紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育系相關(guān)microRNA的鑒定

郭 強(qiáng)，王英哲，陳晶晶，周 仂，徐 博*

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118； 2. 吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130033)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是一種多年生豆科苜蓿屬植物。1958年，加拿大學(xué)者發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿的雄性不育現(xiàn)象，細(xì)胞質(zhì)雄性不育(Cytoplasmic male sterility，CMS)指開(kāi)花植物不能產(chǎn)生功能性花藥、花粉或雄配子的一種遺傳學(xué)現(xiàn)象[1]，這種現(xiàn)象主要由細(xì)胞質(zhì)因子和細(xì)胞器基因控制[2]，其不育特性表現(xiàn)為雄器官的退化、畸形或功能缺失，導(dǎo)致花藥、花粉母細(xì)胞和雄配子的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生異常[3-4]。常用于作物的雜交育種。

隨著雄性不育系的發(fā)現(xiàn)，國(guó)外的眾多學(xué)者開(kāi)始采用分子技術(shù)、組織培養(yǎng)法研究遺傳機(jī)理，并利用不育系培育雜交組合和轉(zhuǎn)基因材料[5-7]；1978年，吳永敷等[8]在我國(guó)內(nèi)蒙地區(qū)從‘草原1號(hào)’中發(fā)現(xiàn)了6株紫花苜蓿雄性不育系；2008年，于洪柱等[9]發(fā)現(xiàn)了紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育材料—MS-GN。隨著紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及保持系的發(fā)現(xiàn)，對(duì)其機(jī)理的探索也在不斷深入。同時(shí)，國(guó)內(nèi)學(xué)者[10-14]對(duì)不育系展開(kāi)了同工酶分析、細(xì)胞學(xué)觀察、生殖生物學(xué)、生理生化機(jī)制等內(nèi)容的研究；利用紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育系選育雜交組合并對(duì)其F1代進(jìn)行生物學(xué)性狀及抗逆性研究[15-18]；有學(xué)者[19-21]利用SSR標(biāo)記以及BSR技術(shù)對(duì)紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因進(jìn)行了定位分析，并且對(duì)紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及其保持系的花藥發(fā)育過(guò)程進(jìn)行切片觀察，測(cè)定其在不同發(fā)育階段生理生化指標(biāo)的變化。

植物microRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度為20～26 nt的內(nèi)源性非編碼小RNA[22]。成熟的microRNA長(zhǎng)度為20～24 nt，多為21 nt[23]，其中長(zhǎng)度為21～24 nt的microRNA占主體地位。植物microRNA參與植物體內(nèi)許多重要的生命過(guò)程，擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)體內(nèi)的miR160可通過(guò)負(fù)調(diào)控生長(zhǎng)素響應(yīng)因子進(jìn)一步調(diào)控根冠細(xì)胞的發(fā)育[24]；Zea-miR390則可以調(diào)控玉米(ZeamayL.)莖尖細(xì)胞的發(fā)育及葉片的形態(tài)建成[25]；miR172，miR159，miR156/157則可以調(diào)控開(kāi)花時(shí)期[26-27]。microRNA也參與調(diào)控植物的環(huán)境適應(yīng)性，如miR398與植物的耐逆性密切相關(guān)[28]。另外，microRNA參與植物激素合成代謝與信號(hào)傳導(dǎo)，如miR160，miR164，miR167，miR528等microRNA均與生長(zhǎng)素的信號(hào)傳遞有關(guān)，其中miR167還可以參與脫落酸等其他的信號(hào)通路的傳導(dǎo)[29-30]。

基于全基因組信息可知，在許多雄性不育植物的花粉發(fā)育過(guò)程中均有大量的microRNA參與[31-33]。在擬南芥中，miR165/166參與小孢子的發(fā)育，miR156和miR159負(fù)責(zé)調(diào)控植物絨氈層細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程，miR159的靶基因?qū)儆贕AMYB(Gibberellins acid v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)家族，主要調(diào)控植物花藥細(xì)胞程序性死亡(Programmed Cell Death,PCD)過(guò)程中的赤霉素的傳導(dǎo)，miR159的異常表達(dá)會(huì)使絨氈層無(wú)法降解，最終使小孢子不能正常發(fā)育而喪失育性[34-36]。擬南芥中若缺乏miR165/166會(huì)使花藥只產(chǎn)生兩個(gè)花粉囊，最終會(huì)導(dǎo)致擬南芥的育性降低[37]；水稻(OryzasativaL.)中的OsmiR528，OsmiR159，OsmiR172d；玉米中Zea-miR397；油菜(BrassicanapusL.)中的bra-miR167，bra-miR172等miRNA都可能與植物的小孢子發(fā)育有關(guān)[31,38]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，某些miRNA可通過(guò)參與植物激素合成和應(yīng)答過(guò)程來(lái)調(diào)控花粉的發(fā)育，例如miR167缺失會(huì)引起茉莉酸的合成異常，從而導(dǎo)致花藥不開(kāi)裂以及散粉受阻；miR167的過(guò)表達(dá)同樣會(huì)引起植物不育現(xiàn)象的產(chǎn)生[30,39-41]。

植物microRNA是揭示植物雄性不育機(jī)制的有效方式之一，基于之前的研究發(fā)現(xiàn)：紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育的敗育可能與線粒體基因表達(dá)異常、淀粉蔗糖含量虧缺、絨氈層發(fā)育異常等現(xiàn)象有關(guān)[17,42]，因此，為深入探索不育機(jī)制，本試驗(yàn)利用small RNA-seq技術(shù)，找到雄性不育相關(guān)的miRNA，為更好地利用紫花苜蓿不育系進(jìn)行雜交育種工作提供理論基礎(chǔ)，以期選育出更具優(yōu)良性狀的種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所選用的材料為紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育系MSGN1A及其對(duì)應(yīng)的同型保持系MSGN1B，MSGN1A和MSGN1B是以具有雄性不育性的‘公農(nóng)3號(hào)’為供體母本株系，通過(guò)保持系篩選，回交4代后選育出來(lái)的。所有植物材料均由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。MSGN1A和MSGN1B的個(gè)體植株于2016年4月在吉林省長(zhǎng)春市吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)試驗(yàn)田種植。選取現(xiàn)蕾期24 h的花藥部分，用于提取總RNA，備用。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1總RNA的提取及質(zhì)量控制 參照Garg等[43]的方法提取MSGN1A和MSGN1B花藥總RNA，用紫外分光光度計(jì)分別在230，260和280 nm處測(cè)定吸光值(OD230，OD260和OD280)，OD260/OD280和OD260/OD230均須≥1.8。采用Agilent 2100生物分析儀檢測(cè)總RNA的完整性，總RNA完整性值在8.0～10.0的樣品可用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2small RNA文庫(kù)構(gòu)建 將提取到的總RNA送北京百邁克生物技術(shù)公司，完成small RNA文庫(kù)的構(gòu)建及測(cè)序工作。提取兩個(gè)樣品總RNA，使用聚丙烯酰胺凝膠電泳法根據(jù)片段的長(zhǎng)度分離RNA并回收長(zhǎng)度在18～30 nt之間的條帶，構(gòu)建2個(gè)small RNA文庫(kù)。

1.2.3miRNA的鑒定與分析 對(duì)已知miRNA的鑒定，采用miRBase(v21)軟件將比對(duì)上參考基因組的reads序列與known miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)中的成熟miRNA序列進(jìn)行序列比對(duì)。若序列與known miRNA完全一致，則這個(gè)reads將被認(rèn)為是鑒定到的known miRNA。

考慮到miRNA的生物學(xué)特征，對(duì)于沒(méi)有被鑒定到known miRNA的序列，使用miRDeep 2軟件對(duì)novel miRNA做預(yù)測(cè)。利用miRDeep 2軟件包，將reads比對(duì)到基因組上的位置信息，得到可能的前體序列，根據(jù)reads在前體序列上的分布信息及前體結(jié)構(gòu)能量信息，使用貝葉斯模型經(jīng)打分最終實(shí)現(xiàn)novel miRNA的預(yù)測(cè)。

1.2.4差異表達(dá)miRNA篩選及其靶基因功能注釋 以|log2(FC)|≥1；FDR≤0.01作為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)的microRNA。差異倍數(shù)(Fold Change，F(xiàn)C)表示兩樣品間表達(dá)量的比值。

依據(jù)known miRNA和novel miRNA與對(duì)應(yīng)物種的基因序列信息，使用Target Finder軟件[40]對(duì)miRNA靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。

基因功能注釋由北京百邁客生物技術(shù)公司進(jìn)行，差異表達(dá)miRNA靶基因的功能注釋所使用的數(shù)據(jù)庫(kù)為GO (Gene Ontology，http://www.geneontology.org/)和KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http://www.genome.jp/kegg/)。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

對(duì)測(cè)序得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，每個(gè)樣品的Clean Data均大于14.91 M。細(xì)胞質(zhì)雄性不育系MSGN1A及其同型保持系MSGN1B的Raw reads分別為27.83 M和28.28 M，Clean reads分別為20.24 M和14.91 M，Q30(質(zhì)量值大于30)分別為98.87%和99.03%。

表1 測(cè)序數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計(jì)表

2.2 miRNA的鑒定

為了進(jìn)一步鑒定已知的miRNA，將比對(duì)上參考基因組的reads序列與已知miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)miRBase(v21)中的成熟miRNA序列進(jìn)行比對(duì)。序列與已知miRNA完全相同的reads被認(rèn)為是鑒定到的已知miRNA。針對(duì)miRNA的生物特征，對(duì)于未鑒定到known miRNA的序列，利用miRDeep 2軟件進(jìn)行novel miRNA的預(yù)測(cè)。通過(guò)鑒定，本試驗(yàn)共檢測(cè)到1 478個(gè)miRNA，其中已知miRNA 1 351個(gè)，novel miRNA 127個(gè)(表2)。

表2 miRNA統(tǒng)計(jì)結(jié)果

試驗(yàn)檢測(cè)到1 351個(gè)known miRNA，分屬于136個(gè)miRNA家族，部分結(jié)果如圖1所示。每個(gè)家族中所含miRNA的數(shù)量和表達(dá)水平不盡相同，其中包括屬于miR166家族的247個(gè)miRNA，miR167家族的159個(gè)miRNA，miR160的家族124個(gè)的miRNA，miR172家族的105個(gè)miRNA，mi156家族的98個(gè)miRNA，miR319家族的88個(gè)miRNA等。成熟miRNA長(zhǎng)度主要集中在20 nt到24 nt的范圍內(nèi)，其中植物的miRNA以21 nt或24 nt為主，試驗(yàn)鑒定出的novel miRNA的長(zhǎng)度主要為21 nt，其次是24 nt和22 nt。

圖1 部分已知miRNA在miRNA家族中所含數(shù)量

2.3 差異表達(dá)miRNA的篩選與鑒定

在差異表達(dá)miRNA檢測(cè)過(guò)程中，使用|log2(FC)|≥1；FDR≤0.01作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)共計(jì)篩選出差異表達(dá)miRNA 130個(gè)，包括90個(gè)上調(diào)表達(dá)的miRNA和40個(gè)下調(diào)表達(dá)的miRNA。試驗(yàn)共鑒定到40個(gè)差異表達(dá)的已知miRNA，分屬于15個(gè)miRNA家族，與保持系MSGN1B相比，紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育系MSGN1A中有24個(gè)上調(diào)表達(dá)miRNA，有16個(gè)下調(diào)表達(dá)的差異miRNA。

表3 差異表達(dá)的已知miRNA

2.4 miRNA靶基因預(yù)測(cè)

根據(jù)known miRNA和novel miRNA與其對(duì)應(yīng)物種的基因序列信息，使用Target Finder軟件進(jìn)行靶基因的預(yù)測(cè)，1 351個(gè)known miRNA中，有1 347個(gè)miRNA預(yù)測(cè)到靶基因，靶基因數(shù)目為9 848個(gè)；127個(gè)novel miRNA中，有126個(gè)miRNA預(yù)測(cè)到8 252個(gè)靶基因。注釋到的靶基因數(shù)目為16 458個(gè)。

表4 miRNA靶基因數(shù)目預(yù)測(cè)統(tǒng)計(jì)

2.5 差異表達(dá)miRNA靶基因注釋

試驗(yàn)共得到16 458個(gè)靶基因，其中10 637個(gè)靶基因獲得功能注釋信息，紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育系MSGN1A與其同型保持系MSGN1B間注釋的差異表達(dá)miRNA靶基因在各注釋庫(kù)中的數(shù)目統(tǒng)計(jì)見(jiàn),表5，共有10 637個(gè)miRNA靶基因被各個(gè)注釋庫(kù)注釋到，其中COG注釋庫(kù)中有3 104個(gè)miRNA靶基因被注釋到，包括815個(gè)差異表達(dá)miRNA靶基因；GO注釋庫(kù)中有5 147個(gè)miRNA靶基因被注釋到，包括1 264個(gè)差異表達(dá)miRNA靶基因；KEGG注釋庫(kù)中有3 479個(gè)miRNA靶基因被注釋到，包括861個(gè)差異表達(dá)miRNA靶基因；KOG注釋庫(kù)中有5 620個(gè)miRNA靶基因被注釋到，包括1 286個(gè)差異表達(dá)miRNA靶基因；Pfam注釋庫(kù)中有8 309個(gè)miRNA靶基因被注釋到，包括1 871個(gè)差異表達(dá)miRNA靶基因；Swissprot注釋庫(kù)中有6 535個(gè)miRNA靶基因被注釋到，包括1 662個(gè)差異表達(dá)miRNA靶基因；eggNOG注釋庫(kù)中有9 133個(gè)miRNA靶基因被注釋到，包括2 261個(gè)差異表達(dá)miRNA靶基因；Nr注釋庫(kù)中有6 535個(gè)miRNA靶基因被注釋到，包括2 612個(gè)差異表達(dá)miRNA靶基因。

表5 miRNA靶基因注釋統(tǒng)計(jì)表

2.5.1GO注釋分類(lèi) 對(duì)差異表達(dá)miRNA靶基因進(jìn)行GO分類(lèi)，共計(jì)1 264個(gè)miRNA靶基因得到注釋。按照GO的三個(gè)大類(lèi)進(jìn)行下一次級(jí)分類(lèi)，共分成41個(gè)功能群，其中包括18個(gè)生物學(xué)過(guò)程，12個(gè)細(xì)胞成分，11個(gè)分子功能(圖2)。

圖2 差異表達(dá)miRNA靶基因GO注釋分類(lèi)

在生物學(xué)過(guò)程中，“代謝過(guò)程”所占比例最大，其次是“細(xì)胞過(guò)程”、“信號(hào)生物過(guò)程”、“生物調(diào)控”、“刺激應(yīng)答”、“定位”、“細(xì)胞成分組織或生物合成”等生物學(xué)過(guò)程，它們的占比均大于10%；“發(fā)育過(guò)程”、“多細(xì)胞生物過(guò)程”、“繁殖過(guò)程”、“信號(hào)”、“多生物過(guò)程”、“生長(zhǎng)”、“繁殖”、“免疫系統(tǒng)過(guò)程”等生物學(xué)過(guò)程的占比均在1%～10%之間；“生物附著”、“生物相”、“節(jié)律過(guò)程”的占比在0.1%～1.0%之間。

在細(xì)胞組分類(lèi)別中，“細(xì)胞部分”和“細(xì)胞”占比最大，緊接著是“細(xì)胞器”、“膜”、“細(xì)胞器部分”、“高分子配合物”，其占比均大于10%；“胞外區(qū)”和“細(xì)胞連接”的占比在1%～10%之間；“膜封閉腔”、“病毒”以及“病毒部分”的占比在0.1%～1.0%之間。

在分子功能類(lèi)別中，“合成”和“催化活性”是最大的功能類(lèi)別；其次是“轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性”、“核酸合成轉(zhuǎn)錄因子活性”、“電子傳遞體活性”、“結(jié)構(gòu)分子活性”、“酶調(diào)節(jié)活性”以及“分子傳感器活性”，占比均在占比在1%～10%之間；最后是“抗氧化劑活性”、“受體活性”、“蛋白合成轉(zhuǎn)錄因子活性”和“鳥(niǎo)苷酸交換因子活性”，占比均不到1%。

圖3 差異表達(dá)miRNA靶基因KEGG通路注釋

2.5.2KEGG通路分析 對(duì)差異表達(dá)miRNA靶基因進(jìn)行KEGG通路分析，差異表達(dá)miRNA靶基因所涉及的通路的類(lèi)別主要包括：“細(xì)胞進(jìn)程”、“環(huán)境信息過(guò)程”、“基因信息過(guò)程”、“代謝”、“生物系統(tǒng)”等五個(gè)大類(lèi)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步分為82個(gè)類(lèi)別，其中有24個(gè)靶基因注釋到“代謝”中的“氨基酸生物合成”通路中，占比為5.61%；18個(gè)靶基因注釋為“內(nèi)吞作用”通路中，占比4.21%；16個(gè)靶基因注釋到“核糖體”通路中，占比為3.74%；“RNA轉(zhuǎn)運(yùn)”和“碳代謝”通路中分別有15個(gè)靶基因被注釋到，占比均為3.50%；“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)過(guò)程”、“泛素介導(dǎo)的蛋白水解作用”、“植物激素信號(hào)傳導(dǎo)”通路中分別有14個(gè)靶基因被注釋到，占比均為3.27%；有13個(gè)靶基因被注釋到“剪接體”通路中，占比為3.04%；“氨基糖和核糖代謝”和“氧化磷酸化”通路中有12個(gè)靶基因被注釋到，占比均為2.8%；“淀粉蔗糖代謝”通路中有8個(gè)靶基因被注釋到，占比為1.87%。

2.6與花藥發(fā)育相關(guān)的miRNA

在差異表達(dá)的miRNA中，mtr-miR5256的靶基因的功能注釋為“glucan ando-1,3-beta-glucosidase 4”,該基因參與淀粉蔗糖代謝。miR159靶基因的功能注釋為“MYB transcription factor”，“MYB轉(zhuǎn)錄因子”是花分生組織識(shí)別基因的啟動(dòng)子。miR172靶基因功能注釋為“AP2 Domain transcription factor”，AP2類(lèi)似轉(zhuǎn)錄因子主要調(diào)控花器分化和花期。miR396靶基因功能注釋為“生長(zhǎng)調(diào)控因子HSP70蛋白”，miR169靶基因功能注釋為“CBF HAP2 like protein”，其主要作用是調(diào)控花期，這些差異表達(dá)的miRNA均有可能導(dǎo)致花粉敗育。

3 討論

MiR159靶基因的功能注釋為“MYB transcription factor”，“MYB轉(zhuǎn)錄因子”是花分生組織識(shí)別基因的啟動(dòng)子。MYB是谷物糊粉蛋白細(xì)胞中赤霉素(Gibberellic acid，GA)信號(hào)的組成部分，在花的發(fā)育過(guò)程中起著重要作用[44]。陶?qǐng)@[45]認(rèn)為，擬南芥轉(zhuǎn)錄因子ICE1(Inducer of CBF Expression 1)通過(guò)調(diào)控GAMYB基因來(lái)調(diào)節(jié)赤霉素信號(hào)傳導(dǎo)，從而影響花粉育性并調(diào)控植物生長(zhǎng)。miR159的過(guò)量表達(dá)會(huì)引起與花發(fā)育過(guò)程相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子MYB的表達(dá)異常，從而進(jìn)一步影響到花粉絨氈層的正常代謝，包括絨氈層的形態(tài)和結(jié)構(gòu)異常等[46]。在本研究中miR159b和miRNA159c均下調(diào)表達(dá)，miRNA159d上調(diào)表達(dá)，這些miRNA的表達(dá)異常讓我們有理由認(rèn)為miR159家族與紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育有著密切聯(lián)系。

試驗(yàn)所得結(jié)果中miR172，miR172a，miR172d相較于保持系來(lái)說(shuō)，在不育系中均上調(diào)表達(dá)，miR172靶基因功能注釋為“AP2 Domain transcription factor”，AP2-like轉(zhuǎn)錄因子主要調(diào)控花器分化和花期。AP2-like轉(zhuǎn)錄因子對(duì)花器官的生成是至關(guān)重要的，如果花器官發(fā)育出現(xiàn)異常情況(如花絲和花粉囊發(fā)育異常)就很可能會(huì)使花粉粒無(wú)法正常發(fā)育，從而導(dǎo)致花粉敗育[47]。Chen等[48]研究認(rèn)為，miR172過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致植株的花期提前以及花器官發(fā)育畸形，其表型與ap2突變體表型類(lèi)似，最終導(dǎo)致配子異常發(fā)育。因此，miR172在不育系中的表達(dá)量降低也可能導(dǎo)致花粉敗育，具體的調(diào)控模式還需進(jìn)一步研究。

miR396靶基因功能注釋為“生長(zhǎng)調(diào)控因子HSP70蛋白”。試驗(yàn)結(jié)果顯示miR396家族的miR396，miR396a，miR396b-5p，miR396c-5p，miR396d，miR396e等miRNA在不育系中上調(diào)表達(dá)，而miR396在初級(jí)和成熟的miRNA中都具有高度保守性，是“擬南芥生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子”家族成員[49-50]。Yang等[51]認(rèn)為miRNA396介導(dǎo)的NtGRF-like基因表達(dá)調(diào)控通路與煙草葉片和花的發(fā)育過(guò)程密不可分，這些miRNA對(duì)應(yīng)的靶基因調(diào)控花的發(fā)育過(guò)程，也就是說(shuō)，miR396的異常表達(dá)可能影響花的發(fā)育。

由結(jié)果可知，與保持系相比，miR169c在不育系中上調(diào)表達(dá)，miR169靶基因功能注釋為“CBF HAP2 like protein”，其主要作用是調(diào)控花期，擬南芥miR169家族成員是發(fā)育過(guò)程和刺激通路中普遍存在的調(diào)控因子[52]。因此，miR169的表達(dá)量降低會(huì)可能導(dǎo)致花期的提前或延遲，影響花藥的發(fā)育等過(guò)程。

4 結(jié)論

差異表達(dá)microRNA靶基因功能注釋結(jié)果顯示，與紫花苜蓿細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的差異表達(dá)microRNA家族主要有4個(gè)，包括miR159，miR172，miR396，miR169；其靶基因的功能主要是調(diào)控花藥的發(fā)育，其次是調(diào)控花期以及信號(hào)傳導(dǎo)；micro RNA靶基因主要涉及的通路有：“代謝過(guò)程”、“信號(hào)生物過(guò)程”、“植物激素信號(hào)傳導(dǎo)”、“氧化磷酸化”和“淀粉蔗糖代謝”等，而差異表達(dá)microRNA靶向的轉(zhuǎn)錄因子中多為控制花期、花藥發(fā)育和信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程的因子，對(duì)不育系的敗育起到一定的影響。本試驗(yàn)結(jié)果可初步揭示紫花苜蓿不育系的分子機(jī)理，為利用紫花苜蓿不育系進(jìn)行雜交育種提供理論基礎(chǔ)，從而選育出具有優(yōu)良性狀的紫花苜蓿種質(zhì)資源。