HPLC法測(cè)定云南不同產(chǎn)地白花蛇舌草中齊墩果酸和熊果酸含量

楊新周， 吳 娜， 邱曉雪

(1.德宏師范高等?？茖W(xué)校 理工學(xué)院, 云南 德宏 678400； 2.紅河學(xué)院 理學(xué)院， 云南 蒙自 661199； 3.德宏師范高等?？茖W(xué)校 民族醫(yī)藥研究所, 云南 德宏 678400)

白花蛇舌草(HedyotisdiffusaWilld)又叫蛇舌草、蛇總管、蛇痢草、二葉等，屬茜草科(Rubiaceae)耳草屬植物[1]，分布于世界各地，在我國(guó)主要產(chǎn)自福建、廣東、香港、廣西、海南、安徽、云南等省區(qū)，有清熱解毒、活血止痛、利尿消腫等功效。臨床上用于治療咽喉腫痛、闌尾炎、毒蛇咬傷、盆腔炎、尿路感染、小便不利、菌痢等病癥[2]。白花蛇舌草中主要含有無(wú)機(jī)元素、多糖類、三萜類、有機(jī)酸類、黃酮類、蒽醌類、烷烴類、甾醇類、環(huán)烯醚苷萜類、生物堿等化學(xué)成分，也含有一些微量元素、氨基酸及揮發(fā)性成分[3-4]。其中，齊墩果酸和熊果酸是其主要藥用成分，具有顯著的抗菌、消炎、抗癌、抗突變、抗氧化等藥理作用[5]。有關(guān)白花蛇舌草的研究主要集中在成分組成、藥理活性以及有效成分提取等方面。近年來(lái)為了進(jìn)一步開發(fā)白花蛇舌草，使其在臨床上得到更合理充分的利用，對(duì)其中熊果酸和齊墩果酸含量測(cè)定方法的研究越來(lái)越受到重視，越來(lái)越多的學(xué)者研究不同方法同時(shí)測(cè)定兩種物質(zhì)的含量[5-8]。高效液相色譜法是檢測(cè)白花蛇舌草中齊墩果酸和熊果酸含量最常用的方法[6-7,9-10]。由于齊墩果酸和熊果酸互為同分異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)、性質(zhì)非常相似，難以分離。近年來(lái)雖然廣泛用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，但是由于流動(dòng)相組成復(fù)雜，出峰時(shí)間長(zhǎng)，峰形和分離度均不夠理想，從而影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，分離及含量分析還需進(jìn)一步深入探究。為此，筆者等以乙醇為溶劑結(jié)合超聲波提取進(jìn)行樣品前處理，通過(guò)改變優(yōu)化色譜條件，建立分離效果較好的高效液相色譜分析方法，并用該法測(cè)定云南不同產(chǎn)地白花蛇舌草中齊墩果酸和熊果酸的含量，以期為白花蛇舌草的質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

藥材：白花蛇舌草樣品，采集于云南省不同地區(qū)，經(jīng)德宏師范高等?？茖W(xué)校鑒定為茜草科耳草屬植物白花蛇舌草，其詳細(xì)信息見表1。

表1 白花蛇舌草樣品采集信息

儀器：高效液相色譜儀( Agilent 1100)，超聲波清洗器(SK7200LHC，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)，色譜柱ZORBAX Eclipse XBD-C18柱(4.6×150 mm, 5 μm)，恒溫水浴鍋(B-260，上海亞榮生化儀器廠)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(N-1100，上海愛朗儀器有限公司)，電子天平(CP224C，奧豪斯儀器上海有限公司)。

試劑：齊墩果酸、熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品(北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司)，色譜純甲醇和乙腈、冰乙酸(GR)、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鉀等為分析純，娃哈哈純凈水。

1.2方法

1.2.1樣品的制備將采集的樣品自然陰干，粉碎，過(guò)0.3 mm孔徑篩子，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2高效液相色譜檢測(cè)條件的優(yōu)化

1) 流動(dòng)相的選擇。在液相色譜柱溫為20℃，進(jìn)樣量30 μL，流速1 mL/min條件下，分別考察甲醇-2%冰乙酸水溶液(88∶12)、甲醇-3%冰乙酸水溶液(88∶12)、乙腈-2%冰乙酸水溶液(60∶40)、乙腈-磷酸鉀鹽緩沖液(pH 8左右)(60∶40)等流動(dòng)相對(duì)分離效果的影響。

2) 柱溫的選擇。以甲醇-2%冰乙酸(88∶12)為流動(dòng)相，進(jìn)樣量30 μL，流速1 mL/min，考察柱溫分別為35℃、30℃、25℃和20℃時(shí)的分離效果。

3) 進(jìn)樣量的選擇。以甲醇-2%冰乙酸(88∶12)為流動(dòng)相，色譜柱溫20℃，流速1 mL/min，考察進(jìn)樣量分別為20 μL、30 μL和50 μL的分離效果。

4) 流速的選擇。以甲醇-2%冰乙酸(88∶12)為流動(dòng)相，色譜柱溫20℃，進(jìn)樣量30 μL，考察流速分別為1 mL/min和0.8 mL/min的分離效果

5) 流動(dòng)相比例的選擇。在液相色譜柱溫20℃，進(jìn)樣量30 μL，流速1 mL/min條件下，考察甲醇-2%冰乙酸流動(dòng)相比例為90∶10、88∶12、85∶15和50∶50對(duì)分離效果的影響。

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1) 單一標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。分別精確稱取0.020 0 g齊墩果酸和0.020 0 g熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，定容，得到濃度為0.8 μg/μL的齊墩果酸和熊果酸的單一標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2) 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的制備。取齊墩果酸和熊果酸單一標(biāo)準(zhǔn)溶液各5.00 mL置于10 mL容量瓶中，定容，超聲使其充分混合，得齊墩果酸和熊果酸濃度均為0.4 μg/μL的混和標(biāo)溶液待用。

3) 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備。取所配制的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，采用逐級(jí)稀釋法，配制濃度范圍為0.025～0.4 μg/μL的齊墩果酸和熊果酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，測(cè)定前用0.45 μm微孔濾膜(有機(jī)系)過(guò)濾，進(jìn)行檢測(cè)。

4) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。將所配制的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液在最佳色譜條件下，從低濃度至高濃度依次進(jìn)樣分析，以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到齊墩果酸、熊果酸線性回歸方程。

1.2.4樣品前處理精密稱取白花蛇舌草樣品粉末0.300 0 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入40 mL乙醇，超聲提取30 min。冷卻至室溫后過(guò)濾，將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮近干，再用乙醇定容至2 mL，通過(guò)0.45 μm微孔濾膜(有機(jī)系)過(guò)濾，將濾液置于2 mL進(jìn)樣瓶中待測(cè)(置于冰箱中冷藏保存)。照上述步驟制備云南7個(gè)不同產(chǎn)地的白花蛇舌草樣品溶液待測(cè)。

1.2.5系統(tǒng)方法學(xué)考察

1) 儀器精密度。將1.2.4配制的第7號(hào)(玉溪市元江縣咪哩鄉(xiāng))白花蛇舌草樣品溶液在最佳色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣分析3次，計(jì)算齊墩果酸和熊果酸峰面積的RSD。

2) 加標(biāo)回收率。稱取10份第7號(hào)樣品，每份質(zhì)量為0.300 0 g，分別加入不同量的齊墩果酸和熊果酸，同1.2.4步驟提取制備加標(biāo)樣品溶液，每個(gè)加標(biāo)量(齊墩果酸不同加標(biāo)量分別為137.60 μg、168.00 μg、199.20 μg，熊果酸不同加標(biāo)量分別為127.20 μg、148.40 μg、174.90 μg)作3次平行試驗(yàn)。將10組加標(biāo)樣品溶液在最佳色譜條件下逐一進(jìn)樣分析，分別計(jì)算樣品加標(biāo)回收率。

1.2.6樣品檢測(cè)將所制備的云南7個(gè)不同產(chǎn)地的白花蛇舌草樣品溶液在優(yōu)化的最佳檢測(cè)條件下依次進(jìn)樣分析。

2結(jié)果與分析

2.1檢測(cè)條件的優(yōu)化

2.1.1流動(dòng)相種類試驗(yàn)表明，以乙腈-磷酸鉀鹽作為緩沖液(pH 8左右)、乙腈-2%冰乙酸作為流動(dòng)相時(shí)，單標(biāo)、混標(biāo)及樣品溶液都不出峰；但甲醇-2%冰乙酸作流動(dòng)相對(duì)齊墩果酸和熊果酸分離效果相對(duì)較好，故選擇甲醇-2%冰乙酸作為流動(dòng)相。

2.1.2柱溫柱溫也是目標(biāo)化合物分離效果的一個(gè)影響因素。當(dāng)柱溫在25℃、30℃、35℃齊墩果酸和熊果酸分離度均小于1，而當(dāng)柱溫為20℃時(shí)，分離度為1.329，此時(shí)齊墩果酸和熊果酸的分離效果相對(duì)較好，故選擇柱溫為20℃。

2.1.3進(jìn)樣量進(jìn)樣量的大小影響目標(biāo)化合物的峰面積和分離度。進(jìn)樣量為20 μL、30 μL和50 μL時(shí)，分離度分別為0.814、1.329和0.937，當(dāng)進(jìn)樣量為30 μL時(shí)，齊墩果酸和熊果酸分離度最大，說(shuō)明分離效果相對(duì)較好。故選擇30 μL作為進(jìn)樣量。

2.1.4流速流速的快慢不僅影響目標(biāo)化合物的出峰時(shí)間，也影響分離效果。試驗(yàn)表明，流速為0.8 mL/min和1 mL/min時(shí)，分離度分別為1.048和1.329，當(dāng)流速為1 mL/min齊墩果酸和熊果酸的分離度高、出峰快，即對(duì)齊墩果酸和熊果酸的分離效果相對(duì)較好，故選擇流速為1 mL/min。

2.1.5流動(dòng)相比例當(dāng)流動(dòng)相比例為50∶50時(shí)，目標(biāo)化合物沒有出峰；流動(dòng)相比例為90∶10、88∶12時(shí)熊果酸和齊墩果酸的分離度小于比例為85∶15時(shí)的分離度，在流動(dòng)相比例為85∶15時(shí)，齊墩果酸和熊果酸分離度最大，分離效果相對(duì)較好，故甲醇-2%冰乙酸的比例為85∶15。

2.2線性回歸方程

齊墩果酸和熊果酸線性回歸方程分別為Y=12 756X+86.98(R2=0.999 2)和Y=12 347X+78.029(R2=0.999 4)。說(shuō)明齊墩果酸和熊果酸在0.025～0.4 μg/μL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。單一標(biāo)準(zhǔn)溶液和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在檢測(cè)條件下，得到色譜圖對(duì)比圖。從圖1可以看出，齊墩果酸保留時(shí)間比熊果酸短，可以確定齊墩果酸先出峰，熊果酸后出峰，且保留時(shí)間分別為16.506 min和17.229 min，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖中得出齊墩果酸和熊果酸分離效果好，可實(shí)現(xiàn)同時(shí)測(cè)定。

注：1，齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品；2,熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品；3和4分別齊墩果酸和熊果酸混標(biāo)

Note:1,Oleanolic acid standard; 2,Ursolic acid standard; 3 and 4,oleanolic acid and ursolic acid mixed standard

圖 1齊墩果酸和熊果酸的HPLC色譜圖

Fig.1 HPLC chromatogram of oleanolic acid and ursolic acid

2.3方法學(xué)考察

經(jīng)測(cè)定，齊墩果酸和熊果酸峰面積的RSD分別為1.2%和1.01%，均小于2%，表明儀器精密度良好。加標(biāo)回收率試驗(yàn)表明，齊墩果酸的加標(biāo)回收率在82.26%～88.01%，平均回收率為85.57%，RSD為2.77%；熊果酸的加標(biāo)回收率在80.84%～93.08%，平均回收率為84.93%，RSD為4.47%。兩者的RSD均小于5%，說(shuō)明方法準(zhǔn)確度良好。

2.4樣品含量的測(cè)定

從表2可知，云南省7個(gè)不同產(chǎn)區(qū)白花蛇舌草均含有熊果酸和齊墩果酸，7個(gè)不同產(chǎn)區(qū)齊墩果酸含量在0.139 7～0.523 8 mg/g，平均值為0.409 6 mg/g，其中，普洱市景谷縣景谷鎮(zhèn)和紅河州個(gè)舊市大屯鎮(zhèn)產(chǎn)白花蛇舌草中齊墩果酸含量最高，均為0.523 8 mg/g，德宏州芒市江東鄉(xiāng)齊墩果酸含量最低，為0.139 7 mg/g。云南不同產(chǎn)區(qū)熊果酸含量在0.656 6～2.645 6 mg/g，平均值為1.888 8 mg/g，其中普洱市鎮(zhèn)沅縣者東鎮(zhèn)產(chǎn)白花蛇舌草含量最大，為2.645 6 mg/g，德宏州芒市江東鄉(xiāng)齊墩果酸含量最低，為0.6566 mg/g。

表2云南不同產(chǎn)區(qū)白花蛇舌草樣品中齊墩果酸和熊果酸的含量

Table 2 Contents of oleanolic acid and ursolic acid inH.diffusafrom different habitats in Yunnan mg/g

樣品序號(hào)Sample No.齊墩果酸含量Oleanolic acid熊果酸含量Ursolic acid10.139 70.656 620.439 32.187 730.523 82.007 340.437 72.645 650.523 82.004 360.492 72.165 870.310 31.554 6

3結(jié)論與討論

試驗(yàn)表明，HPLC法檢測(cè)7個(gè)不同產(chǎn)區(qū)白花蛇舌草中均含有齊墩果酸和熊果酸含量的最佳條件為 ZORBAX Eclipse XBD-C18柱(4.6×150 mm, 5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-2%冰乙酸水溶液(85∶15)，柱溫為20℃，流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，進(jìn)樣量為30 μL。在優(yōu)化條件下，齊墩果酸和熊果酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在0.025～0.4 μg/μL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，且齊墩果酸加標(biāo)回收率在82.26%～88.01%，RSD為2.77%；熊果酸加標(biāo)回收率在80.84%～93.08%，RSD為4.47%。方法的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度均良好。采用該法對(duì)7個(gè)不同產(chǎn)區(qū)白花蛇舌草中均含有齊墩果酸和熊果酸，但含量存在差異，7個(gè)不同產(chǎn)區(qū)齊墩果酸含含量在0.139 7～0.523 8 mg/g，平均值為0.409 6 mg/g；熊果酸含量在0.656 6～2.645 6 mg/g，平均值為1.888 8 mg/g。其中普洱市景谷縣景谷鎮(zhèn)和紅河州個(gè)舊市大屯鎮(zhèn)產(chǎn)白花蛇舌草中齊墩果酸含量最高，為0.523 8 mg/g。洱市鎮(zhèn)沅縣者東鎮(zhèn)產(chǎn)白花蛇舌草含量最大，為2.645 6 mg/g。

在測(cè)定白花蛇舌草中齊墩果酸和熊果酸含量時(shí)，流動(dòng)相的選擇將影響齊墩果酸和熊果酸能否出峰，所以流動(dòng)相的選擇至關(guān)重要。流動(dòng)相比例、流速、進(jìn)樣量的優(yōu)化直接影響到齊墩果酸和熊果酸分離效果及出峰時(shí)間。所以在檢測(cè)過(guò)程中要綜合考慮到每一個(gè)條件，才能保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

綜上所述，試驗(yàn)所建立的測(cè)定白花蛇舌草中齊墩果酸和熊果酸含量的HPLC法，預(yù)處理方法簡(jiǎn)單，測(cè)定方法可靠，可運(yùn)用于白花蛇舌草中齊墩果酸和熊果酸含量的測(cè)定和分析。