不同形態(tài)氮肥對(duì)紫花苜蓿生長(zhǎng)、硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因MtNRT1.3表達(dá)及氮吸收的影響

王玉強(qiáng)，沈 宇，錢(qián) 進(jìn)，劉文濤，趙國(guó)琦，孫盛楠

(揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

氮素是植物生長(zhǎng)必不可少的大量營(yíng)養(yǎng)元素，也是植物體內(nèi)重要有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)性元素，如蛋白質(zhì)、核酸、葉綠素、酶和激素等；同時(shí)又是作物高產(chǎn)、品質(zhì)優(yōu)良的重要影響因素[1]。土壤中主要存在2種形態(tài)氮源，銨態(tài)氮和硝態(tài)氮，植物主要通過(guò)根系吸收土壤中的銨態(tài)氮和硝態(tài)氮，而不同形態(tài)的氮素會(huì)影響植物的氮素同化、光合作用以及植物體內(nèi)陰陽(yáng)離子的平衡，從而對(duì)植物生長(zhǎng)產(chǎn)生不同的效應(yīng)[2-3]。

銨態(tài)氮和硝態(tài)氮是植物吸收的主要氮素形式，吸收量占吸收陰、陽(yáng)離子的70%左右[4]，銨態(tài)氮促進(jìn)植物吸收陰離子，消耗有機(jī)酸；而硝態(tài)氮促進(jìn)植物吸收陽(yáng)離子，促進(jìn)有機(jī)陰離子的合成。不同植物對(duì)不同形態(tài)氮素的吸收、轉(zhuǎn)化利用能力也不同，比如旱地植物一般表現(xiàn)為“喜硝性”，而水生植物或強(qiáng)酸性土壤上生長(zhǎng)的植物，則一般表現(xiàn)為“喜銨性”，這是植物為適應(yīng)土壤環(huán)境而長(zhǎng)期進(jìn)化的結(jié)果。有研究[5]表明，水稻田施用銨態(tài)氮，可以明顯提高植株的株高、地上干物質(zhì)量，從而促進(jìn)水稻的生長(zhǎng)。而有研究[6]發(fā)現(xiàn)，不同形態(tài)氮肥對(duì)小麥的產(chǎn)量、增產(chǎn)量和增產(chǎn)率的影響中，硝態(tài)氮肥最高，硝態(tài)氮、銨態(tài)氮組合次之，銨態(tài)氮最低。

大量研究都著眼于植物對(duì)銨態(tài)氮與硝態(tài)氮的吸收量、吸收速率和光合特性上，忽視了土壤這個(gè)具有強(qiáng)大緩沖能力的載體。植物的生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)的吸收利用都離不開(kāi)土壤，土壤的理化性質(zhì)可以直接影響植物對(duì)銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的吸收。有研究[7]發(fā)現(xiàn)，在土壤高pH的條件下，不論來(lái)自有機(jī)質(zhì)的礦化還是直接施入土壤的銨態(tài)氮，會(huì)迅速通過(guò)硝化作用轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮，土壤中銨態(tài)氮濃度低至只有0.77 mmol·dm-3，而硝態(tài)氮濃度能高達(dá) 6 mmol·dm-3。

目前研究最多的NRT1轉(zhuǎn)運(yùn)體是擬南芥AtNRT1.1蛋白。硝酸鹽可以誘導(dǎo)其表達(dá)[24]。AtNRT1.1在功能上與硝酸鹽對(duì)根生長(zhǎng)的刺激作用有關(guān)[25,26]。AtNRT1.1已被證明在硝酸鹽感應(yīng)系統(tǒng)中發(fā)揮了作用，該系統(tǒng)通過(guò)促進(jìn)根尖中生長(zhǎng)素的流動(dòng)來(lái)刺激根系生長(zhǎng)[27,28]。迄今為止，豆科植物中的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體很少受到關(guān)注，可能是因?yàn)檫@些物種能夠通過(guò)共生結(jié)瘤的生物固氮來(lái)適應(yīng)氮饑餓[29]。盡管硝酸鹽在豆科植物中也起著重要的營(yíng)養(yǎng)和信號(hào)作用，但在這些物種中只有少數(shù)假定的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體被克隆出來(lái)[30]，到目前為止，它們都沒(méi)有功能特征。事實(shí)上，在氮限制條件下，豆科植物能夠吸收礦物質(zhì)氮，尤其是土壤中硝態(tài)氮，以滿(mǎn)足其營(yíng)養(yǎng)需求，然后才能分化出功能共生結(jié)瘤。此外，有研究[31]表明，硝酸鹽通過(guò)局部和系統(tǒng)性調(diào)節(jié)途徑，抑制根結(jié)瘤和固氮活性。在給植物接種根瘤菌的試驗(yàn)中，氮輸入被證明能夠調(diào)節(jié)百脈根(Lotusjaponicus)中根瘤的發(fā)生[32]。硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因MtNRT1.3主要在紫花苜蓿根中表達(dá)，編碼雙親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體，類(lèi)似于擬南芥中的AtNRT1.1[33]。有研究發(fā)現(xiàn)蒺藜苜蓿中的MtNRT1.3與描述的NRT1家族成員不同，根中MtNRT1.3的表達(dá)受氮饑餓刺激，并在含有NO3-的培養(yǎng)基中受到抑制[34]。

紫花苜蓿是現(xiàn)代畜牧業(yè)生產(chǎn)中重要的蛋白飼草資源，本研究以紫花苜蓿為研究對(duì)象，探究紫花苜蓿對(duì)不同形態(tài)氮素的吸收、轉(zhuǎn)化和土壤微環(huán)境對(duì)外源氮素添加的響應(yīng)，以及氮素、植物和土壤三者之間的相互關(guān)系。探討不同形態(tài)氮肥對(duì)土壤氮含量及植物根系養(yǎng)分吸收的影響，了解土壤氮素與植物供求關(guān)系，揭示不同形態(tài)氮素對(duì)紫花苜蓿生理特征、氮含量的影響，通過(guò)平衡銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量，合理調(diào)控氮肥種類(lèi)和養(yǎng)分供求以滿(mǎn)足作物要求，提高資源利用效率和作物生產(chǎn)力。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試紫花苜蓿品種為WL233(購(gòu)于北京正道種業(yè)有限公司)，供試肥料包括：分析純硝酸鈉、氯化銨和硫酸鉀；化學(xué)純化過(guò)磷酸鈣，有效磷(以P2O5計(jì))為14%～16%。

盆栽土壤取自揚(yáng)州大學(xué)草學(xué)智能溫室試驗(yàn)地0～30 cm的表土，有機(jī)質(zhì)19.08 g·kg-1,全氮0.85 g·kg-1，pH值8.32，銨態(tài)氮4.83 mg·kg-1，硝態(tài)氮12.48 mg·kg-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用盆栽法，于2019年4月在揚(yáng)州大學(xué)草學(xué)智能溫室內(nèi)進(jìn)行。試驗(yàn)選擇容器為18 cm×17 cm×20 cm的塑料花盆，每盆裝土3.5 kg，根據(jù)土壤基礎(chǔ)肥力測(cè)定，每盆按照1 kg土施加K2O 200 mg、P2O5300 mg作為基肥。每盆均勻點(diǎn)播10粒種子，待幼苗長(zhǎng)出第3片真葉時(shí)進(jìn)行間苗，每盆留8株長(zhǎng)勢(shì)一致的健康幼苗。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，共設(shè)4個(gè)處理，分別為以不施氮處理為對(duì)照組(Con)、銨態(tài)氮(NH4Cl-T1)、硝態(tài)氮(NaNO3-T2)和混合氮(銨態(tài)氮、硝態(tài)氮1︰1混合-T3)，每個(gè)處理重復(fù)4次，共16盆。各形態(tài)氮肥施加總量為250 mg·kg-1(每1 kg土)，以Fahraeus無(wú)氮營(yíng)養(yǎng)液[35]結(jié)合NH4Cl和NaNO3配置所需氮素濃度，3葉期時(shí)開(kāi)始澆灌，每次澆灌營(yíng)養(yǎng)液200 mL，每周澆一次營(yíng)養(yǎng)液，并進(jìn)行日常澆水、除雜防護(hù)管理，共計(jì)5周?，F(xiàn)蕾期取樣測(cè)定各個(gè)指標(biāo)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)和方法

1.3.1土壤pH及土壤氮含量的測(cè)定 用常規(guī)農(nóng)化分析方法測(cè)定pH值(Sartorious PB-10)[36]。采用試劑盒(購(gòu)于蘇州科銘生物科技有限公司)測(cè)定土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量。

1.3.2紫花苜蓿生長(zhǎng)性狀及植株銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量測(cè)定 株高：測(cè)量植株的自然狀態(tài)下的垂直高度；根長(zhǎng)：將植株根系整個(gè)挖出，去除土壤(保證根的完整)，用直尺測(cè)量主根的根長(zhǎng)；所有處理地上部和地下部(蒸餾水洗凈，吸水紙吸干)稱(chēng)取鮮重，留一小部分用于測(cè)定植株銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量和根中MtNRT1.3 基因的表達(dá)(—80℃保存)，其余部分于烘箱105℃殺青30 min后，在75℃烘干至恒重，稱(chēng)取干質(zhì)量即為生物量；

植物銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量：采用試劑盒測(cè)定(購(gòu)于蘇州科銘生物科技有限公司)。

1.3.3紫花苜蓿根RNA的提取和cDNA的合成 稱(chēng)取1～2 g紫花苜蓿根，用磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate buffer saline,PBS)洗凈，吸水紙吸干，放入玻璃研磨器中，接著加入1 mL Trizol(細(xì)胞和組織總RNA提取試劑)研磨至勻漿，裝于1.5 mL指形管中，加入0.2倍體積的氯仿，離心20 min，取上清，加入等體積的冰異丙醇，—20℃冰箱過(guò)夜沉淀。

將之前過(guò)夜沉淀的混合液4℃，12 000 rpm離心20 min；棄去上清，加入750 μL的75%乙醇(焦碳酸二乙酯無(wú)酶水配制)，繼續(xù)4℃，12 000 rpm離心20 min；重復(fù)上一步驟，在超凈工作臺(tái)中將指形管內(nèi)水分晾干，根據(jù)得到的RNA團(tuán)塊大小加入適量的DEPC水，65℃水浴10 min，然后放回冰上，測(cè)量RNA濃度。取1 μLRNA溶液，在260 nm和280 nm測(cè)定吸光度值，并計(jì)算A260/A280，檢測(cè)RNA的純度。

用Thermo Script反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)和OligodT18 Primer對(duì)2 μg的RNA樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)溫度為42℃，合成cDNA。

1.3.4qPCR法測(cè)定紫花苜蓿MtNRT1.3基因的表達(dá) 引物及內(nèi)參基因見(jiàn)表1，使用SYBR Premix Ex Taq (Perfect Real Time)Kit(TaKaRa Biotechnology (Dalian)Co.，Ltd．)試劑盒進(jìn)行qPCR定量測(cè)定。反應(yīng)體系為20 μL:SYBR Green Super Mix (2×)10 μL，稀釋過(guò)的cDNA 2 μL，正反引物各 0.8 μL，用超純水補(bǔ)齊。計(jì)算采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物信息

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2015 和SPSS 19.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及方差分析，Sigmaplot 10.0進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同形態(tài)氮肥對(duì)土壤pH值和銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量的影響

由圖1A可得，施有硝態(tài)氮肥的T2和T3處理組土壤pH值顯著低于T1和對(duì)照組(P<0.05)，單施銨態(tài)氮T1處理組與對(duì)照組相比差異不顯著。土壤中銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量直接關(guān)系到植物從土壤可以獲得的氮含量。從圖1B可以看出，不同處理對(duì)土壤氮含量有顯著影響，T2處理土壤中銨態(tài)氮含量顯著高于其他各組，T3處理組顯著低于其他各處理組(P<0.05)，T1處理與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)。由圖1C可以看出，T2處理土壤中硝態(tài)氮含量也顯著高于其他各處理組，與圖1B土壤中銨態(tài)氮含量不同的是T3處理硝態(tài)氮含量顯著高于T1和對(duì)照組，土壤中硝態(tài)氮含量依次為T(mén)2>T3>T1>Con，且各組間差異顯著(P<0.05)。

圖1 不同施肥處理對(duì)土壤pH及土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量的影響

2.2 不同形態(tài)氮肥對(duì)紫花苜蓿株高、根長(zhǎng)及生物量的影響

由圖2B可以看出，不同形態(tài)氮肥處理下，紫花苜蓿根長(zhǎng)差異不顯著(P>0.05)，但是株高有顯著差異。只施硝態(tài)氮肥的T2處理下紫花苜蓿株高顯著高于對(duì)照組和混合氮T3處理組，其他各組間差異不顯著(圖2A)。

圖2 不同施肥處理對(duì)紫花苜蓿株高及根長(zhǎng)的影響

施加氮肥能夠有效提高植物的生物量，由圖3A可知，各施肥處理組地上生物量顯著高于對(duì)照組，且單施銨態(tài)氮和硝態(tài)氮地上生物量顯著高于混合氮T3處理組(P<0.05)；單施銨態(tài)氮肥T1處理組地下生物量顯著高于對(duì)照組和混合氮T3處理組(P<0.05)，但與單施硝態(tài)氮肥組T2處理組相比差異不顯著(P>0.05)(圖3B)；從圖3C根冠比可以看出，單施硝態(tài)氮肥組根冠比顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，值得注意的是，對(duì)照組根冠比的比值大于其他各處理組，T1處理根冠比比值大于T3處理組，T3處理大于T2處理(P>0.05)。

圖3 不同施肥處理對(duì)紫花苜蓿地上、地下生物量及根冠比的影響

2.3 不同形態(tài)氮肥對(duì)紫花苜蓿植株銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量的影響

不同形態(tài)氮肥處理對(duì)紫花苜蓿植株銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量有顯著影響。由圖4A可知，混合氮T3處理下植物銨態(tài)氮含量顯著高于其他各處理組，且各組間差異顯著(P<0.05)，植物銨態(tài)氮含量在不同處理間依次升高(Con0.05)(圖4B)。不同處理植物葉片中氮含量對(duì)比發(fā)現(xiàn)，T2和T3處理植物銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量顯著高于T1處理組，其中T2處理紫花苜蓿硝態(tài)氮含量比T1處理高出46.7%，T3處理銨態(tài)氮含量比T1處理組高出72.6%。

圖4 不同施肥處理對(duì)紫花苜蓿地上部銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量的影響

2.4 不同形態(tài)氮肥對(duì)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因MtNRT1.3表達(dá)的影響

硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因MtNRT1.3主要在紫花苜蓿根中表達(dá)，圖5可以看出，Con組MtNRT1.3基因的表達(dá)量顯著低于其他處理組；單施硝態(tài)氮肥的T2處理該基因的表達(dá)量最高，MtNRT1.3基因的表達(dá)量顯著高于T1和T3處理組(P<0.05)；T1和T3處理組間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.5 紫花苜蓿生理特征和MtNRT1.3與土壤氮含量的關(guān)系

由表2可以看出，土壤銨態(tài)氮含量與基因MtNRT1.3、株高和土壤pH呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)；土壤硝態(tài)氮與葉銨態(tài)氮、地上生物量和基因MtNRT1.3呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，但與根冠比呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.01)。

圖5 不同施肥處理對(duì)紫花苜蓿硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因MtNRT1.3表達(dá)量的影響

3 討論

3.1 添加不同形態(tài)氮素對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

土壤具有良好的緩沖能力，一般都能維持穩(wěn)定的土壤微環(huán)境，但是有研究表明，不同施肥處理會(huì)打破土壤穩(wěn)定的pH環(huán)境[37]。植物可以直接利用土壤中的銨態(tài)氮和硝態(tài)氮，根系吸收陰陽(yáng)離子是平衡的，根系吸收銨態(tài)氮時(shí)就會(huì)向土壤中釋放H+使土壤pH值下降；吸收硝態(tài)氮時(shí)，向土壤釋放OH-致使土壤pH值升高。本試驗(yàn)銨態(tài)氮處理和混合氮處理降低了土壤pH值，硝態(tài)氮處理數(shù)值上提高了土壤pH值，但是與對(duì)照相比差異不顯著，這說(shuō)明施加銨態(tài)氮處理植物吸收銨態(tài)氮較多，從而降低了土壤pH[38,39]。圖1B T1處理組銨態(tài)氮含量與對(duì)照組無(wú)顯著差異，說(shuō)明單施銨態(tài)氮肥對(duì)土壤銨態(tài)氮含量影響較小，這與王西娜等[40]的研究一致，這也說(shuō)明銨態(tài)氮更容易被植物吸收利用；T3處理土壤中銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量顯著低于T1、T2處理，說(shuō)明混合施加硝態(tài)氮和銨態(tài)氮更有利植物根系對(duì)土壤氮素的吸收利用[41]。圖1C T1處理的硝態(tài)氮含量顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明施入土壤的銨態(tài)氮很可能被轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮，從而導(dǎo)致土壤硝態(tài)含量升高。施入土壤中的銨根離子為陽(yáng)離子，容易與土壤膠粒吸附結(jié)合，從而被硝化微生物硝化為硝酸根或亞硝酸根離子存在于土壤中[42]。

表2 紫花苜蓿生理特征及MtNRT1.3與土壤氮含量的關(guān)系

注：表中數(shù)值為Pearson相關(guān)系數(shù)，**表示相關(guān)性顯著，P<0.01

Note:The values are Pearson correlation coefficients in the table. ** Significant correlation,P< 0.01

3.2 紫花苜蓿的生長(zhǎng)及對(duì)不同形態(tài)氮素的吸收利用

植物的生長(zhǎng)離不開(kāi)氮素，施加氮肥能夠提高植物產(chǎn)量。本試驗(yàn)如圖2A所示單施硝態(tài)氮肥提高了紫花苜蓿的株高，說(shuō)明硝態(tài)氮與銨態(tài)氮相比更有利促進(jìn)紫花苜蓿的高度生長(zhǎng)。由圖3B，3C可知施氮處理明顯提高了紫花苜蓿地上、地下生物量，這結(jié)果與Hojjati等[43]研究結(jié)果一致。單施銨態(tài)氮肥使得植株地上、下生物量最高，說(shuō)明銨態(tài)氮更容易被紫花苜蓿吸收利用。根系是植物吸收利用養(yǎng)分的關(guān)鍵部位，根冠比的大小反映了植物干物質(zhì)積累方向及地上和地下的相互關(guān)系。有研究[44]表明，養(yǎng)分供應(yīng)不足時(shí)，根系的側(cè)根數(shù)量和根毛會(huì)增加來(lái)尋找更多的養(yǎng)分供應(yīng)植物生長(zhǎng)，光合產(chǎn)物會(huì)優(yōu)先配送到根部，根冠比增大，本試驗(yàn)的結(jié)果與其一致，說(shuō)明施加氮肥能夠降低植物的根冠比，有利于植物地上物質(zhì)的積累。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，單施硝態(tài)氮肥處理根冠比最低，結(jié)合圖3B T2處理與T1處理地下生物量數(shù)據(jù)得出硝態(tài)氮可能抑制了紫花苜蓿根系的生長(zhǎng)，光合產(chǎn)物優(yōu)先向地上部分運(yùn)輸。

測(cè)定紫花苜蓿中銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量時(shí)，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)(圖4A，4B)混合氮處理組的植株的銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量均較高，且兩者含量都呈現(xiàn)一種趨勢(shì)，Con<處理T1<處理T2<處理T3處理。本研究結(jié)果表明施肥能夠增加植株內(nèi)2種氮素的含量，單一施銨態(tài)氮和硝態(tài)氮并不會(huì)引起植物內(nèi)單一氮素含量增加，可能是因?yàn)?種氮素的含量在植物體內(nèi)是相對(duì)平衡的，銨態(tài)氮和硝態(tài)氮之間存在相互轉(zhuǎn)化的過(guò)程。有研究[45]表明，植物液泡中累積的硝酸鹽可以作為內(nèi)源養(yǎng)分，在外源氮素不足時(shí)會(huì)被植物體吸收轉(zhuǎn)化利用。由圖4可以得出，2種氮素配合施加更有利于氮素在體內(nèi)的積累，且硝態(tài)氮處理比銨態(tài)氮處理更有利氮素在植物體內(nèi)積累，施用硝態(tài)氮肥不僅能使紫花苜蓿吸收更多的硝態(tài)氮，還能較快地將其轉(zhuǎn)化為銨態(tài)氮積累在體內(nèi)。本研究結(jié)果顯示，紫花苜蓿宜混合施用銨態(tài)氮和硝態(tài)氮肥且以硝態(tài)氮比例較大為佳。

3.3 不同形態(tài)氮素對(duì)紫花苜蓿硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因MtNRT1.3的影響

不同形態(tài)氮素對(duì)紫花苜蓿根的刺激反應(yīng)也不同，植物為了更好地吸收利用氮素資源，形成了特定的硝酸鹽吸收同化途徑。由圖5可以看出，不同施肥處理上調(diào)了硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因MtNRT1.3的表達(dá)，其中單施硝態(tài)氮肥T2處理該基因的表達(dá)量最高，說(shuō)明硝酸鹽誘導(dǎo)了MtNRT1.3的表達(dá)，該基因編碼的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與了紫花苜蓿根對(duì)硝酸鹽的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)。同時(shí)，在T2處理中，紫花苜蓿葉片中的硝態(tài)氮含量最高，說(shuō)明該基因表達(dá)量的增加與植株對(duì)氮的吸收密切相關(guān)。此外，T1處理下MtNRT1.3的表達(dá)量也顯著高于對(duì)照組，可能是由于部分銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化成硝態(tài)氮，從而促進(jìn)了該基因的表達(dá)。在研究豆科模式植物蒺藜苜蓿NRT1.3基因的試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)MtNRT1.3參與了氮素限制反應(yīng)，提高了植株在氮素限制條件下獲得NO3-的能力[34]。Anthoni Pellizzaro等[46]發(fā)現(xiàn)，MtNRT1.3受脫落酸的刺激，并參與對(duì)蒺藜苜蓿主根生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)。上述試驗(yàn)雖然都發(fā)現(xiàn)MtNRT1.3與硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，但是其結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果不同，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在高濃度外源氮素條件下，施加不同形態(tài)氮肥使該基因的表達(dá)量顯著增加；與已有結(jié)論[34,46]相似的是，硝態(tài)氮肥可能會(huì)抑制植物地下部分的生長(zhǎng)，這可能與氮肥來(lái)源、植物生長(zhǎng)環(huán)境、土壤氮含量等因素有關(guān)。

3.4 紫花苜蓿生理特征、MtNRT1.3表達(dá)與土壤氮含量的關(guān)系

植物和土壤兩者在自然環(huán)境中存在著特定的有機(jī)聯(lián)系，當(dāng)外界環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，植物與土壤之間會(huì)產(chǎn)生不同響應(yīng)。如本試驗(yàn)表2所示，紫花苜蓿MtNRT1.3基因的表達(dá)與土壤中銨態(tài)氮、硝態(tài)氮呈正相關(guān)性，這說(shuō)明當(dāng)土壤中銨態(tài)氮和硝態(tài)氮誘導(dǎo)了紫花苜蓿MtNRT1.3基因的表達(dá)，有研究[28-29]證實(shí)MtNRT1.3類(lèi)似于擬南芥的AtNRT1.1，AtNRT1.1已被證明參與雙親和性硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，在硝酸鹽感應(yīng)系統(tǒng)中發(fā)揮了作用，該系統(tǒng)通過(guò)促進(jìn)根尖中生長(zhǎng)素的流動(dòng)來(lái)刺激根系的生長(zhǎng)[27,28]，但是本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)土壤中銨態(tài)氮含量卻與其具有正相關(guān)性，可能是因?yàn)橥寥乐羞^(guò)多的銨態(tài)氮在土壤硝化細(xì)菌的作用下轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮，從而影響MtNRT1.3的表達(dá)。所以，當(dāng)紫花苜蓿根中MtNRT1.3基因的表達(dá)量增加時(shí)，植物可以通過(guò)根系更有效地分配和利用土壤中的氮素，從而提高植株株高，增加地上生物量。通過(guò)相關(guān)分析還發(fā)現(xiàn)，土壤硝態(tài)氮的含量與植物根冠比呈負(fù)相關(guān)性，與地上生物量呈正相關(guān)性，說(shuō)明硝態(tài)氮肥更有利于紫花苜蓿把光合產(chǎn)物優(yōu)先向地上組織中運(yùn)送。

4 結(jié)論

施氮處理提高了紫花苜蓿植株中的氮含量，施加不同形態(tài)氮肥均提高了紫花苜蓿根中MtNRT1.3基因的表達(dá)量，且該基因的表達(dá)量與土壤中銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量呈正相關(guān)性；相比于銨態(tài)氮肥，施加硝態(tài)氮肥不僅增加了植株硝態(tài)氮含量，而且提高了植株銨態(tài)氮含量；相比于單施硝態(tài)氮和銨態(tài)氮肥，混合氮肥對(duì)提高植物氮含量效果最好；施加硝態(tài)氮肥更有利于紫花苜蓿地上部分生物量的累積；因此，對(duì)紫花苜蓿施加混合態(tài)氮肥，尤其是增加硝態(tài)氮肥的比例更有利于植株的生長(zhǎng)和對(duì)氮素的吸收。