角體病毒的抗性調(diào)查和分析，為抗病育種、抗病關(guān)鍵基因的研究提供參考?！厩叭搜芯窟M展】黃君霆[4]，張遠能[5]，徐安英[6]等研究證明，家蠶不同品種對家蠶質(zhì)型多角體病毒的抗性差異較大。渡部仁[7]認為家蠶對BmCPV的抵抗性主要是侵染抵抗性，在不同品種間存在不同基因控制，一般品種受微效多基因控制，高抗品種受一對顯性基因控制。段家龍[8]研究表明，家蠶個體、化性、性別、蛾區(qū)間對BmCPV抗性均存在差異。家蠶不同發(fā)育時期對BmCPV的感染抵抗性不同，起蠶感染率高，且受到桑葉品種的影響[9-10]。隨著分子水平的深入研究，采用高通量技術(shù)比較正常家蠶和BmCPV患病家蠶、抗BmCPV家蠶品種和感BmCPV家蠶品種，獲得許多差異表達基因，在蛋白質(zhì)代謝、能量代謝等基因功能方面作用凸顯[11-13]，感染機制的深入研究為傳統(tǒng)抗病育種提供理論支撐。家蠶品種抗病性鑒定是抗病育種、抗病基因發(fā)掘的重要基礎(chǔ)，小麥[14]等物種上均采用此策略。針對家蠶質(zhì)型多角體病毒病發(fā)病時外觀特征不明顯，潛伏期較長，容易二次感染等特點，在進行該病鑒定時常常采用早期診斷的方法。家蠶質(zhì)型多角體病毒病的早期診斷有免疫對流電泳檢測、多角體鏡檢、體重變化測量等方法[15]。吳萍等[16]采用熒光定量PCR的方法，在接種后早期區(qū)別不同品種的抗性水平。陳克平[17]，徐安英[6]等家蠶品種對核型多角體病毒和質(zhì)型多角體病毒的抗性水平分布，均采用多個濃度的半數(shù)致死濃度LC50值和半數(shù)感染濃度IC50值進行研究。【本研究切入點】首次采用聚類分析對家蠶品種抗病水平進行分類，聚類分析可以在沒有先驗分類的情況下通過觀察數(shù)據(jù)進行分類，它使組內(nèi)的數(shù)據(jù)對象具有最高的相似度，而組間具有較大的差異性，在科學(xué)研究和生產(chǎn)實踐中應(yīng)用廣泛[18]。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過不同品種接種BmCPV后的感染率，采用方差分析、多重比較獲得不同品種對BmCPV的抗性差異，通過聚類分析把云南蠶區(qū)家蠶品種抗BmCPV能力劃分不同水平，為家蠶品種和家蠶質(zhì)型多角體病毒相關(guān)的實驗提供重要參考，篩選高抗品種為抗病育種、抗病關(guān)鍵基因的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試品種由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所家蠶資源保存研究室提供，全部均為二化性品種，其中日系品種27個，中系品種31個。

1.2 試驗方法

1.2.1 家蠶質(zhì)型多角體病毒懸液的準備 家蠶普種菁松×皓月常規(guī)飼養(yǎng)，4齡起蠶接種病毒，5齡后期出現(xiàn)空頭狀，蠶座出現(xiàn)白色糞便時收集發(fā)病蠶，解剖收集白色褶皺的中腸，滅菌水洗干凈，研磨，用3層紗布過濾，收集濾液。濾液用滅菌水稀釋，進行差速離心。高速6000 r/min，離心20 min，取出沉淀中的白色部分，其余沉淀加滅菌水混合振蕩后再用高速離心，反復(fù)高速離心取出白色沉淀部分收集，之后采用高速5000 r/min(離心10 min)和低速500 r/min(離心3 min)交叉離心。除去白色沉淀外層灰色部分和內(nèi)部細小雜質(zhì)，收集沉淀，加入少量滅菌水懸浮，得到高純高濃度的純白色病毒多角體液并于4℃保存。使用當天采用血球計數(shù)板測定病毒液濃度，制備成所需濃度的BmCPV病毒多角體液。

1.2.2 家蠶品種的BmCPV接種 供試家蠶品種于春季正常飼養(yǎng)至3齡起，接種當天采摘適齡新鮮桑葉，清洗干凈晾干后選擇無皺葉，切成4 cm×6 cm大小一致的方形葉，放入濃度1×107個/mL的BmCPV病毒多角體液，葉表面水分蒸發(fā)后，等量桑葉給3齡起蠶經(jīng)口接種。每個品種每個重復(fù)飼養(yǎng)30頭健康蠶于帶蓋塑料盒中，每盒2片病毒桑葉，設(shè)3個重復(fù)。接種期防止桑葉凋萎，保證食盡桑葉，第2頓開始更換為普通新鮮桑葉正常飼養(yǎng)。

為防止二次感染，實驗期間，上午喂蠶前統(tǒng)計蠶數(shù)并去除殘葉蠶沙，更換墊紙和塑料盒，下午喂蠶前用新鮮生石灰粉消毒蠶體蠶座。每天喂蠶結(jié)束后用含1 %有效氯的漂白粉水消毒蠶室地面。

1.2.3 家蠶品種接種BmCPV后的感染率調(diào)查 接種后第7天，取每條蠶的中腸，顯微鏡檢測是否有BmCPV多角體，記錄感染數(shù)，并按下面公示計算感染率。為確保鏡檢準確率，區(qū)別多角體和脂肪球，鏡檢時每個樣品3個重復(fù)，其中一個樣品用0.5 %蘇丹Ⅲ染色液染色，多角體能夠被染成橘紅色，脂肪球不被染色，確定該蠶是否含有BmCPV多角體。

感染率(%)=感染數(shù)/供試蠶頭數(shù)×100

1.3 統(tǒng)計分析

實驗得到的感染數(shù)采用EXCEL進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計；感染率的方差分析、多重比較等采用SAS 9.0進行數(shù)據(jù)分析；K-均值聚類、系統(tǒng)聚類采用SPSS 20.0進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 58個品種接種BmCPV后的抗性差異

依據(jù)家蠶質(zhì)型多角體病毒的一般發(fā)病規(guī)律，接種后第7天是病勢中期，此時調(diào)查感染數(shù)可減少二次感染的干擾。從表1可知，各品種所有數(shù)據(jù)表達為均值±標準差，95 %置信區(qū)間。對不同品種的感染率進行方差分析，由表2可知，其P值小于0.01顯著水平，說明有99 %的把握肯定不同品種的感染率差異顯著，其中79.34 %的品種符合。進而采用最小顯著性差異法(LSD)檢驗不同品種的感染率在各顯著水平的平均差異。感染率在0.05顯著水平，分為20個差異組，在0.01顯著水平，分為17個差異組，不同顯著水平均為品種14的感染率最低，品種10與品種14差異不顯著。

表1 58個品種接種BmCPV后的感染率

表2 感染率的方差分析(一)

表3 感染率的方差分析(二)

表4 58個品種感染率的多重比較

2.2 58個品種抗BmCPV能力的聚類分析

采用聚類分析中K-均值聚類和系統(tǒng)聚類，進一步對58個品種進行抗性分類。K-均值聚類自定義將聚類數(shù)分為4類，經(jīng)過10次迭代，最終聚類中心和聚類成員如表5所示，第2類的感染率最低，為55.10 %，品種10和品種14屬于此類；第1類感染率最高，為96.22 %，有23個品種；第3類有17個品種，感染率均值為73.70 %；第4類感染率較高，為90.09 %，包括16個品種。由此可知，K-均值聚類中的第2類，品種10和品種14的抗BmCPV能力最好，品種名稱分別是秋白B、P50。采用系統(tǒng)聚類中Ward法，平方歐氏距離測量，譜系圖如圖1所示，分為兩大類，4個小類，其中品種5、品種16、品種29與品種10、品種14同為一類，通過系統(tǒng)類聚方法獲得高感染率品種為10個，比K-均值聚類方法獲得的高感染率品種減少13個。2種聚類方法結(jié)果得到的抗性分布如圖2所示，系統(tǒng)聚類的分布呈中間多，兩頭少的形態(tài)，比K-均值聚類的分布更加合理。

表5 K-Mean法聚類成員

圖1 58個品種抗BmCPV系統(tǒng)聚類譜系圖

a：K-均值聚類；b：系統(tǒng)聚類a：K - Mean cluster；b：The system cluster

3 討 論

近幾年，云南蠶區(qū)家蠶質(zhì)型多角體病毒病發(fā)生率逐年提高，對該病的防治已刻不容緩。掌握蠶區(qū)家蠶品種對BmCPV的感染情況并獲知其抗性分類是防治該病的第一步。通過對感染率數(shù)據(jù)的方差分析和多重比較，云南蠶區(qū)不同品種抗病性差異顯著，但該方法不能直接對家蠶品種抗病性進行分類，而抗性分類在家蠶病理研究中對選擇供試品種具有重要的指導(dǎo)意義。對苦瓜種質(zhì)資源白粉病抗性[19]、高粱品種萌發(fā)期抗旱性鑒定與分類[20]等研究表明，聚類分析是抗性分類的重要方法。本研究采用2種聚類方法進行比較，K-均值聚類法分為4類，快速直觀把58個家蠶品種分類；而在系統(tǒng)聚類中通過對組間鏈接法、重心法和ward法的數(shù)據(jù)比較和差異檢驗(過程略)，最終確定ward法的結(jié)果最好且差異最顯著。2種聚類方法的結(jié)果比較，系統(tǒng)聚類的分類結(jié)果更加合理，與預(yù)期相符，能夠在以后生物學(xué)實驗研究中以此為依據(jù)，選取與實驗?zāi)康南辔呛系墓┰嚻贩N進行實驗。

4 結(jié) 論

(1)通過對不同家蠶品種接種相同濃度的BmCPV多角體病毒液，接種第7天后調(diào)查感染率。經(jīng)方差分析和多重比較，不同品種對家蠶質(zhì)型多角體病毒病抗病性差異顯著(P<0.01)。

(2)采用聚類分析方法確定家蠶品種資源對BmCPV的抗性分類。通過K-均值聚類和系統(tǒng)聚類的比較，供試品種采用系統(tǒng)聚類方法把BmCPV的抗性水平分為4類，高抗品種有5份，中抗品種23份，中感品種20份，高感品種10份，分別占供試品種材料總數(shù)的9 %、40 %、34 %、17 %。該結(jié)果對家蠶病理研究供試品種選擇、抗病素材選取提供參考，為抗病育種和抗病關(guān)鍵基因的研究奠定基礎(chǔ)。

(3)云南蠶區(qū)抗BmCPV最好的P50品種(原名大造)與段家龍[8]研究結(jié)果一致。