混播比例和刈割茬次對多花黑麥草+箭筈豌豆混播草地土壤細(xì)菌群落的影響

茍文龍, 李 平, 董臣飛, 李達(dá)旭, 白史且, 師尚禮*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院, 甘肅 蘭州 730070; 2. 四川省草原科學(xué)研究院, 四川 成都 611731;3. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所, 江蘇 南京 210014)

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中最為活躍的部分，參與90%左右的土壤反應(yīng)過程，在土壤物質(zhì)循環(huán)、能量流動及維持土壤生態(tài)系統(tǒng)多樣性與穩(wěn)定性方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用[1]。其中土壤細(xì)菌種類繁多，數(shù)量最多，約占土壤微生物總量的70%～90%[2]，它直接或間接參與土壤生物化學(xué)循環(huán)，如分解與合成有機(jī)物質(zhì)，土壤結(jié)構(gòu)及腐殖質(zhì)的形成等[3]。近年來人們開始關(guān)注和認(rèn)識土壤微生物的生態(tài)功能，利用土壤微生物結(jié)構(gòu)來衡量土壤健康質(zhì)量的優(yōu)劣。土壤細(xì)菌群落多樣性是評價土壤質(zhì)量的一項重要指標(biāo)。土壤中細(xì)菌多樣性越高，越有利于土壤恢復(fù)力和抗壓力的提高[4]。植被類型和多樣性、土壤水分、pH值、土壤類型及其理化性狀、土地利用方式均顯著影響微生物群落結(jié)構(gòu)[5]，如Lauber等認(rèn)為pH值是決定土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的主要因素[6]。

禾豆混播可以提高單位面積的產(chǎn)草量和蛋白質(zhì)產(chǎn)量，提高土壤肥力，減少工業(yè)氮肥的施用，降低生產(chǎn)成本，減少環(huán)境污染，不僅能增加地上部的生物多樣性，也可以增加地下部的土壤微生物多樣性[7-8]。目前禾豆混播的研究主要集中在產(chǎn)量和品質(zhì)[9]、競爭共存[10]、土壤養(yǎng)分[11]、根系形態(tài)[12]、施肥管理[13]、氮素固定與轉(zhuǎn)移[14]等方面。關(guān)于禾豆混播草地土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究和報導(dǎo)較少，其中陸炳章研究多花黑麥草(LoliummultiflorumLamk.)與光葉紫花苕(ViciavillosaRoth)、箭筈豌豆(ViciasativaL.)的混播結(jié)果表明，混播區(qū)根際細(xì)菌、放線菌、真菌、固氮菌、纖維分解菌等均顯著高于單播和休閑地[15]。王旭等研究燕麥(Avena sativa L.)和箭筈豌豆間行混播收獲期根際土壤細(xì)菌數(shù)量是單作燕麥的1.1倍左右[16]。而混播比例和刈割茬次對禾豆混播草地土壤群落結(jié)構(gòu)的影響方面的研究就更少。因此，本研究以多花黑麥草和箭筈豌豆混播草地土壤為研究對象，通過直接提取土壤細(xì)菌基因組總DNA，采用16S rDNA基因的通用引物PCR擴(kuò)增及Illumina平臺Miseq高通量測序技術(shù)對多花黑麥草和箭筈豌豆混播草地土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與組成、物種豐富度和物種多樣性進(jìn)行研究，探討混播比例和刈割茬次對多花黑麥草和箭筈豌豆混播草地土壤細(xì)菌群落的影響，為深入了解禾豆混播草地土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與組成變化、調(diào)節(jié)土壤環(huán)境質(zhì)量和改善土壤管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣地描述與試驗設(shè)計

1.1.1試驗區(qū)自然概況 試驗地位于四川省草原科學(xué)研究院大邑縣韓場基地(103°45′ E，30°25′ N，海拔475 m)。試驗區(qū)域?qū)俅箨懶詿釒駶櫦撅L(fēng)氣候，年平均氣溫15℃，最熱月7月平均氣溫26.1℃，最冷月1月平均氣溫5.5℃，極端最低氣溫-4.8℃，極端最高氣溫35.1℃，年降水量1 300 mm。土壤為黃粘土，pH 6.74，有機(jī)質(zhì)32.2 mg·kg-1，堿解氮185 mg·kg-1，有效磷41.8 mg·kg-1，速效鉀127.3 mg·kg-1。全年日照時數(shù)1 033.8 h，年平均無霜期284 d。

1.1.2供試材料 長江2號多花黑麥草(LoliummultiflorumLamk‘Changjiang No. 2’)，純凈度98%，發(fā)芽率92%，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草學(xué)系提供；川北箭筈豌豆(ViciasativaL‘Chuanbei’)，純凈度95%，發(fā)芽率94.5%，由四川省農(nóng)科院土肥所提供。

1.1.3試驗設(shè)計 試驗采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，共設(shè)5個處理，即100%多花黑麥草(R1)、75%多花黑麥草+25%箭筈豌豆(R2)、50%多花黑麥草+50%箭筈豌豆(R3)、25%多花黑麥草+75%箭筈豌豆(R4)和100%箭筈豌豆(R5)，每個處理3個重復(fù)。小區(qū)面積15 m2(3 m×5 m)，區(qū)組間隔0.8 m，小區(qū)間隔1 m。試驗于2016年9月28日播種，采用撒播，撒播時，多花黑麥草和箭筈豌豆分開撒播。多花黑麥草單播播種量22.5 kg·hm-2，箭筈豌豆單播播種量75 kg·hm-2，混播組合中每個草種播種量是用混播組合中該草種的混播比例與單播播種量的乘積來表示。試驗水肥采用統(tǒng)一管理，分別在翌年的1月4日(H1,多花黑麥草分蘗期/箭筈豌豆分枝期)、3月14日(H2,多花黑麥草拔節(jié)期/箭筈豌豆分枝期)、4月21日(H3,多花黑麥草孕穗期/箭筈豌豆現(xiàn)蕾期)、5月19 日(H4,多花黑麥草乳熟期/箭筈豌豆盛花期)4個時期進(jìn)行刈割。

1.2 土壤取樣和前期處理

每次刈割后，各小區(qū)以S形取樣法在株叢附近用土鉆采集0～20 cm土樣，所有土壤樣品采用北京富益聯(lián)有限公司的便攜式冰箱(FYL-YS-60L)帶回實驗室，儲存在—80℃超低溫冰箱后進(jìn)行DNA提取和細(xì)菌群落分析。

1.3 DNA提取和 PCR擴(kuò)增

參照Zeng等的方法進(jìn)行DNA提取和PCR擴(kuò)增[17]。使用CTAB / SDS方法提取土壤樣品的總DNA。在1%瓊脂糖凝膠上檢測DNA濃度和純度。使用無菌水將DNA稀釋至1 ng·μL-1。選擇引物515F(5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3)和806R(5′-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3′)擴(kuò)增16S rRNA基因的V4高變區(qū)[18]。所有PCR反應(yīng)均用Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix(New England Biolabs)進(jìn)行。將相同體積的1×上樣緩沖液(含有SYB綠)與PCR產(chǎn)物混合，并在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測。選擇具有400 bp和450 bp之間的明亮主條帶的樣品用于進(jìn)一步實驗。將PCR產(chǎn)物以等密度比混合，并用Qiagen Gel Extraction Kit(Qiagen，Germany)純化。

1.4 文庫建立及測序

使用TruSeq?DNA PCR-Free樣品制備試劑盒(Illumina，USA)按照制造商的推薦產(chǎn)生測序文庫，并添加指數(shù)代碼。使用Qubit@2.0熒光計(Thermo Scientific)和Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)評估文庫質(zhì)量。最后，將文庫在Illumina HiSeq2500平臺上測序，并產(chǎn)生250 bp的配對末端讀取數(shù)(reads)。

使用FLASH(V1.2.7)合并成對末端讀取數(shù)(reads)[19]，然后在特定過濾條件下進(jìn)行，以根據(jù)QIIME(V1.7.0)的質(zhì)量控制過程獲得高質(zhì)量的有效序列(clean tags)[20]。使用UCHIME算法將序列(tags)與Gold數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，以檢測嵌合體(chimera)序列，然后去掉嵌合體序列[21]。

序列分析由Uparse軟件(Uparse v7.0.1001)完成[22]。具有≥97%相似性的序列被歸類為相同的操作分類單元(OTU，Operational Taxonomic Unit)。對于每個代表性序列，依據(jù)GreenGene數(shù)據(jù)庫[23]，采用RDP 3算法(version 2.2)進(jìn)行分類信息注釋[24]。為了研究不同OTU的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，以及不同樣品(組)中優(yōu)勢種的差異，使用MUSCLE軟件(版本3.8.31)進(jìn)行多序列比對。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用QIIME(Version 1.7.0)計算alpha多樣性并用R軟件(Version 2.15.3)顯示。PC軟件分析由R軟件(Version 2.15.3)中的WGCNA軟件包，stat軟件包和ggplot2軟件包顯示。Beta多樣性由QIIME軟件(Version 1.7.0)計算。PC軟件分析由R軟件(Version 2.15.3)中的WGCNA軟件包，stat軟件包和ggplot2軟件包顯示。采用方差分析(ANOVA)評估土壤性質(zhì)和細(xì)菌群落指數(shù)變化程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 多花黑麥草和箭筈豌豆混播草地土壤細(xì)菌多樣性

土壤樣本細(xì)菌alpha多樣性統(tǒng)計如表1所示。通過數(shù)據(jù)庫比對注釋，得到97 021個OTU,這些OTU具有>96%的序列相似性，R2H3具有最高的OTU(5 456)，R4H2具有最低的OTU(3 846)。土壤樣品中細(xì)菌Shannon指數(shù)和Chao 1指數(shù)分別為8.82～10.56和6 697.67～7 963.69，表明禾豆混播草地土壤具有較高的細(xì)菌多樣性?；觳ケ壤拓赘畈绱螌σ荒晟潭够觳ゲ莸赝寥兰?xì)菌香農(nóng)指數(shù)和覆蓋率無交互效應(yīng)，混播比例對土壤alpha多樣性指數(shù)無顯著性影響，刈割茬次對土壤細(xì)菌OTU和Chao 1指數(shù)影響效果顯著(P<0.05)。隨著刈割茬次的增加，多花黑麥草單播R1的土壤細(xì)菌OTU和Chao 1指數(shù)呈增加趨勢(P<0.05)；混播R2的土壤細(xì)菌OTU、Shannon指數(shù)和系統(tǒng)發(fā)育多樣性指數(shù)呈先降低后增加趨勢(P<0.05)；混播R3的土壤細(xì)菌OTU，Chao 1指數(shù)和系統(tǒng)發(fā)育多樣性指數(shù)呈“S”型變化，Shannon指數(shù)呈線性增加(P<0.05)；混播R4和箭筈豌豆單播R5的土壤細(xì)菌OTU，Shannon指數(shù)，Chao1指數(shù)和系統(tǒng)發(fā)育多樣性指數(shù)先降低后增加(P<0.05)。

2.2 多花黑麥草和箭筈豌豆混播草地土壤細(xì)菌群落組成

如圖1所示，第1茬(H1)，R1，R2，R3，R4和R5特有OTU分別為824，620，548，597和975，共有OTU為1 909，第2茬(H2)，R1，R2，R3，R4和R5特有OTU分別為780，585，568，482和745，共有OTU為1 746；第3茬(H3)，R1，R2，R3，R4和R5特有OTU分別為618，610，864，553和523，共有OTU為2 602；第4茬(H4)，R1，R2，R3，R4和R5特有OTU分別為619，579，590，635和566，共有OTU為2 599；不同混播比例之間，R1，R2，R3，R4和R5特有OTU分別為949，732，791，708和762，共有的OTU為5 055；不同刈割茬次之間，H1，H2，H3和H4特有OTU分別為1 236，783，1 913和1 569，共有的OTU為5 073；隨著禾豆混播比例或刈割茬次的增加，特有的OTU呈“Z”型變化；R5H1具有最多的OTU(975)，而R4H2具有最少的OTU(482)。

表1 土壤樣本細(xì)菌Alpha多樣性統(tǒng)計

注：H1:第1茬刈割，H2:第2茬刈割，H3:第3茬刈割，H4:第4茬刈割。下同

Note:H1:First cut,H2:Second cut,H3:Third cut,H4:Forth cut. The same as below

圖1 多花黑麥草和箭筈豌豆混播草地土壤細(xì)菌OTU韋恩圖

多花黑麥草和箭筈豌豆混播草地土壤細(xì)菌在門、目和屬分類水平上的相對豐富度如圖2所示。在門水平上的主要群體是變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、浮霉菌門(Planctomycetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)和疣微菌門(Verrucomicrobia)，其中變形菌門、酸桿菌門和放線菌門是土壤的優(yōu)勢細(xì)菌門，占整個細(xì)菌類群豐富度的59.1%～69.8%。H3土壤樣品中變形菌門、酸桿菌門和擬桿菌門的豐富度最高(0.34，0.17，0.09)，放線菌門豐富度最低(0.11)，而H4土壤樣品具有最高豐富度的硝化螺旋菌(0.05)；混播比例對門水平土壤細(xì)菌豐富度影響不顯著。在目水平上，R3H1具有較高的假單胞菌目(Pseudomonadales)，相對豐富度為0.17；鞘脂桿菌目(Sphingobacteriales)隨著刈割茬次增加，豐富度先增加后降低；紅螺菌目(Rhodospirillales)、變形細(xì)菌目(Myxococcales)及Gaiellales豐富度隨著刈割茬次增加，相對豐富度先降低后增加。在屬水平上，芽單胞菌屬(Gemmatimonas)和Gaiella隨著禾豆混播中豆科牧草比例的增加，相對豐富度先增加后降低；隨著刈割茬次的增加，芽單胞菌屬和棘刺桿菌屬(Sphingobacterium)呈降低趨勢。

不同混播比例之間未發(fā)現(xiàn)具有統(tǒng)計學(xué)差異的細(xì)菌，不同茬次之間具有統(tǒng)計學(xué)差異的土壤細(xì)菌(圖3)。H1具有顯著性差異的土壤細(xì)菌為γ-變形菌綱(Gammaprobacteria)、假單胞菌目、假單胞菌科(Pseudomonadaceae)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和丙酸桿菌目(Propionibacteriales)。H2具有顯著性差異的土壤細(xì)菌為嗜熱油菌綱(Thermoleophilia)、紅桿菌目(Solirubrobacterales)、Gaiellales、芽單胞菌目(Gemmatimonadales)、芽單胞菌科(Gemmatimonadaceae)、未分類的芽單胞菌門(undentified-Gemmatimor)、浮霉菌門(Planctomycetales)、浮霉菌綱(Planctomycetacia)和浮霉菌科(Planctomycetaceae)。H3具有顯著性差異的土壤細(xì)菌為β-變形菌綱(Betaprotebacteria)、鞘脂桿菌目(Sphingobacteriales)、鞘脂桿菌綱(Sphingobacteria)、Subgroup-6和噬幾丁質(zhì)菌科(Chitinophagaceae)。H4具有顯著性差異的土壤細(xì)菌為未分類的放線菌綱(unidentified-Actinobacteria)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、根瘤菌目(Rhizobiales)和紅螺菌目。

圖2 多花黑麥草和箭筈豌豆混播草地土壤細(xì)菌在門、目和屬分類水平上的相對豐富度

圖3 多花黑麥草和箭筈豌豆混播草地不同刈割茬次之間的LEfSe分析

PCoA分析表明，在X軸和Y軸上分別能夠解釋不同樣品處理之間差異的25.25%和17.61%(圖4)。NMDS分析時，stress為0.127，能夠有效解釋不通樣品的變異程度。PCoA和NMDS分析表明H3的細(xì)菌群落顯著不同于H1，H2和H4。通過Annosim，MRPP和Adonis分析時(表2)，不同刈割茬次之間細(xì)菌多樣性存在顯著差異(P<0.05)。

3 討論

南方是中國主要農(nóng)業(yè)區(qū)，傳統(tǒng)種植業(yè)由于工業(yè)氮肥的持續(xù)使用，導(dǎo)致大氣氮沉積，土壤酸化和土壤微生物多樣性降低。如中國南方化肥的大量使用加劇了土壤酸化(從1982年的6.5降至2012年的6.19)和耕地退化，導(dǎo)致土壤生態(tài)功能下降[25]。土壤微生物是土壤有機(jī)物循環(huán)的基礎(chǔ)，其對生存環(huán)境改變的相應(yīng)較迅速，能夠有效及時地反映土壤環(huán)境的變化，是表征土壤健康的生物標(biāo)準(zhǔn)[26]。土壤類型、土壤理化性狀、地上植被、季節(jié)更替、田間管理等影響土壤微生物的群落組成和結(jié)構(gòu)。其中，豆科牧草的加入有可能提高一年生禾草生產(chǎn)系統(tǒng)的粗蛋白來源和維持土壤健康[27-28]。因此，探索四川農(nóng)區(qū)一年生禾豆混播草地土壤的細(xì)菌群落特征，能夠更好地了解這些細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)短期變化。

表2 采用3種非參數(shù)多變量方法(Anosim、MRPP和Adonis)分析不同刈割茬次對多花黑麥草和箭筈豌豆混播草地土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

圖4 多花黑麥草和箭筈豌豆混播草地土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

本研究主要利用高通量測序方法探討了混播比例與刈割茬次對多花黑麥草和箭筈豌豆混播草地土壤細(xì)菌多樣性的影響，其彌補(bǔ)了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法造成的信息丟失缺陷，可以更全面的反映真實環(huán)境中土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性差異。本研究中，總共獲得97 021個OTU，測序的覆蓋率大于96%，表明以上測序量能夠很好地反映各個樣品中細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)和種類。所測定序列中主要的門包括變形菌門、放線菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門、硝化螺旋菌門、浮霉菌門、綠彎菌門和疣微菌門主要分布于土壤中，總相對豐富度>0.93。其中三個最豐富的土壤細(xì)菌群落是變形菌門(0.29～0.54)、放線菌門(0.08～0.36)和酸桿菌(0.08～0.18)，是多花黑麥草和箭筈豌豆混播草地主要的細(xì)菌類群。這與多數(shù)有關(guān)農(nóng)田土壤微生物群落組成所得研究結(jié)果是基本一致的。Ding等曾報道，變形菌門是農(nóng)田土壤中的主要微生物(相對豐富度0.29～0.33)，其次是酸桿菌門(相對豐富度0.12～0.16)和放線菌門(相對豐富度0.09～0.11)[29]。此外，國內(nèi)關(guān)于農(nóng)田土壤細(xì)菌多樣性的測序研究也表明，土壤中優(yōu)勢細(xì)菌門為變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、厚壁菌門和芽單胞菌門[5]。

牧草栽培管理措施是影響土壤養(yǎng)分循環(huán)和改變微生物群落的重要因素[30]。禾豆混播，地上和地下空間分布格局合理，土壤理化性質(zhì)改善，明顯地促進(jìn)了微生物活動，加速了有機(jī)物分解和養(yǎng)分積累[31]。植物群落多樣性越豐富，凋落物和根系分泌物組成就越豐富，土壤微生物豐富度和多樣性也就越高[32]。而本研究中，禾豆混播比例對土壤細(xì)菌多樣性指標(biāo)沒有顯著性影響。這可能是因為混播中多花黑麥草生長旺盛、競爭力強(qiáng)，箭筈豌豆生長較弱、耐刈性較差，無論混播比例大小，多花黑麥草始終在混播中占主導(dǎo)地位，使得混播比例對土壤細(xì)菌多樣性在短期內(nèi)未產(chǎn)生較大影響。這與Zhao等關(guān)于土壤微生物群落結(jié)構(gòu)在豆科牧草單播、禾本科牧草單播及禾豆混播之間無顯著差異的結(jié)果基本是一致的[33]。在溫室環(huán)境中進(jìn)行的生物修復(fù)實驗也證實此類現(xiàn)象[34]。因此，多花黑麥草和箭筈豌豆混播草地栽培管理過程中，箭筈豌豆增加了土壤微生物群落中特定物種豐富度。

本研究中，刈割茬次對土壤細(xì)菌多樣性有顯著性影響(P<0.05)，即隨著刈割茬次的增加，Shannon指數(shù)呈線性增加。這說明了刈割引起牧草地上部發(fā)生變化后，牧草地上部的光合作用、呼吸作用、蒸騰作用以及光合作用產(chǎn)物的分配與轉(zhuǎn)運(yùn)以及根系的分泌等生理生態(tài)活動會發(fā)生相應(yīng)的變化[35]，這些變化又會通過根系對土壤微生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生一定的影響[36]。賽吉日呼分析了單播苜蓿、單播老芒麥、單播飼用燕麥和混播播種后土壤微生物多樣性，結(jié)果表明，隨著牧草生育期的推遲，細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)呈上升趨勢[37]。PCoA分析表明來自H3的土壤傾向于聚集在一起，表現(xiàn)出具有高度的相似性。由于多花黑麥草和箭筈豌豆混播第3茬刈割在4茬刈割中的單茬地上生物量最大[38]，推測認(rèn)為地上生物量大，根系代謝作用加強(qiáng)，導(dǎo)致凋落物和根系分泌物多，在一定程度上改善了土壤微環(huán)境，使得細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。此外，包括變形菌門、放線菌門和酸桿菌門在內(nèi)的最主要的門在不同刈割時期間發(fā)生顯著變化。δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)相對豐富度在H2樣品中發(fā)生顯著變化，而α-變形菌綱、β-變形菌綱和γ-變形菌綱相對豐富度在H3樣品中發(fā)生顯著變化。這些變化可能與植株長勢的差異、根系活力的差異以及土壤本身和土壤中微生物基數(shù)的差異，引起土壤細(xì)菌相組成發(fā)生顯著變化有關(guān)。

4 結(jié)論

在門分類水平上，變形菌門、酸桿菌門和放線菌門是多花黑麥草和箭筈豌豆混播草地土壤的優(yōu)勢細(xì)菌門，占整個細(xì)菌類群豐富度的59.1%～69.8%，其中組合R3H4(50%多花黑麥草+50%箭筈豌豆混播第4茬刈割)的豐富度最大為69.8%。

在多花黑麥草和箭筈豌豆混播草地中，混播比例對土壤細(xì)菌多樣性無顯著性影響，刈割茬次顯著影響土壤細(xì)菌OTU和Chao 1指數(shù)，引起土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和組成發(fā)生改變。