棉籽糖對雜交鱘生長性能及非特異性免疫的影響

文/周云 邢薇 付海利 羅琳

北京市鱘魚、鮭鱒魚創(chuàng)新團隊專欄

鱘魚，又稱鱘龍，是一種具有較高經(jīng)濟價值和營養(yǎng)價值的原始軟骨硬鱗魚類。由于其養(yǎng)殖模式的擴大、密度的增加及人工配合飼料營養(yǎng)不均衡等，造成鱘魚養(yǎng)殖環(huán)境持續(xù)惡化，魚體健康狀況降低等一系列問題出現(xiàn)，有可能會在養(yǎng)殖過程中爆發(fā)大規(guī)模的疾病，進而給養(yǎng)殖戶帶來較大的經(jīng)濟損失。因此，在目前的養(yǎng)殖條件下，如何提高鱘魚自身的免疫力從而減少魚體對養(yǎng)殖環(huán)境的應(yīng)激，避免魚類疾病的爆發(fā)，是目前迫切需要解決的問題之一。

棉籽糖作為功能性低聚糖的重要組成部分，可以改善腸道菌群以及提高機體的免疫力，對動物體具有提高機體免疫力等多種生理功能。歐美及日本等國家對棉籽糖的研究較多，我國在這方面的研究報道相對較少，尤其是關(guān)于棉籽糖在魚類的應(yīng)用研究更是稀缺。因此，本實驗擬通過在飼料中添加棉籽糖，研究其對雜交鱘生長性能及非特異性免疫功能的影響，為鱘魚工廠化健康養(yǎng)殖以及棉籽糖在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用提供一些參考。

一、材料與方法

（一）實驗飼料

本實驗所用飼料如下所示。

對照組：以魚粉為主要蛋白源的基礎(chǔ)飼料。

棉籽糖組：在基礎(chǔ)飼料中添加棉籽糖。棉籽糖的純度為90%，由北京中唐瑞德生物科技有限公司提供，所用劑量為推薦用量。棉籽糖用50℃的溫水溶解后按照0.1%的添加量與基礎(chǔ)料攪拌均勻，陰干，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

兩組飼料均根據(jù)魚體大小制成2.0mm和3.0mm兩種不同粒徑沉性飼料。飼料的基本組成見表1。

（二）實驗魚及飼養(yǎng)管理

實驗用雜交鱘魚由北京中科天利水產(chǎn)科技有限公司提供，實驗魚放入有循環(huán)流水養(yǎng)殖玻璃缸中（容積為260L）養(yǎng)殖。選取健康無傷的雜交鱘幼魚240尾隨機分為兩組，每組設(shè)置4個重復(fù)，每個重復(fù)放入30尾魚，平均體重為（37.5±0.0）g。實驗開始前用基礎(chǔ)飼料對雜交鱘進行2周馴養(yǎng)。實驗開始后，每日飽食飼喂雜交鱘3次（9:00、13:00、17:00），根據(jù)雜交鱘的攝食情況適當(dāng)調(diào)整投料量。實驗持續(xù)8周，整個實驗期間，維持養(yǎng)殖水溫（16.5±1.0）℃，溶氧濃度為7.8mg/L。在此過程中如有死魚，前兩周內(nèi)可以更換同樣大小的魚，兩周后記錄死亡魚數(shù)和死亡魚重量。

表1 實驗飼料的基本組成成分和營養(yǎng)成分分析

（三）測定指標及方法

1.生長性能指標測定

實驗結(jié)束后，記錄每缸魚的數(shù)量及總重，用于測定存活率、相對增重率、飼料系數(shù)、特定生長率及攝食率等指標。

存活率（SR，%）=（試驗結(jié)束尾數(shù)/試驗開始尾數(shù)）×100

相對增重率（WGR，%）=（最終體重-初始體重）/初始體重×100

飼料系數(shù)（FCR）=總投喂量/（最終體重-初始體重）

特定生長率（SGR，%/d）=100×（ln最終平均體重-ln初始平均體重）/實驗天數(shù)

攝食率（FI，%）=100×攝食飼料干重/[實驗天數(shù)×（初始體重+最終體重）/2]

2.血清非特異免疫指標測定

實驗結(jié)束禁食24h后，分別從每個養(yǎng)殖缸中隨機取3尾魚，用2mL無菌注射器自尾靜脈抽取血液置于2mL無菌離心管中，取100μL 全血置于裝有1.5% EDTA-2Na溶液的抗凝管中，用于NBT的測定，將剩余血液1500rpm，4℃離心10min，然后取上清至無菌的1.5mL離心管中，暫放于-80℃冰箱保存，用于非特異性免疫指標的測定。

（1）呼吸爆發(fā)（NBT）

全血呼吸爆發(fā)活性的測定方法參照Sahoo的硝基四氮唑藍（NBT）方法進行。在取得的100μL抗凝新鮮血液中加入100μL 0.2% NBT（nitroblue tetrazolium，sigma），37℃下孵育30min，取15μL 反應(yīng)液，加入300μL N，N-二甲基甲酰胺（DMF），充分混勻，在2000rpm，4℃條件下離心5min，取上清200μL，于540nm下讀取吸光值。

（2）溶菌酶活力（LZM）

采用透光度比色法測定溶菌酶活力。在一定濃度的混濁菌液中，由于溶菌酶能水解細菌細胞壁上肽聚糖從而使細胞裂解致使?jié)舛冉档?，透光度增強，?30nm處根據(jù)透光度的變化計算溶菌酶的含量。

（3）丙二醛（MDA）

采用比色法測定丙二醛活性，過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的丙二醛（MDA）可與硫代巴比妥酸（TBA）縮合，形成紅色降解產(chǎn)物，在532nm處為最大吸收峰換算成濃度。

（4）髓過氧化物酶（MPO）

采用比色法測定髓過氧化物酶活性，利用供氫體鄰連茴香胺供氫后生成黃色化合物，在460nm處通過比色測定此產(chǎn)物的生成量，計算MPO活力及H2O2減少的量。

（5）超氧化酶歧化酶（SOD）

采用比色法測定超氧化物歧化酶活性，利用鄰苯三酚在弱堿性環(huán)境中引發(fā)的自氧化反應(yīng)，然后生成超氧陰離子自由基（O2-·），并在其自氧化過程中產(chǎn)生有色中間產(chǎn)物，在450nm處比色測定此產(chǎn)物的生成量，推算出SOD的活力。

（6）補體C3、C4

采用免疫比濁法測定補體C3、C4，樣本中的補體C3、C4與其相應(yīng)的抗體在液相中結(jié)合，然后形成抗原-抗體復(fù)合物，該反應(yīng)會形成一定的濁度，在波長340nm條件下利用全自動生化分析儀測定補體C3、C4濃度。

（四）飼料成分分析

水分含量測定采用105℃烘干至恒重法（GB/T 6435-2006），粗蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法（GB/T 6432-2006），粗脂肪含量測定采用索氏抽提法，以石油醚作為抽提液（GB/T 6433-2006），粗灰分含量采用馬弗爐（550℃）失重法測定（GB/T 6438-2006），總能量采用燃燒法測定（IKA，C6000，Germany）。

（五）數(shù)據(jù)分析

使用STATISTIC7.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，利用單因素方差分析（one-way ANOVA），顯著差異（P<0.05）時則采用Duncan’s法進行組間的多重比較。結(jié)果以平均值標準誤（mean±SE）表示。

二、結(jié)果

（一）雜交鱘的生長性能

從表2中可以看出，棉籽糖組與對照組雜交鱘的存活率都是100%，但棉籽糖組魚體的末均重、特定生長率、相對增重率及攝食率都顯著高于對照組（P<0.05），而兩組的飼料系數(shù)沒有顯著差異（P>0.05）。

（二）雜交鱘的非特異免疫指標

從表3中可以看出，棉籽糖組血清MPO和全血NBT活力顯著高于對照組（P<0.05），但C3、C4、LZM、MDA及SOD活力與對照組之間無顯著差異（P>0.05）。

三、討論

（一）飼料中棉籽糖的添加對雜交鱘生長性能的影響

有研究指出，功能性低聚糖具有調(diào)節(jié)動物腸道微生態(tài)平衡，促進腸道中有益菌的增加，抑制腸道病原菌繁殖的作用，能提高動物體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收的能力，從而促進其生長性能。由本實驗結(jié)果可知，飼料中添加棉籽糖后能夠顯著增加雜交鱘的增重率和特定生長率。此結(jié)果與飼料中添加棉籽糖對花鱸和草魚的生長具有促進作用的結(jié)果相一致。Yan等的研究結(jié)果表明，飼料中添加1200mg/kg棉籽糖飼喂草魚70天后能顯著提高魚體的特定生長率。葛紅云等研究結(jié)果指出飼喂添加棉籽糖的飼料112天后，能顯著增加花鱸的增重率。Mette等研究表明，與對照組相比飼料中添加棉籽糖后大西洋鮭魚的特定生長率有顯著提高的趨勢。綜合上述實驗結(jié)果，說明添加棉籽糖具有促進雜交鱘魚體生長的作用。

表2 棉籽糖對雜交鱘生長性能的影響

表3 棉籽糖對雜交鱘非特異性免疫指標影響

（二）飼料中棉籽糖的添加對雜交鱘非特異性免疫的影響

魚類屬于較低等的變溫脊椎動物，由于其特異性免疫應(yīng)答能力相對低下，故而非特異性免疫在免疫防御中具有重要的意義。

呼吸爆發(fā)是通過具有吞噬功能的細胞利用活性氧殺傷分子，將侵入機體的病原菌吞噬后使膜內(nèi)結(jié)合的NAD（P）H氧化酶可以將分子氧轉(zhuǎn)化為超氧陰離子（O2-·）的過程。呼吸爆發(fā)活性不僅與魚類非特異性免疫能力正相關(guān)，它還是衡量吞噬細胞殺菌能力的一個直觀指標。本實驗中，投喂棉籽糖后，雜交鱘呼吸爆發(fā)活性顯著高于對照組。說明飼料中添加棉籽糖后，能夠顯著增加雜交鱘魚體的吞噬細胞對入侵病原的吞噬作用，從而提升細胞的免疫能力。

補體系統(tǒng)是機體非特異性免疫的重要組成部分。補體是由多種具有酶活性的球蛋白組成，具有增強體液和細胞介導(dǎo)的特異性免疫。補體C3在補體系統(tǒng)各成分中含量最多，對于魚類是一種重要的防御機制，在溶菌殺菌、免疫調(diào)節(jié)以及免疫復(fù)合物溶解等方面具有生物學(xué)功效。補體C4是一種多功能β1-球蛋白，能夠在補體活化、促進細胞吞噬功能、防止免疫復(fù)合物沉著以及中和病毒等方面發(fā)揮一定的作用。在本研究中，棉籽糖的添加對雜交鱘血清中C3、C4含量均無顯著影響。Maqsood等研究，飼料中添加葡聚糖對鯉魚血清中C3、C4含量無顯著影響；姜娜等研究也表明殼聚糖的添加對血鸚鵡魚血清中C3、C4含量均無顯著影響，與本實驗的結(jié)果一致。而周顯青等研究發(fā)現(xiàn)維生素C只有在一定劑量范圍內(nèi)才能促進補體C3和C4合成，低于此范圍對補體的產(chǎn)生無影響，高于此范圍則產(chǎn)生抑制作用，且此劑量范圍在不同動物間存在一定差異。因此本實驗中補體C3和補體C4的研究結(jié)果可能就與棉籽糖的添加量有關(guān)，但其相關(guān)的機理尚需要進一步的研究和驗證。

丙二醛是自由基氧化的終產(chǎn)物，不僅能夠反映機體內(nèi)脂質(zhì)的過氧化程度，還會間接反映出機體組織細胞的氧化損傷程度，因此，測定魚體丙二醛活性能夠較準確的反應(yīng)出其機體的自由基代謝狀況以及機體組織的損傷情況，故而，測定丙二醛活性對于判斷魚體的健康狀況具有較為重要的意義。作為動物機體中重要的抗氧化酶，超氧化物歧化酶對機體氧化與抗氧化平衡功能起著極為重要的作用，它能有效地清除超氧陰離子自由基，進而使自由基的形成與消除處于一種動態(tài)平衡狀態(tài)，從而消除自由基對生物分子的損傷。本試驗中，棉籽糖組血清丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性與對照組均無顯著差異，說明棉籽糖對雜交鱘機體的抗氧化能力沒有產(chǎn)生作用。

溶菌酶廣泛存在于生物體液、血清和巨噬細胞中，它是機體受到外界刺激時的一種基本防御機制，在動物免疫防御中發(fā)揮著極為重要的作用。本實驗結(jié)果顯示，飼喂棉籽糖后雜交鱘血清中溶菌酶活性與對照組沒有顯著差異。王慶奎等對點帶石斑魚的研究發(fā)現(xiàn)，飼喂當(dāng)歸多糖7d后能顯著提高魚體血漿溶菌酶活性，但隨著投喂當(dāng)歸多糖時間的增加，到21d、28d時，實驗組與對照組相比均無顯著差異。因此，本實驗中飼喂棉籽糖8周后，溶菌酶活性與對照組相比沒有差異的原因有可能是因為長期投喂棉籽糖后，機體中巨噬細胞、粒細胞等免疫細胞分泌溶菌酶的能力已經(jīng)趨于平穩(wěn)，因而投喂實驗結(jié)束后棉籽糖組魚體中的血清溶菌酶活性與對照組相比未有顯著性差異。

髓過氧化物酶是一種血紅素蛋白，它存在于中性粒細胞和單核細胞中，能夠與H2O2反應(yīng)后生成次氯酸，具有很強的殺菌作用。吞噬細胞還能夠通過髓過氧化物酶殺滅和清除病原體，因而對增強機體免疫以及抵抗病原微生物入侵等功能具有重要作用。本實驗中添加棉籽糖可以顯著增加雜交鱘血清中髓過氧化物酶活性，與Cha等的研究結(jié)果類似。這說明，本實驗添加的棉籽糖能被機體免疫系統(tǒng)所識別，可以有效地刺激巨噬細胞的活化，進而促進了白細胞中O2-的生成，從而增加了髓過氧化物酶的活性。

綜上所述，在飼料中添加適量的棉籽糖可以顯著提高雜交鱘的生長性能和呼吸爆發(fā)、髓過氧化物酶活性，但投喂時間及棉籽糖的添加量需進一步研究及優(yōu)化。