西藏3種冷水魚(yú)皮膚病灶中潛在病原微生物分析

陳美群，潘瑛子，牟振波，劉海平，周建設(shè)，王萬(wàn)良，曾本和，扎西拉姆

(西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)研究所，西藏 拉薩 850032)

【研究意義】黑斑原鮡、異齒裂腹魚(yú)和拉薩裸裂尻是西藏地區(qū)重要的冷水性經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，主要分布于雅魯藏布江中、上游的干支流及附屬水域，多在水質(zhì)清澈、礫石底質(zhì)的河道營(yíng)底棲生活[1]。由于西藏冷水魚(yú)生長(zhǎng)緩慢、性成熟較晚、繁殖力較低、種群數(shù)量較少、外來(lái)魚(yú)種入侵等因素導(dǎo)致其資源量逐年枯竭[2-3]，特別是黑斑原鮡等多種冷水魚(yú)的資源現(xiàn)狀已經(jīng)非常嚴(yán)峻，已成為極度瀕危魚(yú)類(lèi)，積極開(kāi)展西藏冷水魚(yú)資源的研究與保護(hù)迫在眉睫。【前人研究進(jìn)展】目前，黑斑原鮡、異齒裂腹魚(yú)和拉薩裸裂尻的研究主要集中在分類(lèi)學(xué)[4]、食性組成[5]、胚胎發(fā)育特征[6-7]、生長(zhǎng)繁殖特性[8]等方面，但有關(guān)冷水魚(yú)病原微生物的研究卻鮮有涉及，僅本課題組利用Illumina-Miseq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)黑斑原鮡和尖裸鯉開(kāi)展了健康個(gè)體與病變死亡個(gè)體的表皮皮膚粘液及腸道內(nèi)容物的微生物多樣性探討，研究表明細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)變化是黑斑原鮡和尖裸鯉病變死亡的主要原因之一[9-10]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本文通過(guò)平板法對(duì)黑斑原鮡、異齒裂腹魚(yú)和拉薩裸裂尻等3種冷水魚(yú)皮膚病灶部位中多種可培養(yǎng)微生物進(jìn)行了分離鑒定。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以期明確引起上述冷水魚(yú)皮膚病變死亡的主要病原微生物種類(lèi)，為雅魯藏布江流域冷水魚(yú)微生物傳染病的防控與治療提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品采集及患病魚(yú)的臨床癥狀 黑斑原鮡[體重：(153±0.4)g，體長(zhǎng)：(24.6±0.2)cm，樣品編號(hào)1]、異齒裂腹魚(yú)[體重：(1232.4±0.3)g，體長(zhǎng)：(53.7±0.5)cm，樣品編號(hào)2]和拉薩裸裂尻[體重：(272.7±0.5)g，體長(zhǎng)：(36.3±0.4)cm，樣品編號(hào)3]均為西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)研究所于2017年在西藏拉薩國(guó)家農(nóng)業(yè)科技園區(qū)養(yǎng)殖基地人工養(yǎng)殖過(guò)程中的患病魚(yú)，在采集樣品前對(duì)患病魚(yú)的臨床癥狀進(jìn)行了觀察和記錄，黑斑原鮡、異齒裂腹魚(yú)和拉薩裸裂尻皮膚病灶部位病變主要表現(xiàn)為皮膚充血潰爛、有白灰色斑塊、附著有白色絨毛狀霉菌(圖1)。待上述馴養(yǎng)冷水魚(yú)死亡后2 h之內(nèi)用無(wú)菌方式采集每種5尾死亡魚(yú)類(lèi)皮膚病灶部位樣品，于實(shí)驗(yàn)室6 h之內(nèi)處理完畢。

圖1 冷水魚(yú)皮膚病灶部位

1.1.2 培養(yǎng)基 NA培養(yǎng)基：蛋白胨 5.0 g，葡萄糖 2.5 g，瓊脂 18.0 g，pH 7.0±0.1，蒸餾水定容至 1000 mL；TSA培養(yǎng)基：胰蛋白胨 15 g，大豆蛋白胨 5 g，氯化鈉 5g，瓊脂 15 g，pH 7.3±0.2，蒸餾水定容至 1000 mL；LB固體培養(yǎng)基：酵母提取物 5 g，胰蛋白胨 10 g，氯化鈉 10 g，pH值7.0±0.2，蒸餾水定容至 1000 mL；PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯 300 g，葡萄糖 20g，瓊脂 15 g，氯霉素 0.1 g，pH值自然，蒸餾水定容至 1000 mL；孟加拉紅培養(yǎng)基：蛋白胨 5 g，葡萄糖 10 g，磷酸二氫鉀 1 g，硫酸鎂 0.5 g，瓊脂 15 g，孟加拉紅 0.03 g，氯霉素 0.1 g，pH 7.2±0.2，蒸餾水定容至 1000 mL。

1.2 病灶部位細(xì)菌和真菌的分離純化[11]

將患病魚(yú)體放于滅菌不銹鋼方盤(pán)中，用75 %滅菌酒精沖洗病灶部位15 s、重復(fù)3次，然后再用滅菌水沖洗病灶部位15 s、重復(fù)3次，最后用滅菌手術(shù)刀刮取病灶部位皮膚樣品，取5 g病灶部位樣品剪碎加入25 mL無(wú)菌水150 r/min震蕩30 min，取100 μl上清液均勻涂布于細(xì)菌分離培養(yǎng)基(NA、TSA)上、每種培養(yǎng)基設(shè)3個(gè)重復(fù)，細(xì)菌于15 ℃培養(yǎng)24 h后挑取形態(tài)不同的菌落反復(fù)劃線于LB固體培養(yǎng)基上直至獲得純培養(yǎng)物，細(xì)菌純培養(yǎng)物于LB斜面培養(yǎng)基上4 ℃保藏備用；取100 μl上清液均勻于真菌分離培養(yǎng)基(PDA、孟加拉紅培養(yǎng)基)上、每種培養(yǎng)基設(shè)3個(gè)重復(fù)，真菌于15 ℃培養(yǎng)7 d后挑取形態(tài)不同的菌落邊緣反復(fù)點(diǎn)接于PDA培養(yǎng)基上直至獲得純培養(yǎng)物，真菌純培養(yǎng)物于PDA斜面培養(yǎng)基上4 ℃保藏備用。

1.3 細(xì)菌和真菌的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：細(xì)菌形態(tài)學(xué)鑒定參考《Taxonomic outline of the prokaryotes bergey’s manual of systematic bacteriology, 2nd edition》[12]、真菌形態(tài)學(xué)鑒定參考《真菌鑒定手冊(cè)》[13]；分子生物學(xué)鑒定：純培養(yǎng)物使用TIANGEN公司基因組抽提試劑盒提取總 DNA，然后用于目的基因的擴(kuò)增。細(xì)菌16S rDNA目的基因PCR擴(kuò)增采用通用引物27F/1492R[14]，真菌ITS區(qū)目的基因PCR擴(kuò)增采用通用引物 ITS1/ITS4[15]。擴(kuò)增程序如下：94 ℃ 5 min；94℃ 30s， 55 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min， 30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。取 2 μl PCR 產(chǎn)物，1 % 瓊脂糖電泳進(jìn)行產(chǎn)物檢測(cè)。擴(kuò)增產(chǎn)物送交北京億明復(fù)興生物科技有限公司測(cè)序，利用 BLAST 軟件將測(cè)定得到的基因序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)分析，獲取NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中相近菌株的基因序列，然后用 CLUSTAL X 軟件進(jìn)行全序列比對(duì)，利用 MEGA 7.0中的鄰接法(Neighbor-Joining)建立目的基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[16]。

表1 冷水魚(yú)病灶部位微生物平板分離

2 結(jié)果與分析

2.1 患病魚(yú)病灶部位微生物的分離

由表1可知，從3種冷水魚(yú)病灶部位共計(jì)分離得到151株細(xì)菌和72株真菌，其中黑斑原鮡病灶部位分離得到39株細(xì)菌和9株真菌、異齒裂腹魚(yú)病灶部位分離得到71株細(xì)菌和45株真菌、拉薩裸裂尻病灶部位分離得到41株細(xì)菌和18株真菌。所有分離得到的微生物經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)初步鑒定，篩重后選取33株細(xì)菌和54株真菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

2.2 冷水魚(yú)細(xì)菌16s rDNA序列的鑒定

由表2可知，對(duì)共計(jì)33株細(xì)菌進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：分離自西藏3種冷水魚(yú)病灶部位的細(xì)菌主要分布在α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、β-變形菌綱(Betaproteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、黃桿菌綱(Flavobacteria)、放線菌綱(Actinobacteria)、異常球菌綱(Deinococci)、芽孢桿菌綱(Bacilli)及厚壁菌門(mén)(Firmicutes)。西藏3種冷水魚(yú)病灶部位細(xì)菌主要有氣單胞菌屬(Aeromonas)、不動(dòng)細(xì)菌屬(Acinetobacter)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、微球菌屬(Micrococcus)、紫色桿菌屬(Janthinobacterium)、微桿菌屬(Microbacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鄰單胞菌屬(Plesiomonas)、異常球菌屬(Deinococcus)、莫拉克斯氏菌屬(Moraxella)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、微小桿菌屬(Exiguobacterium)、沙雷氏菌屬(Serratia)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、節(jié)細(xì)菌屬(Arthrobacter)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、考克氏菌屬(Kocuria)、馬賽菌屬(Massilia)、乳球菌屬(Lactococcus)、Deefgea和Paenisporosarcina等21屬。序列BLAST比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明(圖2)： 1-X-1、3-X-11、3-X-15、3-X-19等菌株與AeromonashydrophilaSAS13(MF612172.1 )具有99 %的同源性，Aeromonashydrophila是魚(yú)類(lèi)常見(jiàn)的條件致病菌，典型的人-獸-魚(yú)共患病病原菌，可引起魚(yú)類(lèi)爛腮病、赤皮病、出血病及紅鰭病等多種疾病[17]。1-X-21與Paenisporosarcinasp. ARK-14-voll(HF912842.1)具有100 %的同源性，Paenisporosarcina屬細(xì)菌是Krishnamurthi S等[18]2009年對(duì)Sporosarcina屬細(xì)菌重新分類(lèi)而鑒別的一個(gè)細(xì)菌新屬。1-X-22、1-X-32與Chryseobacterium屬細(xì)菌具有較高的同源性，Chryseobacterium是一個(gè)新近命名的菌屬，由原先屬于黃桿菌屬的6個(gè)種和3個(gè)新種構(gòu)成，Chryseobacteriumpiscicola由Ilardi P等[19]從芬蘭養(yǎng)殖場(chǎng)生病的大西洋鮭皮膚病灶中分離得到，是大西洋鮭的主要致病微生物。2-X-8、3-X-9與Pseudomonas屬具有100 %的同源性，Pseudomonas屬微生物是魚(yú)類(lèi)重要的腐敗菌之一，能夠加速魚(yú)體病變部位的腐爛變質(zhì)[20]。2-X-26與PlesiomonasshigelloidesAW28(GU324301.1)具有99 %的同源性，Plesiomonasshigelloides可引起魚(yú)類(lèi)體色發(fā)黑、體表出血、鱗片脫落、鰭條潰爛等癥狀，是多種魚(yú)類(lèi)重要的病原菌[21-22]。3-X-8與Flavobacteriumsp. T56L(JX287816.1)具有99 %的同源性，F(xiàn)lavobacterium屬細(xì)菌廣泛存在于水體、土壤和動(dòng)植物等環(huán)境中，Leydis Z等[23]從患病的虹鱒魚(yú)中分離得到Flavobacteriumplurextorumsp. nov.新種，是潛在的魚(yú)類(lèi)病原菌。

表2 冷水魚(yú)可培養(yǎng)細(xì)菌鑒定

續(xù)表2 Continued table 2

菌株編號(hào)Sample name近源序列Similarity sequence相似度(%)Similarity分類(lèi)地位(屬)Genus登陸號(hào)Landing number1-X-24Micrococcus sp. AX5(KP126827.1 )100MicrococcusMH3079811-X-32Chryseobacterium sp. ARS145-11(JX827616.1 )99ChryseobacteriumMH3079821-X-33Janthinobacterium sp.M1-12(MG757982.1)99JanthinobacteriumMH3079831-X-35、2-X-37Microbacterium sp.KBL11(MG576164.1 )100MicrobacteriumMH3079842-X-8、3-X-9Pseudomonas sp. DNE-S2(MF803833.1 )100PseudomonasMH3079852-X-26Plesiomonas shigelloides AW28(GU324301.1)99PlesiomonasMH3079862-X-56Macrococcus caseolyticus GCFS2(MG722794.1 )99MicrococcusMH3079873-X-2Deinococcus sp. MZDSW(KY435503.1 )100DeinococcusMH3079883-X-7Moraxella sp.GM2(JF837191.1)99MoraxellaMH3080013-X-8Flavobacterium sp. T56L(JX287816.1)99FlavobacteriumMH3079893-X-14Exiguobacterium aurantiacum TAGEM15-70-B31(MG685824.1 )99ExiguobacteriumMH3079903-X-17Serratia liquefaciens Mt16(MF624481.1 )99SerratiaMH3079913-X-22Brevundimonas intermedia NW33(JF915341.1 )99BrevundimonasMH3079923-X-23Arthrobacter sp. MDT2-15(JX949674.1 )99ArthrobacterMH3079933-X-24Sphingomonas sp. NA53(LN832013.1 )100SphingomonasMH3079993-X-25Sphingomonas sp. CCGE4035(GU980224.1 )99SphingomonasMH3079943-X-28Kocuria polaris PGd6(MG029449.1)100KocuriaMH3080003-X-32、3-X-27Arthrobacter sp.FRA03P48(MG860335.1 )99ArthrobacterMH3079953-X-34Massilia aurea HME9229(KF911334.1 )99MassiliaMH3079963-X-36Deefgea rivul S-T-TSA-63(JX860598.1)100DeefgeaMH3079973-X-42、3-X-13Lactococcus piscium TJ-1-25(MF157588.1 )100LactococcusMH307998

圖2 冷水魚(yú)皮膚病灶中可培養(yǎng)細(xì)菌系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

表3 冷水魚(yú)可培養(yǎng)真菌鑒定

2.3 冷水魚(yú)真菌ITS序列的鑒定

由表3可知，對(duì)共計(jì)54株真菌進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：分離自西藏3種冷水魚(yú)病灶部位的真菌主要分布在接合菌綱(Zygomycetes)、座囊菌綱(Dothideomycetes)、散囊菌綱(Eurotiomycetes)、卵菌綱(Oomycetes)、銀耳綱(Tremellomycetes)、酵母綱(Saccharomycetes)和絲孢綱(Hyphomycetes)。3種冷水魚(yú)病灶部位真菌主要有毛霉屬(Mucor)、枝孢菌屬(Cladosporium)、根霉屬(Rhizopus)、莖點(diǎn)霉屬(Phoma)、派倫霉屬(Peyronellaea)、青霉屬(Penicillium)、水霉屬(Saprolegnia)、鏈格孢屬(Alternaria)、小球殼孢屬(Microsphaeropsis)、鐮刀菌屬(Fusarium)、小球腔菌屬(Leptosphaeria)、網(wǎng)孢菌屬(Filobasidium)、假絲酵母屬(Candida)、支頂孢屬(Acremonium)和隱球菌屬(Cryptococcus)等15屬。序列BLAST比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明(圖3)： 1-Z-1、2-Z-39與MucorracemosuslhWWF65具有100 %的同源性，毛霉屬(Mucor)真菌通常在機(jī)體營(yíng)養(yǎng)不良、抵抗力低下和體表?yè)p傷時(shí)侵入機(jī)體組織，是一類(lèi)致命的條件致病菌，楊鳶劼等[24]對(duì)暗紋東方鲀病理組織切片觀察發(fā)現(xiàn)毛霉屬真菌可在魚(yú)體形成環(huán)狀蒼白圈，體表病灶中心常出現(xiàn)糜爛潰瘍，最后延伸至肌肉導(dǎo)致魚(yú)體死亡。2-Z-4與SaprolegniaparasiticaCNUaq1具有99 %的同源性，水霉屬(Saprolegnia)真菌可引起水生動(dòng)物感染水霉病，水霉病是現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重要危害病原菌之一，水霉感染后會(huì)造成魚(yú)體死亡、魚(yú)卵孵化率降低等危害，我國(guó)致病性水霉菌主要為寄生水霉(Saprolegniaparasitica)和多子水霉(Saprolegniaferax)，其中寄生水霉孢子萌發(fā)快，侵襲能力強(qiáng)，對(duì)我國(guó)淡水魚(yú)類(lèi)危害尤其嚴(yán)重，每年對(duì)淡水水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[25-26]。

圖3 冷水魚(yú)皮膚病灶中可培養(yǎng)真菌系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

3 討論與結(jié)論

目前，有關(guān)雅魯藏布江流域冷水魚(yú)微生物的研究鮮有報(bào)道，本文首次對(duì)雅魯藏布江流域黑斑原鮡、異齒裂腹魚(yú)和拉薩裸裂尻等3種冷水魚(yú)皮膚病灶中可培養(yǎng)微生物進(jìn)行了分析，研究結(jié)果表明：西藏3種冷水魚(yú)皮膚病灶部位可培養(yǎng)細(xì)菌主要分布在α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、β-變形菌綱(Betaproteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、黃桿菌綱(Flavobacteria)、放線菌綱(Actinobacteria)、異常球菌綱(Deinococci)、芽孢桿菌綱(Bacilli)及厚壁菌門(mén)(Firmicutes)等1門(mén)、7綱21屬25種，可培養(yǎng)真菌主要分布在接合菌綱(Zygomycetes)、座囊菌綱(Dothideomycetes)、散囊菌綱(Eurotiomycetes)、卵菌綱(Oomycetes)、銀耳綱(Tremellomycetes)、酵母綱(Saccharomycetes)和絲孢綱(Hyphomycetes)等7綱15屬24種，從3種冷水魚(yú)皮膚病灶部位共計(jì)分離得到36屬49種微生物，黑斑原鮡、異齒裂腹魚(yú)和拉薩裸裂尻等3種冷水魚(yú)皮膚病灶部位中可培養(yǎng)微生物種類(lèi)較多。

微生物性病原菌引起的魚(yú)類(lèi)疾病具有發(fā)病急、傳播快、發(fā)病率高和死亡率高等特點(diǎn)，是危害較大的魚(yú)類(lèi)常見(jiàn)疾病，近年來(lái)備受?chē)?guó)內(nèi)外魚(yú)病研究工作者的關(guān)注[27-28]。本文從西藏冷水魚(yú)皮膚病灶部位分離的Aeromonashydrophila、Paenisporosarcinasp.、Chryseobacteriumsp.、Pseudomonassp.、Plesiomonasshigelloides、Flavobacteriumsp.、Mucorsp.和Saprolegniaparasitica等已被報(bào)道是多種魚(yú)類(lèi)的病原菌，因此，筆者認(rèn)為能夠?qū)ξ鞑乩渌~(yú)的健康養(yǎng)殖形成威脅的這8種病原微生物值得重點(diǎn)關(guān)注。另外，沙雷氏菌屬(Serratia)、乳球菌屬(Lactococcus)、假絲酵母屬(Candida)等菌株能夠產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶等活性物質(zhì)，它們是加速肉類(lèi)食品腐敗變質(zhì)的重要微生物，在魚(yú)體表出現(xiàn)斑狀病變后能夠迅速感染魚(yú)肌肉組織，導(dǎo)致魚(yú)類(lèi)體表常出現(xiàn)大面積糜爛潰瘍，加速魚(yú)類(lèi)病理死亡[29-30]。同時(shí)，本文從冷水魚(yú)病灶部位還分離得到微球菌屬(Micrococcus)、微桿菌屬(Microbacterium)、微小桿菌屬(Exiguobacterium)、節(jié)細(xì)菌屬(Arthrobacter)等放線菌和根霉屬(Rhizopus)、青霉屬(Penicillium)、小球殼孢屬(Microsphaeropsis)、小球腔菌屬(Leptosphaeria)、支頂孢屬(Acremonium)等真菌，它們能夠產(chǎn)生大量的化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎、抑菌效果較好或有特殊作用的生物活性物質(zhì)，可能對(duì)上述病原微生物的防治具有貢獻(xiàn)[31-33]。

本文對(duì)西藏3種冷水魚(yú)皮膚病灶中可培養(yǎng)微生物及其病原微生物進(jìn)行了探討分析，初步明確了黑斑原鮡、異齒裂腹魚(yú)和拉薩裸裂尻等3種冷水魚(yú)皮膚病灶中可培養(yǎng)微生物種類(lèi)及其潛在病原微生物種屬，下一步將繼續(xù)開(kāi)展以下幾方面的研究工作：①開(kāi)展8種冷水魚(yú)疑似病原微生物的人工感染及其藥物敏感試驗(yàn)，明確疑似病原微生物的致病特性及其防治措施；②研究Micrococcussp.、Microbacteriumsp.、Exiguobacteriumsp.、Arthrobactersp.、Rhizopussp.、Penicilliumsp.、Microsphaeropsissp.、Leptosphaeriasp.、Acremoniumsp.等病灶分離菌株對(duì)8種疑似病原微生物的拮抗作用，提取上述分離微生物的次級(jí)代謝化合物并開(kāi)展其抑菌活性分析；③探討沙雷氏菌屬(Serratia)、乳球菌屬(Lactococcus)、假絲酵母屬(Candida)等分離菌株的蛋白酶、脂肪酶活性，明確其在冷水魚(yú)病變死亡后期的促進(jìn)魚(yú)肉腐敗、變質(zhì)及潰爛等協(xié)同效果。