跑臺運(yùn)動對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬區(qū)Aβ含量的影響

梁艷 呂康 何標(biāo)

(安徽師范大學(xué)體育學(xué)院，安徽 蕪湖 241003)

阿爾茨海默病(AD)以異常積聚的老年斑為主要病理特征〔1〕。β淀粉樣蛋白(Aβ)主要是由淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)在β-分泌酶(BACE-1)和γ-分泌酶(PS1)的作用下生成的，因此，APP 、BACE-1和PS1含量對Aβ的生成至關(guān)重要〔2〕。Aβ生成增多和清除能力下降是導(dǎo)致腦內(nèi)Aβ異常聚集的主要原因所在。降解酶降解和跨血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)清除是機(jī)體清除Aβ的主要形式〔3〕。Aβ降解酶主要有腦啡肽酶(NEP)和胰島素降解酶(IDE)等〔4〕。低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)-1是腦內(nèi)Aβ進(jìn)入外周的主要受體，而晚期糖基化終末端產(chǎn)物受體(RAGE)是外周Aβ進(jìn)入腦內(nèi)的主要載體〔5〕。腦內(nèi)Aβ清除障礙或清除速率下降使腦內(nèi)Aβ異常聚集加快，加速了AD的病理進(jìn)程〔6〕。截至目前尚無有效治療AD的藥物及方法。已有研究證實(shí)，運(yùn)動能夠有效改善AD的學(xué)習(xí)記憶能力，延緩AD的發(fā)生〔7～9〕。但運(yùn)動延緩AD的作用機(jī)制尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過12 w中等強(qiáng)度的跑臺運(yùn)動，從Aβ的生成、降解和轉(zhuǎn)運(yùn)清除3個方面研究運(yùn)動對轉(zhuǎn)基因(Tg)APP/PS1小鼠海馬區(qū)Aβ含量的影響。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及分組 選購3月齡雄性Tg APP/PS1小鼠，置于標(biāo)準(zhǔn)動物房，適應(yīng)性喂養(yǎng)2 w后隨機(jī)分為運(yùn)動組(TE組)和安靜組(TC組)各12只。

1.2運(yùn)動干預(yù)方案 TE組給予1 w的適應(yīng)性訓(xùn)練。適應(yīng)性訓(xùn)練結(jié)束后對TE組進(jìn)行運(yùn)動干預(yù)。運(yùn)動強(qiáng)度參照文獻(xiàn)〔10〕，為最大攝氧量的45%～55%。每次訓(xùn)練持續(xù)45 min，運(yùn)動結(jié)束后小鼠為7月齡。

1.3取材 TE組末次運(yùn)動后禁食12 h，脫頸處死，分離海馬。每組取6只用于蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)，6只用于酶聯(lián)免疫吸附劑實(shí)驗(yàn)。

1.4Aβ40和Aβ42質(zhì)量濃度的檢測 按照文獻(xiàn)〔11〕操作步驟進(jìn)行。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，在450 nm波長下測定光密度D(λ)值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算質(zhì)量濃度。

1.5APP、PS1、NEP、LRP-1和RAGE蛋白相對表達(dá)水平的測定 按照文獻(xiàn)〔11〕操作步驟進(jìn)行。取適量海馬區(qū)，勻漿，離心取上清，二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和聚偏氟乙烯(PVDF)轉(zhuǎn)膜。牛奶封閉，加一抗稀釋液(LRP-1，ab92544，1∶500；RAGE，ab172473，1∶500；APP，CST2452，1∶1 000；PS1，Santa7860，1∶1 000；NEP，ab16050，1∶1 000)，孵二抗，AIpha成像系統(tǒng)曝光，ImageJ1.46進(jìn)行灰密度值分析，計算目的蛋白相對表達(dá)水平。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組海馬區(qū)APP、PS1蛋白相對表達(dá)水平 TE組APP蛋白相對表達(dá)水平(1.31±0.13)顯著低于TC組(1.78±0.13，P<0.05)。TE組PS1蛋白相對表達(dá)水平(1.05±0.30)顯著低于TC組(2.10±0.37，P<0.05)。見圖1。

2.2各組海馬區(qū)LRP-1、RAGE、NEP蛋白相對表達(dá)水平 TE組LRP-1蛋白相對表達(dá)水平(3.32±0.26)顯著高于TC組(2.66±0.38，P<0.01)。TE組RAGE蛋白相對表達(dá)水平(0.25±0.04)顯著低于TC組(0.44±0.05，P<0.01)。TE組NEP蛋白相對表達(dá)水平(1.22±0.16)顯著高于TC組(0.80±0.08，P<0.05)。見圖1。

圖1 小鼠海馬區(qū)NEP等蛋白相對表達(dá)水平

2.3各組海馬區(qū)Aβ40和Aβ42濃度 TE組海馬區(qū)Aβ42濃度〔(78.49±8.45)ng/ml〕顯著低于TC組〔(99.74±10.21)ng/ml，P<0.01〕。TE組海馬區(qū)Aβ40質(zhì)量濃度〔(693.45±309.10)ng/ml〕顯著低與TC組〔(993.87±68.56)ng/ml,P<0.05〕。

3 討 論

“Aβ學(xué)說”認(rèn)為細(xì)胞外異常聚集的Aβ是AD主要致病因素和中心環(huán)節(jié)，因此減少腦內(nèi)Aβ的異常聚集是預(yù)防AD的關(guān)鍵所在〔12〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明12 w中等強(qiáng)度的運(yùn)動干預(yù)能夠有效降低海馬區(qū)Aβ42和Aβ40濃度。研究發(fā)現(xiàn)，6 w無刺激的跑臺運(yùn)動顯著降低Tg APP/PS1小鼠海馬區(qū)Aβ40和Aβ42濃度〔13〕。也有研究證實(shí)，對Tg2576小鼠進(jìn)行長期的運(yùn)動干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動組海馬區(qū)Aβ42濃度較安靜組顯著下降〔14〕。由此可見，長期中等強(qiáng)度的跑臺運(yùn)動能夠有效降低AD小鼠海馬區(qū)Aβ40和Aβ42濃度，達(dá)到運(yùn)動預(yù)防和延緩AD的目的。

Aβ是AD的主要病理標(biāo)志之一，Aβ主要是由BACE-1和PS1切割A(yù)PP蛋白生成的〔2〕。因此，降低APP、BACE-1和PS1的含量對減少Aβ生成十分重要。Tg APP/PS1小鼠因海馬神經(jīng)元過表達(dá)APP和PS1基因，導(dǎo)致腦內(nèi)Aβ生成持續(xù)增加，6～7月齡小鼠腦內(nèi)Aβ生成增多〔15〕。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，長時間中等強(qiáng)度的運(yùn)動能夠通過抑制APP和PS1蛋白相對表達(dá)水平，減少Aβ生成。研究證實(shí)，5個月的跑臺運(yùn)動顯著降低Tg APP/PS1小鼠海馬區(qū)APP的磷酸化水平和PS1蛋白相對表達(dá)水平〔16〕。上述研究結(jié)果提示，長期中等強(qiáng)度的運(yùn)動可能通過抑制APP和PS1蛋白相對表達(dá)水平抑制Aβ的生成。

腦內(nèi)Aβ的清除速率慢于Aβ的生成時，Aβ異常聚集加快，誘發(fā)AD〔17〕。腦內(nèi)Aβ清除能力下降是遲發(fā)型AD的主要病因。因此，加速Aβ的清除能夠有效延緩AD的病理進(jìn)程。運(yùn)動可以提高Aβ降解酶NEP活性加速海馬區(qū)Aβ的清除〔18〕。而5個月的自主跑輪運(yùn)動顯著提高Tg APP/PS1小鼠海馬區(qū)NEP的活性〔19〕。由此可見，長期的跑臺(或跑輪)運(yùn)動可以通過增強(qiáng)NEP的活性降低Tg APP小鼠海馬Aβ濃度，推測可能是運(yùn)動增加Tg APP小鼠海馬區(qū)NEP蛋白相對表達(dá)水平和NEP的活性，加速了Aβ降解，但具體的分子機(jī)制還需進(jìn)一步證實(shí)。

腦內(nèi)Aβ的清除主要依靠降解酶和跨血腦屏障兩種途徑，降解酶系統(tǒng)僅能清除少量的Aβ，而跨血腦屏障(BBB)轉(zhuǎn)運(yùn)清除途徑能夠清除腦內(nèi)大部分的Aβ〔20〕,提高Aβ的外流速率可以有效降低腦內(nèi)Aβ的含量〔21〕。LRP-1是Aβ由腦內(nèi)運(yùn)至外周組織的主要載體，其功能異常降低Aβ的外流速率〔22〕。而RAGE則是Aβ通過BBB進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)的功能載體〔22〕。本研究結(jié)果提示，跑臺運(yùn)動能夠降低Tg APP/PS1小鼠海馬區(qū)RAGE蛋白相對表達(dá)水平，降低外周血液Aβ的入腦速率。對側(cè)腦室注射Aβ25～35導(dǎo)致AD小鼠進(jìn)行12 d的自主跑輪運(yùn)動后發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動組海馬區(qū)RAGE蛋白相對表達(dá)水平顯著降低〔23〕。也有研究證實(shí)，長期中等強(qiáng)度的跑臺干預(yù)對Tg APP/PS1小鼠海馬區(qū)RAGE蛋白相對表達(dá)水平?jīng)]有產(chǎn)生影響〔16〕。導(dǎo)致上述研究結(jié)果不一致的原因可能是采用的實(shí)驗(yàn)動物模型不同導(dǎo)致的。Tg APP/PS1小鼠病理特征主要以海馬區(qū)Aβ生成增多為主，隨著病理進(jìn)程的不斷發(fā)展，海馬區(qū)纖維狀A(yù)β數(shù)量和老年斑沉積水平逐漸增多〔24〕。而側(cè)腦室注射Aβ25～35導(dǎo)致的AD小鼠，主要表現(xiàn)為海馬區(qū)Aβ濃度較野生型小鼠高，海馬區(qū)纖維狀A(yù)β數(shù)量和老年斑沉積水平均少于Tg APP/PS1小鼠。另外，Tg APP/PS1小鼠海馬區(qū)Aβ濃度的增加是隨著小鼠月齡的增長而緩慢增長的，而側(cè)腦室注射Aβ25～35導(dǎo)致的AD小鼠，海馬區(qū)Aβ濃度在短時間急劇增加，短時間急劇增加的Aβ可能導(dǎo)致機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)，引起機(jī)體的生理變化和部分功能蛋白相對表達(dá)水平的改變。此外，不同的訓(xùn)練方式可能也是引起上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同的原因所在，相對于自主跑輪運(yùn)動，跑臺運(yùn)動的強(qiáng)度較大，雖然自主跑輪運(yùn)動強(qiáng)度小于跑臺運(yùn)動，但對實(shí)驗(yàn)動物而言，自主運(yùn)動帶來的外界刺激遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于跑臺運(yùn)動〔25〕。

本實(shí)驗(yàn)推測，運(yùn)動可能通過上調(diào)海馬區(qū)LRP-1蛋白相對表達(dá)水平，下調(diào)了RAGE蛋白相對表達(dá)水平，提高了Aβ跨BBB轉(zhuǎn)運(yùn)清除速率。研究結(jié)果證實(shí)〔16〕，對4月齡Tg APP/PS1小鼠進(jìn)行10 w的跑臺運(yùn)動后發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動組海馬區(qū)LRP-1蛋白相對表達(dá)水平顯著高于安靜組小鼠，提示中等強(qiáng)度的跑臺運(yùn)動通過提高Tg APP/PS1小鼠Aβ外轉(zhuǎn)蛋白相對表達(dá)水平，降低Aβ內(nèi)轉(zhuǎn)蛋白相對表達(dá)水平，加速 Aβ跨BBB轉(zhuǎn)運(yùn)清除速率。

綜上，推測長期中等強(qiáng)度的跑臺運(yùn)動通過減少海馬區(qū)Aβ的生成、提高Aβ的降解和加速Aβ跨血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)清除速率3條途徑，達(dá)到降低海馬Aβ質(zhì)量濃度，延緩AD的病理進(jìn)程的目的。