延胡索乙素對乳鼠海馬神經(jīng)元缺氧缺糖損傷保護作用的研究

甘椿椿1 金 湛1 汪琴猛2 陳 高1 金美花3

1.衢州職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 衢州 324000；2.浙江巨泰藥業(yè)有限公司，浙江 衢州 324000； 3.天津醫(yī)科大學(xué)，天津 300070

缺血性腦血管病為臨床常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，約占腦血管疾病的85%，其病死率僅次于心臟病、腫瘤，是造成人類死亡的主要疾病之一[1]。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后大部分血管能自然再通或經(jīng)溶栓治療恢復(fù)再通，但同時也會造成進一步腦損傷和功能障礙，即腦缺血再灌注損傷[2]。許多研究證明，很多中藥中的有效成分對防治腦缺血損傷具有良好的療效，可通過調(diào)控腦缺血損傷的相關(guān)信號通路，減少炎癥級聯(lián)反應(yīng)等方式減少腦缺血再灌注損傷。

海馬結(jié)構(gòu)正常和功能完整是人類學(xué)習(xí)記憶的基礎(chǔ)，海馬神經(jīng)元損傷與腦卒中認知功能障礙的發(fā)病密切相關(guān)[3]。在腦缺血再灌注損傷中，海馬神經(jīng)元是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最易受累的腦區(qū)，對于缺血缺氧最為敏感，對缺血缺氧的耐受性差。取乳鼠海馬神經(jīng)元體外培養(yǎng)，既可重現(xiàn)其體內(nèi)生長過程，也易于使用各種技術(shù)檢測相關(guān)指標，能夠直觀反映藥物治療腦缺血再灌注損傷的效果，因此乳鼠海馬神經(jīng)元細胞是體外研究腦缺氧缺血再灌注損傷常用的模型[4]。

延胡索為罌粟科植物延胡索的干燥塊莖，具有活血、利氣、止痛的功效，臨床常用于胸脅、脘腹脹痛、經(jīng)閉痛經(jīng)、產(chǎn)后瘀阻和跌打腫痛等[5]。延胡索乙素作為延胡索的主要有效成分之一，在藥材以及制劑中常作為控制指標。已有研究證明延胡索乙素對中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心腦血管都有一定的預(yù)防和保護作用[6]。延胡索的中藥復(fù)方制劑有很多，例如玄歸止痛滴丸、玄胡索散等，均有活血止痛的作用，但是關(guān)于腦缺血的研究未見報到，筆者以體外乳鼠海馬神經(jīng)元細胞為研究對象，探討延胡索乙素對乳鼠海馬神經(jīng)元細胞因缺糖缺氧所致?lián)p傷的保護作用，為進一步開發(fā)延胡索及其復(fù)方制劑抗腦缺血研究提供一定的實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 DMI4000B熒光倒置顯微鏡(德國徠卡公司)，LDZ5-2型低速自動平衡離心機(北京京立離心機有限公司)，Molecular Devices SpectraMAX Plus 384酶標儀(美國MD公司)。

1.2 藥品與試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco公司)；BCA (bicinchoninic acid)蛋白濃度測定試劑盒，超氧化物歧化酶(super oxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、一氧化氮(nitric oxide，NO)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 動物 SD乳鼠，雌雄兼用，1～3日齡，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心提供，許可證號SCXK(滬) 2008-0016(上海西普爾必凱實驗動物有限公司)。

2 方法

2.1 海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)[7]取新生24 h的乳鼠放進75%乙醇內(nèi)浸泡消毒，在無菌條件下分離出雙側(cè)海馬，充分剪碎，加入同體積0.25% 胰蛋白酶消化20 min，用含10% 胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基終止消化，處理后放入37 °C、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于24 h后全量換液(置換后的培養(yǎng)液由97% Neurobasal，2% B27，1% L-谷氨酰胺組成)，之后每3天半量換液。在海馬神經(jīng)元細胞接種3 d后加入終濃度為10 μmol/L的阿糖胞苷，以抑制非神經(jīng)元細胞生長。培養(yǎng)8 d后建立海馬神經(jīng)元缺氧缺糖細胞模型，并檢測相關(guān)指標。

2.2 實驗分組以及配藥 經(jīng)過CCK-8(Cell Counting Kit-8)法確定延胡索乙素濃度在0～100 μg/mL內(nèi)是非細胞毒劑量。取培養(yǎng)8 d生長成熟的海馬神經(jīng)元細胞，分為正常組、模型組、延胡索乙素低、中、高劑量組(2、4、8 μg/mL)、陽性對照藥尼莫地平組(8 μg/mL)。按照上述比例配置所需各濃度藥物，除正常組加入無糖DMEM/F12完全培養(yǎng)基外，其余各組均采用無糖Earle’s培養(yǎng)基與相應(yīng)濃度的藥物配置。

2.3 乳鼠海馬神經(jīng)元細胞缺氧缺糖模型的建立 取培養(yǎng)8 d生長成熟的海馬神經(jīng)元細胞，按1×106個/mL的密度接種于6孔板，隨后將原培養(yǎng)液吸出，以PBS洗滌兩次，加入含有相應(yīng)濃度藥物的無糖Earle’s培養(yǎng)基，除正常組外，其余各組均放置于缺氧裝置中，持續(xù)通入包含95%氮氣和5%二氧化碳的混合氣體，直至充滿裝置，封口膜密封，放入37 °C恒溫箱孵育4 h。4 h后取出，在倒置顯微鏡下觀察每組細胞形態(tài)。

2.4 生化指標的測定 按照“2.3”所述方法建立海馬神經(jīng)元細胞缺氧缺糖模型，隨后取各組細胞上清液，同時收集各組細胞并破碎，采用BCA法檢測蛋白含量。按照各試劑盒說明書，檢測細胞上清液中LDH含量以及各組細胞中SOD、GSH-PX、NOS活性和NO、MDA等生化指標含量。

2.5 細胞早期凋亡率的測定 將培養(yǎng)8 d生長成熟的海馬神經(jīng)元細胞，以0.25% 胰酶消化，制成細胞懸液，以3×105個/mL密度接種到12孔板，每孔終體積0.75 mL，分組情況同“2.2”項分組方法一致，每組設(shè)3個復(fù)孔，0.25% 胰酶消化收集各組細胞，PBS洗兩次，細胞密度調(diào)整為1×106個/mL。試管中加入100 μL細胞懸液。加入Annexin V-FITC/PI染料各5 μL后，輕輕混勻，室溫避光放置15 min，最后各試管中分別加入1×Binding-Buffer緩沖液。

3 結(jié)果

3.1 延胡索乙素對海馬神經(jīng)元細胞形態(tài)學(xué)的影響 正常組的海馬神經(jīng)元呈錐形或多極性，胞體飽滿清晰、有明顯光暈，有強折光性及立體感；神經(jīng)元突起相互交織成網(wǎng)狀，細胞核明顯可見(圖1A)。模型組神經(jīng)元腫脹或變形，突起縮短并逐漸消失，胞質(zhì)內(nèi)顆粒變性明顯、光暈減弱，神經(jīng)元內(nèi)甚至出現(xiàn)了空泡物質(zhì)，神經(jīng)元損傷嚴重(圖1B)；延胡索乙素中、高劑量組(4、8 μg/mL)以及陽性藥尼莫地平組(8 μg/mL)海馬神經(jīng)元形態(tài)較完整，光暈減弱現(xiàn)象較輕，胞體內(nèi)空泡物質(zhì)減少(圖1D，E和F)。其中延胡索乙素中、高劑量組海馬神經(jīng)元形態(tài)明顯較好，說明延胡索乙素能夠明顯降低缺氧缺糖對海馬神經(jīng)元細胞的損害。如圖1所示。

3.2 延胡索乙素對相應(yīng)生化指標的影響 與正常組相比，模型組的LDH的釋放量增加(P<0.01)，而SOD、NOS、GSH-PX的活性降低(P<0.01)，同時NO、MDA的含量明顯增加(P<0.01)。與模型組相比，延胡索乙素的中、高劑量組(4、8 μg/mL)能有效抑制LDH的釋放(P<0.01)，且SOD、NOS、GSH-PX的活性增加(P<0.01)，同時NO、MDA的含量顯著降低(P<0.01)，但是延胡索乙素的低劑量組的LDH的釋放量，SOD、NOS、GSH-PX的活性與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而NO、MDA的含量與模型組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1、表2。上述延胡索乙素中、高劑量組的生化指標的改變證明延胡索乙素能有效改善缺氧缺糖環(huán)境下腦組織的微環(huán)境。

組別給藥劑量NO/μmol/mgNOS/μmol/mgGSH-PX/U/mg正常組2.14±0.121.18±0.26182.70±6.38模型組5.81±0.231)6.05±0.581)62.33±4.481)延胡索乙素2 μg/mL5.44±0.272)5.82±0.2166.58±2.694 μg/mL4.15±0.133)4.68±0.253)103.65±6.353)8 μg/mL3.05±0.213)2.99±0.183)136.26±7.873)尼莫地平8 μg/mL4.60±0.193)3.28±0.263)121.36±5.383)

注: 與正常組比較，1)P<0. 01; 與模型組比較，2)P<0. 05，3)P<0. 01。

組別給藥劑量SOD/U/mgMDA/nmol/mgLDH/U/L正常組85.36±4.0116.23±2.5653.48±2.88模型組32.17±3.581)48.26±3.921)132.73±3.681)延胡索乙素2 μg/mL38.25±3.0236.62±2.583)126.31±5.854 μg/mL51.36±2.363)28.65±2.513)96.30±3.423)8 μg/mL66.52±2.983)22.47±3.523)74.58±3.853)尼莫地平8 μg/mL54.35±1.833)27.58±1.783)82.52±2.823)

注: 與正常組比較，1)P<0. 01; 與模型組比較，2)P<0. 05，3)P<0. 01。

3.3 延胡索乙素對海馬神經(jīng)元細胞早期細胞凋亡的影響 Annexin V-FITC/PC雙染色法檢測細胞凋亡，在此雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，為(FITC-/PI-)；右 下象限為早期凋亡細胞，顯現(xiàn)(FITC + /PI-)；右上象限是非活細胞，即壞死細胞，為(FITC + /PI-)，詳細結(jié)果如圖2所示。各組早期細胞凋亡的數(shù)據(jù)見表3，與模型組相比，延胡索乙素中、高劑量組能有效抑制細胞的早期凋亡(P<0. 01)，并存在一定的劑量依賴性。以上數(shù)據(jù)說明延胡索乙素中、高劑量組能夠顯著抑制缺氧缺糖損傷海馬神經(jīng)元的早期凋亡進程。

表3 延胡索乙素對細胞早期凋亡率的影響

注: 與正常組比較，1)P<0. 01; 與模型組比較，2)P<0. 05，3)P<0. 01。

4 討論

海馬神經(jīng)細胞體外生存能力較為脆弱，取材、種植、飼養(yǎng)、消化、凍存過程中需要注意以下關(guān)鍵環(huán)節(jié)：取材時為了保持組織的低基礎(chǔ)代謝率，海馬組織需放在冰浴的D-hanks液中。根據(jù)組織塊剪切的大小和量確定加胰蛋白酶的量、濃度、消化時間等，消化細胞時一定要在鏡下觀察消化情況防止消化過頭。阿糖胞苷需要選取專用于細胞培養(yǎng)級別的，而非用于臨床治療的[7]。

腦缺血發(fā)生后，多種因素以及多種損失機制共同影響機體的各項功能正常運轉(zhuǎn)，本研究證明了延胡索乙素能有效減輕由氧化應(yīng)激以及細胞凋亡而導(dǎo)致腦缺血損傷。MDA是自由基對內(nèi)皮細胞損害后，引起生物膜上不飽和脂肪酸脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終代謝產(chǎn)物，常用來反映組織脂質(zhì)過氧化損傷的程度[8]。而SOD作為目前發(fā)現(xiàn)的人體唯一的負氧離子天然酶類清除劑，其活性高低亦可間接反映組織自由基的含量[9]。LDH水平的增高是細胞受損的一個敏感指標，它能一定程度上反映細胞的損傷程度[10]。GSH-PX是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，能清除過氧化物代謝產(chǎn)物，阻斷脂質(zhì)過氧化鏈鎖反應(yīng)，從而起到保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用[11]。

目前研究發(fā)現(xiàn)，NO參與缺血性腦血管疾病的整個病理生理過程。在病理狀態(tài)下當NO產(chǎn)生過多時，它又是一種自由基，可造成膜脂質(zhì)過氧化并且反應(yīng)生成毒性更大的超氧自由基,引起廣泛的脂質(zhì)過氧化及蛋白質(zhì)酪氨酸硝基化反應(yīng),誘導(dǎo)DNA損傷。NO參與缺血性腦血管疾病表現(xiàn)為雙重作用，這主要催化NO生物合成的酶NOS所決定的。NOS以L2精氨酸(LZArg)和分子氧為底物，催化兩個等價的肌基氮之一，經(jīng)氧化反應(yīng)生成NO和LZ肌氨酸。NOS是NO合成過程中的重要限速因素，體內(nèi)NO的生物作用完全依賴于NOS的活性[12]。

細胞凋亡是指機體受到損傷時，為維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，細胞在基因調(diào)控下的主動程序性死亡。Annexin V-FITC/PC雙染色法檢測以此現(xiàn)象為基礎(chǔ)，對早期凋亡的細胞進行檢測，從而通過細胞凋亡率反映出腦缺血損失的程度。

實驗結(jié)果表明延胡索乙素使造模后細胞內(nèi)SOD活性增加，MDA水平下降，LDH釋放量減少，該結(jié)果表明延胡索乙素對海馬神經(jīng)元的保護作用可能與抗氧化損傷作用有關(guān)，一定程度上顯現(xiàn)了對氧化損傷的保護作用；延胡索乙素可以使缺氧缺糖時細胞內(nèi)GSH-PX水平下降，起到保護細胞的作用；一定程度上能降低缺氧缺糖時NO、NOS的水平。綜上所述，延胡索乙素對腦缺血損失有非常顯著的保護作用，它可以保護細胞膜的完整性，減少損傷時細胞膜的通透性，增強機體抗氧自由基的能力，減少脂質(zhì)過氧終產(chǎn)物的生成，減輕細胞早期凋亡，有效對抗腦缺血損失，延胡索乙素在腦缺血疾病的治療中有著非常寬廣的應(yīng)用領(lǐng)域。