雨生紅球藻UVR8的基因克隆和生物信息學(xué)分析

張宏江，杭 偉，馬浩天，王曉丹，李潤(rùn)植，崔紅利

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西 太谷 030801)

【研究意義】植物的生長(zhǎng)離不開陽光照射，植物在利用太陽光進(jìn)行光合作用的同時(shí)必然會(huì)受到紫外光的輻射，從太空照射至地球的紫外光只有少部分的中波紫外光(UV-B, 280～320 nm)與長(zhǎng)波紫外光(UV-A, 320～400 nm)[1]。其中，中波紫外光對(duì)植物的生長(zhǎng)具有雙重效應(yīng)，研究表明，高強(qiáng)度(HF>10 kj·m-2)的UV-B照射會(huì)使植物細(xì)胞產(chǎn)生大量活性氧分子，從而對(duì)植物細(xì)胞內(nèi)的生物大分子如DNA、蛋白質(zhì)、脂類物質(zhì)等造成傷害，影響植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育；而低強(qiáng)度(LF >1～5 kj·m-2)的UV-B則是植物生長(zhǎng)的信號(hào)調(diào)控因子，如抑制植物下胚軸的伸長(zhǎng)，提升類黃酮等化合物的合成[2]。【前人研究進(jìn)展】盧克歡等研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過UV-B處理后顛茄的光合作用能力及生物堿的積累受到抑制[3]；Vandenbussche等發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)腢V-B輻射擬南芥會(huì)影響其生長(zhǎng)素分布，從而調(diào)節(jié)葉片的發(fā)育，而高強(qiáng)度的輻射則會(huì)影響葉片的正常發(fā)育[4]；杜照奎等發(fā)現(xiàn)隨著UV-B強(qiáng)度的增強(qiáng)，花生葉片的PSⅡ活性受抑制愈加明顯[5]。由此科學(xué)家推測(cè)在植物體內(nèi)肯定存在能感知UV-B的光受體[6]。中波紫外光UV-B光受體最早發(fā)現(xiàn)于一株對(duì)UV-B特別敏感的擬南芥突變體uvr8-1[7]，在此基礎(chǔ)上分離獲得UVR8蛋白，證實(shí)UVR8就是UV-B的光受體[8]。UVR8不同于其他光受體,它不能結(jié)合其共價(jià)修飾基團(tuán)來吸收特定波段的光。由于UVR8的最大吸收峰(280～315 nm)與色氨酸的最大吸收峰(280 nm)相近，因此Brown等推測(cè)其可能利用特定的色氨酸殘基作為其發(fā)色團(tuán)[9]。研究表明，擬南芥UVR8內(nèi)含有14個(gè)色氨酸殘基，1個(gè)分布在C末端，6個(gè)分布在β-片狀螺旋結(jié)構(gòu)部位，其余7個(gè)分布在二聚體接觸部位。目前對(duì)于UVR8介導(dǎo)的信號(hào)通路研究已日漸深入，其調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一般機(jī)制如圖1所示：紫外光受體UVR8在無紫外光照射時(shí)以二聚體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，二聚體依靠?jī)蓚€(gè)單體之間的鹽橋連接[8]，鹽橋的穩(wěn)定依靠精氨酸(Arg)、天門冬氨酸(Asn)、色氨酸(Trp)和谷氨酸(Glu)來維持，受到紫外光照射后，鹽橋解體，二聚體解聚以單體形式向細(xì)胞核中富集[10]，并且與COP1發(fā)生相互作用，從而抑制COP1對(duì)HY5的降解[11-12]，并且可以促進(jìn)MYB轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)[13]；UVR8介導(dǎo)的正反饋機(jī)制過度表達(dá)會(huì)激活其負(fù)反饋機(jī)制的調(diào)節(jié)，光形態(tài)發(fā)生的抑制因子RUP1/RUP2和STO/BBX24會(huì)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，從而抑制UVR8與COP1的相互作用，從而抑制HY5的表達(dá)。當(dāng)失去紫外光照射時(shí)，UVR8蛋白的兩個(gè)單體又再次形成二聚體[12]。研究發(fā)現(xiàn)，來源于高等植物及綠藻等不同物種中的UVR8蛋白在氨基酸序列水平上具有極高的相似性，尤其是鹽橋結(jié)構(gòu)中的色氨酸和精氨酸形成的高度保守結(jié)構(gòu)域，暗示不同物種來源UVR8s可能具有相同的分子作用機(jī)制[14-17]。這種氨基酸序列水平的保守性可能與早期光合藻類植物生存環(huán)境中存在高強(qiáng)度的UV-B有較大關(guān)系。因此，UVR8可能在早期的光合藻類植物中就已經(jīng)形成，深入探討UVR8的進(jìn)化需要分析原始藻類植物的基因組序列[6]。同理，說明在雨生紅球藻體內(nèi)同樣存在UVR8的基因，但尚未見研究報(bào)道。雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)是一種單細(xì)胞綠藻，屬團(tuán)藻目，紅球藻科，是目前公認(rèn)的天然蝦青素的理想來源[18]。蝦青素(Astaxanthin)是一種超強(qiáng)的天然抗氧化劑，對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧自由基清除效果明顯，具有延緩皮膚衰老，防止紫外輻射以及預(yù)防心血管疾病等功效[19]。在正常培養(yǎng)條件下，雨生紅球藻為綠色游動(dòng)細(xì)胞，在不利生長(zhǎng)條件下(如高光，高溫，營(yíng)養(yǎng)成分缺乏)，雨生紅球藻由綠色游動(dòng)細(xì)胞變?yōu)榧t色厚壁孢子，蝦青素在紅色孢子狀態(tài)下大量積累[19]，可達(dá)細(xì)胞干重的4 %。研究表明，紫外光照射可顯著提高雨生紅球藻蝦青素含量[20-21]。但具體分子機(jī)制尚不清楚，藻細(xì)胞如何感知并轉(zhuǎn)導(dǎo)紫外光信號(hào),如何激活蝦青素合成相關(guān)基因的表達(dá)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本文以雨生紅球藻為研究對(duì)象，通過同源克隆和RACE結(jié)合的方法獲得雨生紅球藻HaeUVR8基因的cDNA 全長(zhǎng)，并利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)其理化性質(zhì)、高級(jí)結(jié)構(gòu)及其功能域進(jìn)行預(yù)測(cè)。【擬解決的關(guān)鍵問題】以期為雨生紅球藻中紫外光受體蛋白HaeUVR8的功能研究以及對(duì)雨生紅球藻中蝦青素的積累機(jī)制解析奠定基礎(chǔ)。

1.COP1:Constitutively photomorphogenic 1; 2.HY5:Elongated hypocotyl 5; 3.HYH:Hypocotyl 5 homolog; 4.SPA:Suppressor of PHYA-10; 5.STO/BBX24:Salt tolerance/b-box zinc finger protein 24; 6.RUP:Repressor of UV-B photomorphogenesis

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本實(shí)驗(yàn)所用雨生紅球藻藻種為購(gòu)自 Dunstaffnage Marine Laboratory 的品種Flotow 1844。藻種接種在BBM培養(yǎng)基保存于光照培養(yǎng)箱中(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所藻種庫(kù))。培養(yǎng)箱光照強(qiáng)度設(shè)置為25 μmol·m-2s-1，溫度設(shè)置為(23±1) ℃，光/暗培養(yǎng)周期為12 h/12 h，且每8 h搖晃1次。本實(shí)驗(yàn)所用大腸桿菌菌種為Top 10。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 高溫滅菌鍋Panasonic MLS-3781L日本松下健康株氏會(huì)社；超凈臺(tái)Boxun BJ-CD上海博迅；光照培養(yǎng)箱 BIC-400 上海博訊；電泳儀、凝膠成像儀、PCR儀 BIO-RAD 美國(guó)；旋渦振蕩器XH-C泰州邁興康；離心機(jī)ALLEGRA X-30R美國(guó)；恒溫水浴鍋HWS 12 型上海皖寧；移液槍Eppendorf德國(guó)；分光光度計(jì)Nano Drop 2000賽默飛世爾科技公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 本實(shí)驗(yàn)所需試劑盒：總RNA提取試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SMARTerTMRACE盒、PCR試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒及pMD-18T測(cè)序載體等均購(gòu)于TaKaRa Bio生物公司。本實(shí)驗(yàn)所需化學(xué)試劑：異丙醇購(gòu)于上海富蔗化工有限公司，無水乙醇、氯仿購(gòu)于上海誠(chéng)心化工有限公司，瓊脂糖購(gòu)于北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取 雨生紅球藻總RNA的提取按照所購(gòu)試劑盒上步驟進(jìn)行。為避免污染樣品，實(shí)驗(yàn)過程中所需的試管，量筒，研缽等需在180℃ 下烘烤8 h以上，所需離心管均為提RNA專用無菌無酶的離心管。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：①取50 mL藻液12 000 r/min 離心10 min，棄上清，PBS 緩沖液重懸浮，重復(fù)3～4次，移液槍吸取剩余上清，并及時(shí)將離心管放于液氮中保存。②10 s后將藻體轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的研缽中，加液氮快速充分研磨，將粉末轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管，加入1 mL 的RNAiso plus，在漩渦器上震蕩均勻，然后將樣品室溫放置5 min。③加0.2 mL的氯仿，蓋好管蓋，震蕩至均勻，室溫放置3 min。④12 000 r/min，4 ℃，離心15 min。將上層無色水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。⑤在離心管中加入等體積的異丙醇，震蕩搖勻，-20 ℃靜置30 min。⑥12 000 r/min，4 ℃條件下離心10 min，棄上清。⑦加入1 mL提前用無RNase的ddH2O配置好的75 %的酒精洗滌沉淀。⑧5000 r/min，4 ℃條件下離心3 min，棄上清，注意不要倒出沉淀，用移液槍小心吸出剩余少量液體。⑨室溫下晾3～5 min 至干燥，加入適量DEPC處理過的ddH2O，反復(fù)吹打混勻，充分溶解RNA。⑩測(cè)定RNA的濃度和純度，同時(shí)利用電泳儀進(jìn)行電泳檢測(cè)。將提取到的RNA放在-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 模板的制備 雨生紅球藻cDNA模板的制備按照所購(gòu)試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)步驟進(jìn)行。RACE模板的制備按照所購(gòu)試劑盒(SMARTerTMRACE cDNA Amplication Kit)上步驟進(jìn)行。

1.2.3 引物設(shè)計(jì) 雨生紅球藻UVR8基因引物的設(shè)計(jì)是通過對(duì)萊茵衣藻(C.reinhardtii)、團(tuán)藻(V.carteri)、小球藻(C.variabilis)、膠球藻(C.sp.C-169)等4種與雨生紅球藻相近藻種中的UVR8基因進(jìn)行序列比對(duì)，找出其保守的氨基酸序列，然后通過CODEHOP軟件設(shè)計(jì)引物。RACE引物是根據(jù)同源克隆片段所設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程公司合成。表1所示為所設(shè)計(jì)引物信息。

1.2.4 同源片段的獲得 通過PCR擴(kuò)增的方法獲得雨生紅球藻中的同源片段。反應(yīng)體系按照試劑盒說明進(jìn)行配置，其中模板為1.2.2中合成的雨生紅球藻 cDNA，引物為1.2.3中設(shè)計(jì)的同源克隆引物。PCR反應(yīng)條件為:階段一，94 ℃預(yù)變性 5 min ；階段二，94 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 60 s，30個(gè)循環(huán)；階段三，72 ℃延伸 7 min。循環(huán)終止后，取 3 μl PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物于1 %瓊脂糖凝膠電泳 25 min，將長(zhǎng)度相符且條帶清晰的PCR產(chǎn)物進(jìn)行后續(xù)的轉(zhuǎn)化和測(cè)序。

表1 文中用到的引物信息

1.2.5 全長(zhǎng)的獲得 雨生紅球藻UVR8 基因全長(zhǎng)的獲得通過RACE技術(shù)完成。引物為1.2.3中設(shè)計(jì)合成的RACE引物，模板為1.2.2中獲得的cDNA序列，按照SMARTerTMRACE盒上說明進(jìn)行PCR。將獲得的PCR產(chǎn)物于1 % 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果挑選陽性克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.3 生物信息分析

通過DNAStar SeqMan 軟件對(duì)中間以及5’和3’端RACE片段進(jìn)行拼接獲得雨生紅球藻UVR8基因cDNA序列全長(zhǎng)；通過序列處理在線工具包(SMS)(http://www.bio-soft.net/sms/)將獲得的HaeUVR8基因翻譯成氨基酸，并通過 ORFfinder 軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)對(duì)目的基因的開放閱讀框進(jìn)行查找；先用 Clustal W 軟件對(duì)多序列進(jìn)行比對(duì)分析，再通過軟件PhyML 及MEGA 繪制進(jìn)化樹。理化性質(zhì)分析通過軟件 ProtParam 完成，信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)通過 SignalP 4.1 軟件完成；然后利用 TMHMM 軟件對(duì)HaeUVR8蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。HaeUVR8 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域通過NCBI的CCD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)在線軟件以及本地軟件 SMART 進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取和基因克隆

如圖2所示，從上往下共3個(gè)條帶，依次是28S rRNA、18S rRNA和5S rRNA，前兩條帶帶型清晰，第三條帶較模糊，說明所提RNA完整性較好，未發(fā)生明顯降解。微量分光光度計(jì)(NanoDorp 2000)檢測(cè)所提RNA濃度及純度，結(jié)果顯示，所得RNA濃度是850 ng/μl，波長(zhǎng)A260/A280數(shù)值在1.8～2.0之間，波長(zhǎng)A260/A230數(shù)值在1.9～2.0范圍內(nèi)。說明所提RNA質(zhì)量較好，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 HaeUVR8蛋白cDNA序列

在同源克隆基礎(chǔ)上利用RACE方法獲得了雨生紅球藻中編碼紫外抗性蛋白的cDNA 序列(HaeUVR8, NCBI 注冊(cè)號(hào)：KT354897)的全長(zhǎng)(圖3)。該序列全長(zhǎng)2187 bp，編碼區(qū)從144～1697共1554 bp，編碼517個(gè)氨基酸，5’端非編碼區(qū)(5’-UTR)和3’端非編碼區(qū)(3’-UTR)長(zhǎng)度分別為143、490 bp，且?guī)в衟oly A尾巴結(jié)構(gòu)。利用BLASTp程序?qū)λ@得的HaeUVR8蛋白與其它物種中的UVR8蛋白進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)與擬南芥中的UVR8基因相似性達(dá)到51 %，與萊茵衣藻中UVR8基因相似性可達(dá)59 %。圖3中黑色標(biāo)注區(qū)域?yàn)橛晟t球藻中UVR8基因中的7個(gè)RCCI結(jié)構(gòu)域，灰色標(biāo)注為14個(gè)色氨酸殘基，這與擬南芥中的UVR8基因相似。

2.3 HaeUVR8蛋白基本理化性質(zhì)分析

ProtParam 軟件分析結(jié)果顯示，雨生紅球藻中UVR8蛋白分子式為C2385H3716N690O732S17，該蛋白質(zhì)分子量為54.31 kD，等電點(diǎn)pI為5.56。編碼該蛋白的氨基酸共有20 種，其中含量較高的氨基酸為甘氨酸(Gly, 15.1 %)、亮氨酸(Leu, 9.9 %)、丙氨酸(Aly, 8.7 %)和纈氨酸(Val, 8.1 %)，而甲硫氨酸(Met)和酪氨酸(Tyr)含量偏低，分別為1.2 % 和 1.4 %。帶負(fù)電荷的氨基酸殘基總數(shù)(Asp+Glu)共51個(gè)，帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)共36個(gè)。蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為31.77，為穩(wěn)定蛋白。軟件 SignalP 4.1 預(yù)測(cè)結(jié)果顯示編碼雨生紅球藻UVR8蛋白的氨基酸序列中沒有信號(hào)肽序列。 TMPred 和 TMHMM 軟件結(jié)果顯示雨生紅球藻UVR8蛋白中沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，是可溶性蛋白。TargetP 1.1 預(yù)測(cè)結(jié)果顯示目的蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)。

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；1～2：所提RNA樣品；3：代表 3′RACE產(chǎn)物；4：5′RACE產(chǎn)物；5：開放閱讀框的產(chǎn)物；6：同源克隆產(chǎn)物

圖3 雨生紅球藻中編碼UVR8的核苷酸序列和氨基酸序列

2.4 HaeUVR8蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

SOPMA預(yù)測(cè)結(jié)果顯示目的蛋白中無規(guī)則卷曲所占比例最高(44.87 %)，其次為延伸鏈(23.40 %)，此外，α-螺旋和β-折疊分別占21.28 % 和10.44 %。因此，雨生紅球藻UVR8蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲和延伸鏈組成，為混合型蛋白。利用在線軟件SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)通過同源建模的方法對(duì)雨生紅球藻UVR8蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果(圖4)顯示，雨生紅球藻UVR8蛋白與擬南芥相同，都含有7個(gè)保守的葉片螺旋結(jié)構(gòu)，7個(gè)片狀螺旋縱向排列并圍成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，中間區(qū)域形成充水通道。

2.5 HaeUVR8蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

紫外抗性蛋白UVR8最先在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，然后在高等植物及真核綠藻中相繼被發(fā)現(xiàn)，為進(jìn)一步研究UVR8蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得12個(gè)物種的UVR8蛋白氨基酸序列并通過PhyML及MEGA軟件對(duì)多序列進(jìn)行比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析。分析結(jié)果(圖5)表明，雨生紅球藻(HaeUVR8)與其他5株藻種團(tuán)藻(VcaUVR8)、萊茵衣藻(CreUVR8)、膠球藻(CsuUVR8)和小球藻(CvaUVR8)聚為一支為綠藻門；擬南芥(AthUVR8)、亞麻薺(CsaUVR8)及油菜(BnaUVR8)聚為一支為十字花科植物；蓖麻(RcoUVR8)、南瓜(CmoUVR8)、胡桃(JreUVR8)、月季(RchUVR8)聚為一支為豆類植物，且與十字花科植物形成姊妹群；小立碗蘚(PpaUVR8)自為一支。

圖4 HaeUVR8蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖5 HaeUVR8蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.6 HaeUVR8蛋白保守域及磷酸化位點(diǎn)分析

對(duì)雨生紅球藻UVR8蛋白的保守域分析結(jié)果(圖6A)顯示，HaeUVR8蛋白中共存在7個(gè)重復(fù)的RCCI家族結(jié)構(gòu)域，是紫外抗性蛋白家族的典型特征。為了對(duì)雨生紅球藻中UVR8蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步研究，對(duì)與其同源性相近的4株微藻物種(CreUVR8,CsuUVR8,CvaUVR8,VcaUVR8)，苔蘚(PpaUVR8)以及擬南芥等7株高等植物中的UVR8s蛋白進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，7株高等植物引物以及苔蘚中都含有3個(gè)“GWRHT”(圖6B矩形框選區(qū)域)基序，而5株綠藻品種中僅含有2個(gè)“GWRHT”基序，第1個(gè)基序中的蘇氨酸“T”被絲氨酸“S”取代(圖6B第一個(gè)矩形框選區(qū)域)，圖中序列下方五角星表示3個(gè)色氨酸殘基(W221，W273，W325)與相鄰功能域中的色氨酸(W82)形成穩(wěn)定的“金字塔”結(jié)構(gòu)；圖中序列上方三角形代表對(duì)維持紫外抗性蛋白二聚體鹽橋起重要作用的精氨酸(R274，R326)。軟件Scansite 3.0 對(duì)雨生紅球藻UVR8蛋白可能的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，分析結(jié)果(圖6C)顯示，第2個(gè)RCC1結(jié)構(gòu)域中包含2個(gè)磷酸化位點(diǎn)(T131和T145)；第5個(gè)包含1個(gè)磷酸化位點(diǎn)(T276)；第6個(gè)包含2個(gè)(S284，S328)；第7個(gè)存在1個(gè)磷酸化位點(diǎn)(S336)，在RCCI結(jié)構(gòu)域之外還存在1個(gè)磷酸化位點(diǎn)(P416)。

3 討 論

紫外光UV-B是植物調(diào)節(jié)自身生長(zhǎng)發(fā)育過程中一個(gè)極重要的環(huán)境信號(hào)，對(duì)植物的生長(zhǎng)有著雙重效應(yīng)[2]。UVR8作為目前已知唯一的一個(gè)紫外光受體在植物體光形態(tài)建成過程中發(fā)揮著信號(hào)接收與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要橋梁作用。UVR8最早在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，目前對(duì)于擬南芥中UVR8的研究表明，UVR8介導(dǎo)的中波紫外光UV-B可對(duì)植物體多種生理過程進(jìn)行調(diào)控[4-6]，這為雨生紅球藻中UVR8蛋白的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究提供了線索。

蛋白質(zhì)的磷酸化是蛋白質(zhì)在翻譯后對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾的最重要也是最基本的機(jī)制。通過對(duì)雨生紅球藻UVR8蛋白的磷酸化進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白共存在7個(gè)可能的磷酸化位點(diǎn)且分布不均勻，其中6個(gè)分布在RCC1結(jié)構(gòu)域上，另外一個(gè)分布在RCC1結(jié)構(gòu)域之外。HaeUVR8蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，5株真核綠藻為一個(gè)分支，小立碗蘚與其他幾株高等植物為一個(gè)分支，這一分析結(jié)果與物種之間的進(jìn)化樹相符合。

研究表明，用不同劑量紫外光對(duì)雨生紅球藻進(jìn)行輻射發(fā)現(xiàn)藻體內(nèi)各種色素以及SOD酶活性都有所增加[20]。目前對(duì)于紫外光受體的研究主要集中在高等植物擬南芥中，但UVR8介導(dǎo)的光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)體系仍有許多問題待研究，因此本實(shí)驗(yàn)從雨生紅球藻UVR8出發(fā)對(duì)其進(jìn)行了生物信息分析，以期為今后更深入研究UVR8蛋白響應(yīng)UV-B的分子機(jī)理做出一定的參考。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)將同源克隆與RACE技術(shù)相結(jié)合，首次獲得了雨生紅球藻中紫外光受體UVR8的cDNA序列全長(zhǎng)，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。HaeUVR8蛋白分子式為C2385H3716N690O732S17，分子量為54.31 kD，編碼區(qū)全長(zhǎng)1554 bp，共編碼517個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)的理論等電點(diǎn)為5.56，蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為31.77，屬于穩(wěn)定蛋白。在HaeUVR8蛋白中共發(fā)現(xiàn)7個(gè)RCC1結(jié)構(gòu)域，2個(gè)RCC1_2結(jié)構(gòu)域，7個(gè)保守的葉片螺旋結(jié)構(gòu)，3個(gè)穩(wěn)定的“GWRHT”基序，存在2個(gè)由特定氨基酸(W221，W273，W325與W94)組成的“金字塔”結(jié)構(gòu)，這些都與擬南芥等高等植物相似，暗示HaeUVR8的作用機(jī)理同其他高等植物相似。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步深入了解雨生紅球藻中紫外光受體蛋白的作用機(jī)制提供了參考。