飼用枯草芽孢桿菌JY24發(fā)酵條件的優(yōu)化

孔利華， 高書鋒， 雷 平， 曾發(fā)姣， 繆 東， 周映華，龔 平， 周小玲，曾 奧， 鄔理洋， 舒 燕， 胡 丹， 王升平， 劉惠知

(湖南省微生物研究院， 湖南 長沙 410009)

近年來，畜禽養(yǎng)殖不斷向規(guī)?；?、集約化發(fā)展，抗生素在飼料中普遍使用，導(dǎo)致了諸多弊端，破壞畜禽腸道正常菌群平衡，引起內(nèi)源性及二重感染，嚴重導(dǎo)致畜禽產(chǎn)品及環(huán)境中藥物的殘留[1-3]。當(dāng)前，隨著飼料中抗生素的全面禁止，迫切需要新的替代品。中藥和微生態(tài)制劑作為兩大類飼料添加劑，具有純天然、無毒害、無藥殘、安全方便及功能全面等優(yōu)點，已成為國內(nèi)外研究的熱點[4-7]。

黃芩具有多種藥理活性，包括抗炎[8-9]、抗氧化[10]、抗微生物[11]、抗病毒[12-13]、清除自由基[14]等。其主要成分為黃芩苷，其次為黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素；黃芩苷不易被動物機體直接吸收，需經(jīng)腸道菌群作用水解成苷元黃芩素后，才能發(fā)揮其藥效作用[15]；大量臨床藥效試驗證明，黃芩素的藥理作用強于黃芩苷。由于黃芩中游離型苷元(黃芩素)的含量很低(約1%)，主要以結(jié)合型的糖苷(黃芩苷)形式存在(含量大于10%)，導(dǎo)致游離型苷元遠不能滿足市場需求和臨床應(yīng)用。因此，將黃芩苷轉(zhuǎn)化為黃芩素，提高其藥理活性具有重大的實際意義。目前，黃芩素大多從藥材中直接提取，近年來雖有利用側(cè)耳菌[16]、黑曲霉[16-17]、米曲霉[18]、羅爾夫青霉[19]、納豆芽孢桿菌[20]及短乳桿菌[21]對黃芩進行生物轉(zhuǎn)化的研究報道，但轉(zhuǎn)化過程中所用菌種多屬真菌類，難免會產(chǎn)生安全性問題，而作為益生菌的納豆芽孢桿菌，卻非腸源固有土著菌種，在動物腸道中能否定殖、發(fā)揮益生作用還不明確。

JY24菌株是課題組從雞源腸道內(nèi)容物中篩選得到的1株產(chǎn)β-葡萄糖醛酸苷酶的枯草芽孢桿菌，其可將黃芩苷轉(zhuǎn)化為黃芩素。JY24菌株產(chǎn)芽孢，能耐受飼料加工過程中的高溫，并降低運輸保藏過程中的失活現(xiàn)象；對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等腸道致病菌具有抑制作用，有益于降低畜禽腹瀉率；同時產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶，可起到輔助消化、促進生長的作用；源于腸道，具有天然的耐受胃腸道和定殖優(yōu)勢，經(jīng)體外模擬試驗，對人工胃液、腸液均有較強耐受性。JY24菌株是微生態(tài)制劑和中藥黃芩發(fā)酵轉(zhuǎn)化研發(fā)領(lǐng)域內(nèi)潛在的理想菌株，但還需要對該菌制劑及與黃芩聯(lián)用對肉仔雞臨床應(yīng)用效果進行研究，并有必要對該菌株發(fā)酵工藝進行研究。鑒于此，采用單因素試驗與正交試驗相結(jié)合的方法對其搖瓶發(fā)酵條件和培養(yǎng)基組成進行篩選，并在此基礎(chǔ)上優(yōu)化培養(yǎng)基成分，旨在為JY24菌株的中試生產(chǎn)和產(chǎn)品研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試材料

1.1.1菌種枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)JY24菌株，由湖南省微生物研究院動物營養(yǎng)微生物室從雞腸道內(nèi)容物中分離、篩選和保藏。

1.1.2培養(yǎng)基

1) 斜面培養(yǎng)基。蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

2) 種子培養(yǎng)基。蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

3) 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基。葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，磷酸二氫鉀1.0 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

1.1.3主要設(shè)備LRH-400A生化培養(yǎng)箱、ZQZY-AS9恒溫培養(yǎng)振蕩器、GZX-9146MBE電熱恒溫干燥箱、BH-2型OLYMPUS顯微鏡、LS-30高壓滅菌鍋和PHS-3C型數(shù)顯酸度計。

1.2方法

1.2.1菌種預(yù)處理

1) 菌種活化。將枯草芽孢桿菌JY24菌株活化后轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基，33℃培養(yǎng)24 h備用。

2) 種子液制備。取3環(huán)活化斜面菌種接入裝有100 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，33℃、200 r/min培養(yǎng)18 h備用。

1.2.2枯草芽孢桿菌最佳發(fā)酵條件優(yōu)化試驗

1) 轉(zhuǎn)速。試驗設(shè)4個處理，即搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min、180 r/min、210 r/min和240 r/min。按1%的接種量將種齡為18 h的枯草芽孢桿菌種子液轉(zhuǎn)接到裝液量為20%、pH 7.0的發(fā)酵培養(yǎng)基上，在33℃條件下培養(yǎng)48 h。采用梯度稀釋法[22]檢測發(fā)酵液的活菌數(shù)，確定搖床最佳發(fā)酵轉(zhuǎn)速。

2) 裝液量。試驗設(shè)5個處理，即發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為10%、15%、20%、25%和30%。按1%的接種量將種齡為18 h的枯草芽孢桿菌種子液轉(zhuǎn)接到初始pH 7.0的不同裝液量發(fā)酵培養(yǎng)基上，置33℃、240 r/min搖床發(fā)酵48 h，檢測發(fā)酵液的活菌數(shù)，確定最佳裝液量。

3) 發(fā)酵時間。試驗設(shè)7個處理，即發(fā)酵時間為18 h、24 h、30 h、36 h、42 h、48 h和54 h。按1%的接種量將種齡為18 h的枯草芽孢桿菌種子液轉(zhuǎn)接到裝液量為10%、初始pH 7.0的發(fā)酵培養(yǎng)基上，置33℃、240 r/min搖床發(fā)酵，檢測發(fā)酵液的活菌數(shù)，確定最佳發(fā)酵時間。

4) 接種量。試驗設(shè)5個處理，即接種量分別為1%、3%、5%、7%和10%。將種齡為18 h的枯草芽孢桿菌種子液分別按相應(yīng)接種量轉(zhuǎn)接到裝液量為10%、pH 7.0的發(fā)酵培養(yǎng)基上，置33℃、240 r/min搖床發(fā)酵36 h，檢測發(fā)酵液的活菌數(shù)，確定最佳接種量。

5) 發(fā)酵溫度。試驗設(shè)5個處理，即發(fā)酵溫度分別為31℃、33℃、35℃、37℃和39℃。以3%的接種量將種齡為18 h的枯草芽孢桿菌種子液接入初始pH 7.0、裝液量為10%的發(fā)酵培養(yǎng)基，置240 r/min搖床發(fā)酵36 h，檢測發(fā)酵液的活菌數(shù)，確定最佳發(fā)酵溫度。

6) 初始pH。試驗設(shè)7個處理，即初始pH分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0。以3%的接種量將種齡為18 h的枯草芽孢桿菌種子液接入裝液量為10%的不同初始pH發(fā)酵培養(yǎng)基，置35℃、240 r/min搖床發(fā)酵36 h，檢測發(fā)酵液的活菌數(shù)，確定發(fā)酵培養(yǎng)基最佳初始pH。

1.2.3枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基組分的篩選

1) 碳源。以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖的碳含量計算碳濃度，將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源分別用蔗糖、淀粉、紅糖、糖蜜和麥麩替換，按1.2.2篩選的最佳發(fā)酵條件進行發(fā)酵。檢測發(fā)酵液的活菌數(shù)，確定最佳碳源。

2) 氮源。以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中蛋白胨的氮含量計算氮濃度，將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源分別用酵母粉、酵母膏、黃豆粉、牛肉膏、硝酸鉀和碳酸銨替換，按1.2.2篩選的最佳發(fā)酵條件進行發(fā)酵，測定發(fā)酵液的活菌數(shù)，確定最佳氮源。

3) 磷源。以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中磷酸鹽的磷含量計算磷濃度，將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的磷源分別用磷酸二氫鉀、1/2磷酸二氫鉀+1/2磷酸氫二鉀、磷酸氫二鉀替換，按1.2.2篩選的最佳發(fā)酵條件進行發(fā)酵，測定發(fā)酵液的活菌數(shù)，確定最佳磷源。

4) 無機鹽。去掉基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的無機鹽，分別添加0.002 mol/L的硝酸鉀、氯化鈉、氯化鈣、硫酸鎂、硫酸錳、三氯化鐵、硫酸亞鐵和硫酸銅，以不加任何無機鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基為對照(CK)，按1.2.2篩選的最佳發(fā)酵條件進行發(fā)酵，測定發(fā)酵液的活菌數(shù)，確定最佳無機鹽類。

1.2.4發(fā)酵培養(yǎng)基組成的優(yōu)化根據(jù)JY24菌株發(fā)酵培養(yǎng)基組分的單因素試驗結(jié)果，選取最佳碳源、氮源和磷源及2種對發(fā)酵水平影響較大的無機鹽類，采用5因素4水平的正交試驗設(shè)計，選用L16(45) 正交表進行正交試驗(表1)，對試驗結(jié)果進行直觀分析和方差分析，優(yōu)化培養(yǎng)基組分。

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗因素和水平設(shè)計

2結(jié)果與分析

2.1枯草芽孢桿菌的發(fā)酵條件

從圖1看出不同培養(yǎng)條件對枯草芽孢桿菌發(fā)酵水平(發(fā)酵液活菌數(shù))的影響不同。

2.1.1轉(zhuǎn)速隨發(fā)酵搖床轉(zhuǎn)速的增大，發(fā)酵液活菌數(shù)呈增加趨勢。轉(zhuǎn)速為240 r/min時，發(fā)酵液活菌數(shù)最高，為7.5×108CFU/mL；轉(zhuǎn)速為150 r/min時，發(fā)酵液活菌數(shù)最低，為5.2×108CFU/mL。由于轉(zhuǎn)速越大，發(fā)酵液溶氧越高，因此在發(fā)酵過程中盡可能提高轉(zhuǎn)速以提高好氧菌的發(fā)酵水平。試驗初步確定搖床最佳轉(zhuǎn)速為240 r/min。

2.1.2裝液量隨著裝液量的增加，發(fā)酵液活菌數(shù)逐漸減小。裝液量為10%時，發(fā)酵液活菌數(shù)最高，為9.5×108CFU/mL，裝液量為25%和30%時，發(fā)酵水平最低，均為4.0×108CFU/mL。搖瓶裝液量越少，相對溶氧量越大，好氧菌生長代謝旺盛，有利于發(fā)酵水平的提升；但裝液量太少，發(fā)酵過程中發(fā)酵液會有一定蒸發(fā)，易造成試驗結(jié)果偏差。因此，初步確定最佳裝液量為10%。

2.1.3發(fā)酵時間隨發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵水平呈先升后降趨勢。其中，發(fā)酵時間為36 h時發(fā)酵液活菌數(shù)最高，為1.2×109CFU/mL。細菌群體的生長規(guī)律一般可分為遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期4個時期，穩(wěn)定期的活菌數(shù)量最高并維持穩(wěn)定；當(dāng)細菌生長進入穩(wěn)定期時，即可終止發(fā)酵。因此，初步確定最佳發(fā)酵時間為36 h。另，接種物種齡處于對數(shù)期時，接種后能夠迅速繁殖，接種非對數(shù)期種齡接種物則延長發(fā)酵過程，故在發(fā)酵時間優(yōu)化時，應(yīng)確保接種物種齡處于對數(shù)期。

2.1.4接種量隨接種量的增加，發(fā)酵液活菌數(shù)呈先升后降趨勢。其中，接種量為3%時，發(fā)酵液活菌數(shù)較高，為1.4×109CFU/mL；接種量增加，發(fā)酵液活菌數(shù)減少，當(dāng)接種量為7%時，發(fā)酵水平最低，發(fā)酵液活菌數(shù)為2.0×108CFU/mL。接種量對發(fā)酵水平的影響相對較大，接種量大可以實現(xiàn)快速啟動，但接種量過多易導(dǎo)致菌種吸收不到足夠的營養(yǎng)而影響生長繁殖；接種量少則延長發(fā)酵周期，增加能耗和雜菌污染機會[23]。接種量過多或過少均不利于菌體生長，因此，初步確定最佳接種量為3%。

2.1.5溫度不同溫度對枯草芽孢桿菌發(fā)酵水平有較大影響，隨發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵水平呈先升后降趨勢。其中，發(fā)酵溫度為35℃時，發(fā)酵液活菌數(shù)最高，為1.5×109CFU/mL；溫度繼續(xù)升高，發(fā)酵水平降低；當(dāng)溫度為39℃時發(fā)酵水平最低，發(fā)酵液活菌數(shù)為1.0×108CFU/mL。溫度對微生物的影響具體表現(xiàn)為影響酶活性，進而影響細胞物質(zhì)的合成；影響細胞質(zhì)膜的流動性，影響物質(zhì)的運輸、吸收和代謝；影響物質(zhì)的溶解性，同時影響到物質(zhì)的吸收。微生物無時不在改變生長速率，以適應(yīng)環(huán)境溫度的變化，每個菌株都有各自的最低、最適和最高生長溫度。因此，初步確定最佳發(fā)酵溫度為35℃。

2.1.6初始pH不同初始pH對發(fā)酵水平影響較大，隨pH的升高，發(fā)酵水平呈先升后降趨勢。其中，pH 7.0時，發(fā)酵液活菌數(shù)最高，為1.7×109CFU/mL；pH 5.5和pH 8.0時，搖瓶發(fā)酵生長均較差，發(fā)酵液活菌數(shù)分別為0.01×108CFU/mL和0.14×108CFU/mL。不同初始pH的發(fā)酵液發(fā)酵水平相差較為懸殊，原因在于pH通過影響酶促反應(yīng)、細胞質(zhì)膜的透性、膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和物質(zhì)的溶解性或電離性等影響物質(zhì)的吸收，進而影響細菌的生長速率，最終直接影響發(fā)酵水平。因此，初步確定最佳初始pH為7.0。

圖1不同培養(yǎng)條件枯草芽孢桿菌活菌數(shù)

2.2枯草芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基成分

從圖2看出不同培養(yǎng)基組成對枯草芽孢桿菌發(fā)酵水平(發(fā)酵液活菌數(shù))的影響存在差異。

2.2.1碳源不同碳源處理發(fā)酵液的活菌數(shù)為蔗糖>淀粉>紅糖>葡萄糖>糖蜜>麥麩。蔗糖為碳源時，發(fā)酵液活菌數(shù)最高，為2.5×109CFU/mL；其次是淀粉，活菌數(shù)為2.3×109CFU/mL；其他種類碳源發(fā)酵水平均相對較低。不同菌株利用碳源物質(zhì)具有選擇性，利用碳源物質(zhì)的能力也有較大差別，糖類一般是其較容易利用的碳源和能源物質(zhì)。該試驗初步確定最佳碳源為蔗糖。

2.2.2氮源有機氮源對發(fā)酵水平起關(guān)鍵作用，酵母膏作為氮源時，發(fā)酵液活菌數(shù)最高，為8.6×109CFU/mL；黃豆粉和酵母粉作為氮源時，活菌數(shù)較高，分別為5.3×109CFU/mL和4.0×109CFU/mL；其他種類氮源發(fā)酵水平較低。硝酸鉀和硫酸銨2種無機氮源發(fā)酵水平最差，分別為0.25×108CFU/mL和0.10×108CFU/mL。因此，初步確定最佳氮源為酵母膏。

2.2.3磷源不同磷源處理發(fā)酵液的活菌數(shù)為磷酸二氫鉀>1/2磷酸二氫鉀+1/2磷酸氫二鉀>磷酸氫二鉀。磷酸二氫鉀為磷源時，發(fā)酵液活菌數(shù)最高，為4.8×109CFU/mL；磷酸氫二鉀為磷源時，活菌數(shù)最低，為2.6×109CFU/mL。因此，初步確定最佳磷源為磷酸二氫鉀。

2.2.4無機鹽氯化鈣、硫酸鎂、硫酸錳、硝酸鉀和氯化鈉為無機鹽時，其發(fā)酵液活菌數(shù)分別為2.2×109CFU/mL、1.8×109CFU/mL、1.4×109CFU/mL、1.2×109CFU/mL和1.0×109CFU/mL，均較CK高，表明，其對發(fā)酵水平具有不同程度的促進作用；添加三氯化鐵、硫酸亞鐵和硫酸銅時，發(fā)酵液活菌數(shù)較CK低，表明，其對發(fā)酵水平具有不同程度的抑制作用。因此，最佳無機鹽選擇氯化鈣和硫酸鎂。

圖2不同培養(yǎng)基組成枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)

2.3發(fā)酵培養(yǎng)基組分的優(yōu)化

從表2看出，方案10(A3B2C4D3E1)的活菌數(shù)最高，為1.58×1010CFU/mL；其次是方案11(A3B3C1D2E4)，為1.35×1010CFU/mL。從表3可知，影響發(fā)酵水平各因素的關(guān)系為蔗糖(A)>酵母膏(B)>硫酸鎂(E)>磷酸二氫鉀(C)>氯化鈣(D)，因素間最佳水平組合為A3B3C4D2E1，該組合不在設(shè)計方案中。驗證試驗結(jié)果表明，最佳組合A3B3C4D2E1條件下，發(fā)酵液活菌數(shù)達1.73×1010CFU/mL，較方案10(A3B2C4D3E1)和方案11(A3B3C1D2E4)的活菌數(shù)高。表明，最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成為蔗糖12.0 g/L，酵母膏12.0 g/L，磷酸二氫鉀1.25 g/L，氯化鈣0.22 g/L，硫酸鎂0.30 g/L。

經(jīng)方差分析，F(xiàn)蔗糖=10.275>F0.05(3，3)=9.28，表明，蔗糖作用達顯著水平，在發(fā)酵過程中應(yīng)嚴格控制蔗糖用量，其他因素作用未達顯著水平。

表2 枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基優(yōu)化采用的L16(45)正交試驗方案與結(jié)果

表3枯草芽孢桿菌活菌數(shù)的直觀分析

注：K，各因素某一水平結(jié)果之和的平均數(shù)；R，極差。

Note:K，the average of sum of the results at a certain level of each factor;R，range.

3結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明，JY24菌株最佳發(fā)酵條件為轉(zhuǎn)速240 r/min，溫度35℃，初始pH7.0，裝液量10%，接種量3%，發(fā)酵時間36 h；最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成為蔗糖12.0 g/L，酵母膏12.0 g/L，磷酸二氫鉀1.25 g/L，氯化鈣0.22 g/L，硫酸鎂0.30 g/L。該條件下，發(fā)酵液活菌數(shù)達1.73×1010CFU/mL。與對照相比，不同無機鹽對發(fā)酵水平具有促進或抑制作用，原因與不同菌株在發(fā)酵過程中為適應(yīng)環(huán)境變化對不同無機元素的不同需求量有關(guān)。無機鹽通常具有維持細胞生物大分子和細胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、參與各種酶活性中心組成、調(diào)節(jié)培養(yǎng)基滲透壓和pH、控制細胞氧化還原電位等作用[24]。在發(fā)酵試驗中，在注重碳、氮源優(yōu)化的同時，也應(yīng)特別注意對某些無機鹽尤其是微量元素進行優(yōu)化，有時微量元素也會成為制約、抑制菌株新陳代謝等發(fā)酵指標(biāo)的一個關(guān)鍵因素。

陳莉等[25-26]報道，枯草芽孢桿菌K-6-9和NBF-809菌株液體發(fā)酵水平分別為1.40×109CFU/mL和3.98×109CFU/mL，發(fā)酵水平相對較低。趙達等[27-28]分別優(yōu)化不同枯草芽孢桿菌菌株的液體發(fā)酵條件，發(fā)酵水平分別為1.05×1010CFU/mL和1.10×1010CFU/mL，發(fā)酵水平相對較高；管國強等[29]報道，枯草芽孢桿菌ZC1菌株液體發(fā)酵水平為3.69×1010CFU/mL，發(fā)酵水平相對很高。鄭雙鳳等[30-31]分別優(yōu)化不同枯草芽孢桿菌菌株的高產(chǎn)芽孢發(fā)酵工藝，芽孢產(chǎn)量分別為7.33×109CFU/mL和1.43×1010CFU/mL。綜合看，不同枯草芽孢桿菌菌株發(fā)酵水平存在一定差異，對特定的菌株需要篩選適宜的培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件。下一步將對JY24菌株進行發(fā)酵放大和中試生產(chǎn)，進一步提升JY24菌株的發(fā)酵水平，同時確定一套發(fā)酵工藝參數(shù)。