紅楠炭疽病病原鑒定及其藥劑篩選

宋慧云，段志豪，毛子翎，2，孫 思，2，王 軍，2，單體江，2*

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣東省微生物信號與作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642)

【研究意義】紅楠(MachilusthunbergiiSieb. et Zucc.)屬樟科((Lauraceae)潤楠屬(Machilus)常綠闊葉喬木，在我國大多生長在暖溫帶和亞熱帶地區(qū)[1]。紅楠具有很高的觀賞性，可用作木材和土壤保持樹種[2]。近年來隨著人類活動的增加以及火災(zāi)等影響，導(dǎo)致紅楠棲息地遭到嚴(yán)重破壞，紅楠數(shù)量日益銳減，瀕臨滅絕，目前被列為我國瀕危樹種[3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，對于紅楠的研究主要集中于林間特征[4]、藥用價(jià)值[5-6]、遺傳多樣性[3]及紅楠生長相關(guān)因素[7]等。Gao等[4]使用模型有效地模擬和預(yù)測紅楠的種內(nèi)和種間競爭，結(jié)果表明當(dāng)紅楠的胸徑低于20 cm時(shí)，應(yīng)實(shí)現(xiàn)撫育管理，以提高黑松的生存及植被恢復(fù)。Su 等[8]從紅楠葉中分離出具有體外細(xì)胞毒性和抗霉菌真菌活性的精油，并確定了活性源化合物是β-Eudesmol。Watanabe等證實(shí)紅楠是異源二性的，由兩種類型的原始兩性花組成[9]。Liu等[10]證實(shí)紅楠在低鹽脅迫條件下，地上生物量略有增加，而地下生物量，根長和根表面積呈下降趨勢；在高濃度鹽脅迫下，地上生長受到限制，而地下生長則沒有受到顯著抑制。Li等[1]首次報(bào)道了紅楠葉枯和枝枯病，并確定致病菌為Lasiodiplodiagilanensis。但關(guān)于紅楠其他病害的研究報(bào)道較少。【本研究切入點(diǎn)】筆者在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，在紅楠生長過程中確實(shí)存在其他病害的發(fā)生和危害，嚴(yán)重影響紅楠的正常生長，但并未見該病害的任何報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以發(fā)病嚴(yán)重的紅楠為研究對象，采集發(fā)病的組織材料，采用組織分離法對病原菌進(jìn)行分離，進(jìn)一步通過柯赫氏法則確定致病菌，并通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法鑒定病原菌，同時(shí)采用菌絲生長速率法篩選出對病原菌具有良好抑制效果的殺菌劑，旨在為紅楠病害的識別和鑒定以及病害的綜合防治提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 紅楠發(fā)病葉片和健康葉片于2016年12月采自廣州市天河區(qū)華南植物園。

1.1.2 供試殺菌劑 本試驗(yàn)所有供試殺菌劑均為殺菌劑原藥，包括98 %嘧菌酯、96.8 %苯醚甲環(huán)銼、97 %嘧霉胺、97 %吡唑醚菌酯、98 %溴菌腈、98 %福美雙、98.4 %多菌靈，均以上藥劑均購自中國農(nóng)科院植保所廊坊農(nóng)藥廠。

1.1.3 儀器與試劑 SW-CJ-2G型超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；BX43F生物顯微鏡(奧林巴斯(中國)有限公司)；MLS-3870三洋高壓滅菌鍋(松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社)；Exceed-C超純水機(jī)(成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司)； JA2003N分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；LRH-50型生化培養(yǎng)箱(上海恒科科技有限公司)。

葡萄糖(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；瓊脂(健陽生物科技有限公司)；升汞(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生物工程有限公司)；引物ITS4和ITS5(上海生物工程有限公司)；95 %酒精和二甲基亞砜(DMSO)均為分析純(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 癥狀觀察和描述 使用放大鏡觀察發(fā)病的葉片，對病斑進(jìn)行描述記錄，如病斑的位置、大小、顏色、排列等，再對病害植株的生長狀態(tài)進(jìn)行觀察和描述。

1.2.2 病原菌的分離和純化 病原菌的分離和純化參照陳哲等[11]和席中剛等[12]的方法，略有修改。首先將發(fā)病的葉片用水沖洗后置于超凈臺內(nèi)，剪取發(fā)病葉片病健交界處的葉片組織10份，大小約為3 mm× 3 mm，置于75 %酒精中浸泡20 s，再放入0.1 %升汞溶液中浸泡1 min左右，然后用無菌水沖洗3～4次，用滅菌的濾紙吸干表面的水分，接種于準(zhǔn)備好的PDA平板上。將接種好的PDA平板放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長出菌絲后，用滅菌的牙簽挑取菌落邊緣生長旺盛的菌絲接種到另一個(gè)PDA平板上。重復(fù)以上操作3次左右，獲得純化的菌株，然后將純化后的菌株接種于5 mL凍存管PDA斜面上，于4 ℃冰箱保存。

1.2.3 致病性測定 致病性的測定采用Xu 等[13]的方法。采集健康的紅楠葉片，用清水沖洗干凈，再用75 %酒精棉球擦拭葉片表面，而后用無菌水清洗3次。在每個(gè)葉片中脈兩側(cè)制造兩個(gè)針刺傷口，左右對稱，將純化好的菌絲接種在葉片左邊的針刺傷口處，右邊的針刺傷口作為對照，每個(gè)處理重復(fù)3次。將接種好的葉片置于提前鋪好吸水紙并加入無菌水的培養(yǎng)皿中，用保鮮膜封住皿口，放入生化培養(yǎng)箱保濕培養(yǎng)。一段時(shí)間后，對接種葉片進(jìn)行觀察，記錄發(fā)病情況。然后從發(fā)病葉片的病健交界處進(jìn)行病原菌的再次分離鑒定，最終確定致病菌。

1.2.4 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定 用滅菌后的牙簽挑取PDA平板上生長旺盛的菌落邊緣的菌絲，接種于另一個(gè)PDA平板中央，置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，然后用生物顯微鏡觀察菌落的菌絲、分生孢子梗、分生孢子等特征。然后參照《真菌鑒定手冊》以及《植物病原真菌學(xué)》對分離的病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定[14-15]。

1.2.5 病原菌的分子生物學(xué)鑒定 將純化后的菌株(在PDA生長5 d)接種到PDB培養(yǎng)基中，28 ℃ 150 r/min振蕩培養(yǎng)5 d，四層紗布過濾收集菌絲，用液氮進(jìn)行充分研磨至粉末狀，而后采用真菌基因組DNA抽提試劑盒提取其DNA。使用真菌的通用引物ITS4和ITS5擴(kuò)增其ITS序列，反應(yīng)擴(kuò)增體系為：去離子水21 μl，2×TaqPCR MasterMix(含染料)25 μl，ITS4(10 μmol/L)1 μl，ITS5(10 μmol/L)1 μl，模板 DNA(10 ng/μl)2 μl。PCR擴(kuò)增程序： 94 ℃預(yù)變性3 min，然后94 ℃變性40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min 20 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司完成測序。將測序成功的ITS序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號。通過在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行Blast，將測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性檢索，下載與其相似性較高的序列及其近似屬的序列，使用MAFTT version 7進(jìn)行序列處理后，采用最大似然法(Maximum likelihood)，用MEGA 7.0.26軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其中Bootstrap method中重復(fù)抽樣次數(shù)(No. of bootstrap replication)設(shè)置為500，模式為General Time Reversible Model。

1.2.6 不同殺菌劑對病原菌室內(nèi)毒力測定 不同殺菌劑對紅楠炭疽病病原菌的室內(nèi)毒力測定采用菌絲生長速率法[16]，分別稱取不同的供試殺菌劑12 mg，加入0.3 mL的DMSO，待完全溶解后再加入0.7 mL的無菌水，然后用30 %的DMSO采用倍半稀釋法依次稀釋成7個(gè)不同的濃度。將配制好的不同濃度的殺菌劑1 mL加到 29 mL的PDA(滅菌，冷卻至60 ℃)中，充分混勻后倒入3個(gè)無菌的培養(yǎng)皿中，每皿約10 mL，制成含藥培養(yǎng)基，濃度為6.0、3.0、1.5、0.75和0.375 mg/mL，溶劑為30 %的DMSO。將配制好的不同濃度的殺菌劑1 mL加到 29 mL的PDA(滅菌，冷卻至60 ℃)中，充分混勻后倒入3個(gè)無菌的培養(yǎng)皿中，每皿約10 mL，制成含藥培養(yǎng)基，得到供試殺菌劑的終濃度分別為0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125和0.00625 mg/mL。用打孔器將培養(yǎng)5 d且生長良好的待測菌邊緣打成直徑為7 mm的菌餅，菌餅朝下接種于含藥PDA平板上，以加入無菌水的PDA平板為空白對照，以30 %的DMSO陰性對照，98.4 %多菌靈為陽性對照，每個(gè)處理重復(fù)3次。28 ℃培養(yǎng)5 d左右，待空白對照的菌落生長至培養(yǎng)皿面積的2/3時(shí)，采用十字交叉法測得不同處理的菌落直徑，計(jì)算抑菌率。

抑菌率 =

純生長量=菌落平均直徑-菌餅直徑

計(jì)算出不同濃度下的抑菌率，選取其中的5個(gè)濃度，以殺菌劑濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以抑菌率的生物統(tǒng)計(jì)機(jī)率值為縱坐標(biāo)，在Origin2018軟件中進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得到毒力回歸方程和回歸系數(shù)，同時(shí)計(jì)算出EC50值，比較不同殺菌劑的相對抑制效果。

A:炭疽病癥狀; B:接種發(fā)病狀; C:菌落正面; D:菌落背面; E:菌絲形態(tài); F:分生孢子A: Symptom of anthracnose; B: Symptom of inoculation; C: Front side of colony; D: Reverse side of colony; E: Mycelial morphology; F: Conidia

圖2 基于ITS序列構(gòu)建的紅楠炭疽病菌Mtf-L1系統(tǒng)發(fā)育樹系

2 結(jié)果與分析

2.1 紅楠炭疽病病害癥狀

通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)該病害主要危害紅楠葉片，發(fā)病初期，葉片表面出現(xiàn)棕黃色小點(diǎn)，不規(guī)則圓形。后期病斑逐漸擴(kuò)大，中間壞死呈灰褐色，邊緣顏色較深，呈紅褐色(圖1A)。發(fā)病嚴(yán)重時(shí)，病斑布滿整個(gè)葉片，導(dǎo)致葉片變黃脫落。

2.2 紅楠炭疽病病原菌的分離和致病性測定

對紅楠的發(fā)病葉片進(jìn)行病原分離鑒定，得到3種不同的真菌菌株Mtf-L1、Mtf-L2和Mtf-L3。用針刺法將3種菌株分別接到離體健康的紅楠葉片。接種3 d之后，接種Mtf-L1菌株的葉片開始發(fā)病，葉片接種點(diǎn)出現(xiàn)黑色的病斑并逐漸擴(kuò)大，癥狀與自然發(fā)病癥狀類似(圖1B左側(cè))，并從發(fā)病的病斑上能再次分離可得到與接種菌株形態(tài)一致的菌落，對照組織未發(fā)病(圖1B右側(cè))；而接種Mtf-L2和Mtf-L3菌株的葉片未發(fā)病。結(jié)果表明Mtf-L1是紅楠炭疽病的病原菌。其菌落形態(tài)如圖1C所示。

2.3 紅楠炭疽病病原菌的鑒定

PDA培養(yǎng)基上生長的菌落為圓形(圖1C)，白色，邊緣整齊，氣生菌絲發(fā)達(dá)，排列整齊，毛絨狀，菌落背面中部呈淺黃色(圖1D)。培養(yǎng)7 d后，菌落長滿整個(gè)培養(yǎng)基(圖1C，D)。在顯微鏡下可觀察到菌絲有隔(圖1E)，分生孢子無色，單孢，長橢圓形或圓柱形，兩端鈍圓 ，大小平均為11.95 μm×4.03 μm(圖1F)。根據(jù)以上形態(tài)特征，將該病原菌初步鑒定為炭疽病菌。

采用真菌通用引物ITS4和ITS5進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小為602 bp的序列，將該序列提交至Genebank，獲得登錄號為MH397501。在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比對，通過MEGA 7.0.26軟件采用最大似然法(Maximum likelihood)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。從圖2可以看出，該病原菌被聚類在炭疽菌屬，但無法確定到種，因此最終確定引起紅楠葉部病害的病原菌為Colletotrichumsp.，屬于半知菌類，黑盤孢目，炭疽菌屬。

2.4 不同殺菌劑對紅楠炭疽病病原菌的室內(nèi)毒力測定

不同供試藥劑對紅楠炭疽病菌的抑制效果見圖3和表1。從表1中可以看出，所有供試殺菌劑對紅楠甲炭疽病菌均表現(xiàn)出一定的抑制作用，但不同殺菌劑之間存在明顯的差異。陽性對照98.4 %多菌靈的抑菌效果最好，在供試濃度下對紅楠炭疽病菌的抑制率均為100 %。其次是97 %吡唑醚菌酯，EC50值為(19.74 ± 1.79)μg/mL，98 %的福美雙也表現(xiàn)出較好的抑菌活性，EC50值為(55.92 ± 5.34)μg/mL。98.4 %的多菌靈在不同濃度下的抑制率均達(dá)100 %，97 %吡唑醚菌酯和98 %的福美雙對紅楠炭疽病菌的EC50值均小于0.1 μg/mL，說明紅楠炭疽病菌對這幾種藥劑非常敏感；98 %嘧菌酯、98 %溴菌腈、96.8 %苯醚甲環(huán)銼和97 %嘧霉胺的EC50值均為(418.64 ± 81.79)、(353.06± 21.45)、(209.08 ± 14.97)、(329.07 ± 21.10)μg/mL，在0.1～1 μg/mL，即紅楠炭疽病菌對這幾種藥劑較敏感。該結(jié)果表明，98.4 %多菌靈、97 %吡唑醚菌酯和98 %的福美雙在理論上是化學(xué)防治紅楠炭疽病菌較好的殺菌劑。7種殺菌劑對膠孢炭疽菌的抑制效果由大到小依次為98.4 %多菌靈>97 %吡唑醚菌酯>98 %福美雙>96.8 %苯醚甲環(huán)銼>97 %嘧霉胺>98 %溴菌腈>98 %嘧菌酯。

表1 殺菌劑對紅楠炭疽病菌的室內(nèi)毒力測定結(jié)果

注：EC50值為不同殺菌劑中有效成分的抑制中濃度。

a: 98 %嘧菌酯; b:98 %溴菌腈; c:96.8 %苯醚甲環(huán)銼; d:97 %嘧霉胺;e:97 %吡唑醚菌酯; f:98 %福美雙; 濃度1～5分別從大依次減小。a: 98 %Azoxystrobin; b: 98 %Bromoacetonitrile; c: 96.8 %Diphenyl ether ring; d: 97 %Pyrimethanil; e: 97 % Pyraclostrobin; f: 98 %Fumeishuang; concentration of 1-5 decrease in order from large

3 討 論

形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果表明，紅楠炭疽病的致病為Colletotrichumsp.。炭疽菌屬(Colletotrichum)病原菌廣泛分布于熱帶、亞熱帶，該類真菌是全球性的植物病原菌，寄主繁多，可引發(fā)各種林木和農(nóng)作物的炭疽病，造成葉、枝、花、果腐爛等嚴(yán)重癥狀，影響林木及農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[17-18]。Chen等[19]研究發(fā)現(xiàn)紅富士蘋果炭疽病菌為Colletotrichumgloeosporioides，炭疽病的發(fā)生嚴(yán)重降低了紅富士蘋果的質(zhì)量和產(chǎn)量，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。炭疽病是世界范圍內(nèi)辣椒的毀滅性疾病，其致病菌為C.gloeosporioides和C.truncatum，兩者都會導(dǎo)致辣椒大量減產(chǎn)[20]。最新的研究表明該屬真菌還可侵染中國的香蕉[21]、獼猴桃[22]和Basellaalba[23]，意大利的FeijoasellowianaBerg[24]，墨西哥的Crataegusgracilior[25]以及格魯吉亞的芹菜[26]等。本研究確定紅楠是炭疽病菌的新寄主，通過觀察致病菌的顯微形態(tài)和基于ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹確定致病菌屬于炭疽菌屬。由于炭疽菌屬種類繁多，有些物種缺乏模式標(biāo)本，使得菌種的鑒定愈發(fā)困難。目前，采用多基因進(jìn)行系統(tǒng)學(xué)分析已成為炭疽菌物種鑒定的趨勢，通過ITS、ACT、Apn2、Mat1 /Apn2、GAPDH、CHS-1、TUB2、CAL和 ApMAT 等的基因序列對炭疽菌進(jìn)行鑒定[27-30]，這也是本研究努力的方向及未來研究的重要課題。

為了篩選抑制紅楠炭疽病菌生長的殺菌劑，為紅楠炭疽病的防治提供依據(jù)，本研究測定了8種殺菌劑對紅楠炭疽病菌的室內(nèi)毒力，篩選出福美雙、吡唑醚菌酯和多菌靈3種有效抑制紅楠疽病菌的殺菌劑。福美雙屬于二硫代氨基甲酸鹽類農(nóng)藥，具有低毒廣譜殺菌作用，廣泛用于水果與蔬菜的病蟲害，馬珂[31]研究發(fā)現(xiàn)福美雙可有效抑制茄子褐紋病菌(Phomopsisvexans)，鄧之亮等[32]研究發(fā)現(xiàn)福美雙可有效防治棉花立枯絲核病菌(Rhizoctoniasolani)。但是，福美雙的殘留不可忽視，其毒性逐漸引起研究人員的重視，相關(guān)研究表明福美雙會造成斑馬魚早起原始生殖細(xì)胞移動分布的延遲，以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，也會造成肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良軟骨細(xì)胞凋亡[33-34]。何煉等[35]和王敏等[36]研究發(fā)現(xiàn)福美雙在川麥冬和豆芽根部的殘留量正常，所以在病害防治中應(yīng)合理使用福美雙，在正常殘留范圍內(nèi)達(dá)到最好的防治效果。吡唑醚菌酯應(yīng)用范圍較廣，可防治多種真菌性病害(如子囊菌、擔(dān)子菌、半知菌和卵菌的真菌引起的病害)，同時(shí)具有內(nèi)吸傳導(dǎo)性和耐雨水沖刷性能，持效期較長[37]。多菌靈作為商品化的殺菌劑，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，高效低毒，對半知菌、子囊菌引起的多種真菌性病害有較好的防治效果，主要是通過干擾脫氧核糖核酸(DNA) 的合成，特別是阻礙核苷的生成過程起到殺菌作用[38]。近些年，研究人員陸續(xù)使用多種殺菌劑對炭疽菌進(jìn)行內(nèi)毒力測定，其中吡唑醚菌酯和苯醚甲環(huán)唑?qū)椞烤揖休^好的抑制作用[39]；吡唑醚菌酯對辣椒炭疽菌有較好的抑制作用[40]，以上結(jié)果與本試驗(yàn)的結(jié)果類似。本試驗(yàn)采用菌絲生長速率法進(jìn)行室內(nèi)毒力測定，它代表了殺菌劑與病原菌的菌絲直接接觸時(shí)產(chǎn)生的效果，但實(shí)際的抑制效果的不僅與此因素有關(guān)，還與孢子的產(chǎn)生、萌發(fā)等及殺菌劑的特效性有關(guān)；另外寄主植物的生長環(huán)境，如溫度、濕度等因素，也是影響抑制效果的一個(gè)重要因素[41]。因此在后續(xù)研究中，可將福美雙、吡唑醚菌酯和多菌靈，進(jìn)行林間藥效進(jìn)一步測定，同時(shí)測定福美雙的殘留量，為植物病害防治提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié) 論

采用組織塊分離法分離引起紅楠炭疽病的病原菌，并通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法以及病害癥狀觀察和柯赫氏法則，確定紅楠炭疽病的致病菌是Colletotrichumsp.，本論文是首次關(guān)于紅楠炭疽病的報(bào)道。同時(shí)室內(nèi)毒力測定結(jié)果表明，98.4 %多菌靈、97 %吡唑醚菌酯和98 %福美雙對紅楠炭疽病菌菌絲生長的抑制作用最強(qiáng)，可作為防治紅楠炭疽病的化學(xué)殺菌劑，本論文也是首次關(guān)于不同殺菌劑對紅楠炭疽病菌的室內(nèi)毒力測定的報(bào)道。