柳枝稷TIFY基因家族的鑒定與分析

趙曉曉，謝坤良，張舒夢(mèng)，張 超，奚亞軍，孫風(fēng)麗

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

TIFY基因家族是植物中特有的轉(zhuǎn)錄因子超家族，因含有高度保守的TIF [F/Y]XG氨基酸序列而得名，依據(jù)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及進(jìn)化關(guān)系分為TIFY，PPD，ZIM/ZML(ZIM-like)，JAZ四個(gè)亞家族[1-2]。TIFY家族成員可調(diào)控多種生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程及脅迫防御反應(yīng)：牽?；?Pharbitisnil)的PnFL-2蛋白[3]含有TIFY家族典型的TIFY與CCT域，可能在花誘導(dǎo)中發(fā)揮作用；過(guò)表達(dá)水稻(Oryzasativa)OsTIFY11b[4]使得莖稈積累了更多的碳水化合物，進(jìn)而促進(jìn)種子大小與粒重增加；香蕉(Musaacuminate)MaTIFY1b[5]參與果實(shí)的成熟；擬南芥(Arabidopsisthaliana)PPD2[6]與NINJA共同調(diào)節(jié)葉片整齊度；野大豆(Glycinesoja)GsTIFY[7]參與碳酸氫鹽脅迫反應(yīng)；毛竹(Phyllostachysedulis)PeTIFY[8]在脫水及冷脅迫中起作用；木豆(Cajanuscajan) CcTIFY[9]調(diào)控植株在銅脅迫下的響應(yīng)。TIFY基因家族全基因組分析自擬南芥[1]、水稻[10]、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)[11]等模式作物以后，已分別在雷蒙德氏棉(Gossypiumraimondii)[12]、玉米(Zeamays)[13]、小麥(Triticumaestivum)[14]等植物中相繼報(bào)道。

JAZ蛋白(JAZs)隸屬TIFY基因家族的JAZ亞家族，是茉莉酸(jasmonic acid，JA)信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄抑制因子[15]。JAZs不含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，必須依賴蛋白間的互作行使功能[1]：JAZ蛋白N末端弱保守的NT結(jié)構(gòu)域可與DELLA蛋白互作[16]，DELLAs主要作用是抑制赤霉素(gibberellin，GA)信號(hào)傳遞，兩者的互作使得JA與GA信號(hào)通路聯(lián)系起來(lái)，調(diào)控植物的生長(zhǎng)-防御平衡；ZIM結(jié)構(gòu)域保守的TIFY基序是JAZs形成同源或異源二聚物的基礎(chǔ)[17]，ZIM結(jié)構(gòu)域與NINJA和TPL阻遏蛋白的互作抑制了JA信號(hào)通路中MYC轉(zhuǎn)錄因子的活性[18]，JA應(yīng)答基因的表達(dá)被關(guān)閉；JAZ蛋白C末端的Jas結(jié)構(gòu)域十分保守，可與EIN3、EIL1[19]等轉(zhuǎn)錄因子互作，使得JA信號(hào)通路與乙烯(ethylene，Eth)信號(hào)通路交聯(lián)，進(jìn)而調(diào)控植株的發(fā)育及抗病性。研究報(bào)道JA介導(dǎo)的JAZs轉(zhuǎn)錄水平的變化與生長(zhǎng)素(auxin，IAA)、Eth，GA及油菜素內(nèi)脂(brassinolide，BRs)等激素信號(hào)的調(diào)節(jié)相關(guān)，這些激素形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、激素應(yīng)答及脅迫響應(yīng)等方面發(fā)揮作用[20]。

柳枝稷(PanicumvirgatumL.)為禾本科黍?qū)俣嗄晟鶦4草本植物，因具有生物質(zhì)產(chǎn)量大、纖維素含量高、抗逆性強(qiáng)、可在邊際土地生長(zhǎng)、水肥需求少、對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，成為國(guó)際上公認(rèn)的模式能源作物[21-22]，TIFY基因家族具有多種的生物學(xué)功能，但在柳枝稷中尚未開(kāi)展相關(guān)研究。本研究鑒定了柳枝稷基因組中的TIFY家族成員，并對(duì)其染色體定位、進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、保守基序組成、啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件及時(shí)空表達(dá)模式等生物信息進(jìn)行了分析，且通過(guò)定量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了部分成員的激素應(yīng)答及脅迫響應(yīng)特性，從而為揭示TIFY基因家族在柳枝稷中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 柳枝稷TIFY基因家族的鑒定

從JGI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://jgi.doe.gov/)下載柳枝稷蛋白數(shù)據(jù)，同時(shí)在Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pfam.xfam.org/)提取TIFY(PF06200)的隱馬爾科夫模型矩陣文件，然后利用HMMER搜索含有TIFY保守結(jié)構(gòu)域的柳枝稷蛋白序列并通過(guò)結(jié)構(gòu)域可視化及序列多重比對(duì)等方法再次確認(rèn)其結(jié)構(gòu)域是否完整，最終得到柳枝稷TIFY基因家族成員。

1.2 柳枝稷TIFY基因家族的分析

TIFY系統(tǒng)進(jìn)化分析：將擬南芥AtTIFY[1]、水稻OsTIFY[10]及篩選到的柳枝稷TIFY蛋白序列提交到MEGA5.0進(jìn)行序列多重比對(duì)，然后采用NJ(Neighbor-Joining)法繪制種間進(jìn)化樹(shù)，設(shè)定自舉值為1000；

柳枝稷TIFY染色體定位分析：從JGI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://jgi.doe.gov/)下載的基因組數(shù)據(jù)中提取基因位置信息，結(jié)合柳枝稷染色體數(shù)目及長(zhǎng)度等信息，利用MapDraw軟件繪制基因的染色體定位圖譜；

柳枝稷TIFY種內(nèi)進(jìn)化分析：將柳枝稷TIFY蛋白序列經(jīng)MEGA5.0多重比對(duì)后采用NJ法繪制進(jìn)化樹(shù)，自舉值1 000；

柳枝稷TIFY基因結(jié)構(gòu)分析：將柳枝稷TIFY家族成員的CDS序列及Genomics序列提交至GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/indx.php)在線軟件，對(duì)每個(gè)成員的外顯子與內(nèi)含子分布情況進(jìn)行分析；

柳枝稷TIFY保守基序分析：將柳枝稷TIFY蛋白序列提交至MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)，設(shè)定搜索motif的個(gè)數(shù)為6，其它選項(xiàng)為默認(rèn)參數(shù)；

柳枝稷TIFY啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析：從JGI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://jgi.doe.gov/)提取基因上游2000bp片段，提交至PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)。

柳枝稷TIFY時(shí)空表達(dá)模式分析：從JGI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://jgi.doe.gov/)獲得各基因在不同組織的表達(dá)量數(shù)據(jù)，使用HemI軟件制作組織特異性表達(dá)圖譜。

1.3 部分成員的表達(dá)特性分析

植物材料及處理：挑選籽粒飽滿、大小均勻的柳枝稷低地型品種“Alamo”種子，先后使用70%無(wú)水乙醇表面消毒1 min，10%次氯酸鈉溶液滅菌5 min，然后使用無(wú)菌水沖洗3～4次，置于4℃條件下過(guò)夜，次日將處理過(guò)的種子置于帶有濾紙的培養(yǎng)皿上，于27℃(16 h/8 h)光照培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)。待幼苗根長(zhǎng)2 cm左右時(shí)，轉(zhuǎn)移至水培容器內(nèi)繼續(xù)在光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔2～3 d換一次培養(yǎng)液，水培3周后用于激素與脅迫處理。激素處理參照水稻幼苗處理方式[10]，脅迫處理參照二穗短柄草幼苗處理方式[11]。取材部位為葉片，經(jīng)液氮處理后于—80℃保存。

RNA提取及熒光定量PCR：利用RNAiso Plus提取上述材料總RNA，參照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)基因特異引物；按照TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)說(shuō)明書(shū)配置熒光定量PCR體系10 μl；使用QuantStudioTM3 Flex Real-Time PCR System進(jìn)行PCR反應(yīng)，兩步法；利用SigmaPlot12.5軟件處理數(shù)據(jù)、制作圖表，相對(duì)表達(dá)量以2-△△CT法計(jì)算。引物序列如表1所示。

表1 熒光定量PCR引物列表

注：PviTIFY10aF與PviTIFY10aR同時(shí)擴(kuò)增PviTIFY10e，PviTIFY10f與PviTIFY10a基因；PviTIFY10bF與PviTIFY10bR同時(shí)擴(kuò)增PviTIFY10g，PviTIFY10h與PviTIFY10b基因；EF-1-alpha為柳枝稷實(shí)時(shí)熒光定量PCR的內(nèi)參基因[23]

Note:PviTIFY10aFandPviTIFY10aRsimultaneously amplifiedPviTIFY10e,PviTIFY10fandPviTIFY10agenes;PviTIFY10bFandPviTIFY10bRsimultaneously amplifiedPviTIFY10g,PviTIFY10handPviTIFY10bgenes;EF-1-alphawas the internal reference gene of qPCR in switchgrass[23]

2 結(jié)果與分析

2.1 柳枝稷TIFY基因家族的鑒定

在柳枝稷基因組中共鑒定到48個(gè)TIFY序列，命名為PviTIFY(區(qū)別于菜豆(PhaseolusvulgarisL.)的TIFY序列PvTIFY[24])，命名順序參照OsTIFY，分屬ZML(7個(gè))、TIFY(1個(gè))、JAZ(40個(gè))3個(gè)亞家族。其基本信息如表2所示，PviTIFY的CDS全長(zhǎng)465～1 323 bp不等，編碼蛋白的氨基酸數(shù)目154～440個(gè)不等，TIFY保守基序呈現(xiàn)多種形式。

2.2 TIFY基因家族的進(jìn)化分析

將柳枝稷PviTIFY序列、水稻OsTIFY序列及擬南芥AtTIFY序列共計(jì)86個(gè)蛋白序列進(jìn)行多重比對(duì)后利用MEGA5.0構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，如圖1所示，TIFY基因家族的4個(gè)亞家族成員構(gòu)成及分布如下，PPD亞家族僅包含雙子葉植物擬南芥的AtTIFY4a與AtTIFY4b；TIFY亞家族包含OsTIFY8、PviTIFY8a與AtTIFY8，但AtTIFY8與其他蛋白序列親緣關(guān)系較遠(yuǎn)而同PviTIFY8b位于單獨(dú)分枝；ZML亞家族由3個(gè)物種的TIFY1與TIFY2構(gòu)成，共計(jì)14個(gè)成員；剩余其它蛋白序列分屬JAZ亞家族，可分為以下3個(gè)類群，JAZⅠ，JAZⅡ，JAZⅢ，其中JAZⅠ僅包含PviTIFY與OsTIFY序列，共計(jì)19個(gè)；JAZⅡ含有最多的PviTIFY序列，占比為13/22；JAZⅢ包含的TIFY序列數(shù)目最多，計(jì)25個(gè)。

2.3 PviTIFY的染色體定位

依據(jù)基因組數(shù)據(jù)信息，對(duì)48個(gè)PviTIFY基因進(jìn)行染色體定位，如圖2所示，除PviTIFY5b與PviTIFY11s位于沒(méi)有拼接到染色體的scaffolds上，其余46個(gè)PviTIFY分別定位于染色體1，2，4，5，6，7，8，9。在染色體9分布的PviTIFY數(shù)目最多，計(jì)24個(gè)，包含了PviTIFY11中除PviTIFY11s以外的所有成員，且形成了4個(gè)基因簇，9K與9N各兩個(gè)；其次為染色體2與染色體7，分別含有9個(gè)PviTIFY與6個(gè)PviTIFY；染色體4與染色體6均含有2個(gè)PviTIFY；染色體1N、染色體5K及染色體8K則各含有1個(gè)PviTIFY，分別是PviTIFY9c，PviTIFY8b與PviTIFY8a。

表2 柳枝稷TIFY基因家族基本信息

圖1 擬南芥、水稻、柳枝稷中TIFY的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4 PviTIFY的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

按照PviTIFY的進(jìn)化樹(shù)順序，分析了各成員的基因結(jié)構(gòu)與保守基序組成，如圖3所示：

PviTIFY10與PviTIFY11位于鄰近的兩個(gè)進(jìn)化枝，含有相同的motif組成，即N-terminal，TIFY，Jas，歸屬JAZ亞家族。在8個(gè)PviTIFY10成員中，除PviTIFY10c外，其他PviTIFY10均由5個(gè)外顯子與4個(gè)內(nèi)含子組成，與PviTIFY10位于同一進(jìn)化枝的PviTIFY11c，PviTIFY11d，PviTIFY11g，PviTIFY11j，PviTIFY11k，基因結(jié)構(gòu)由3個(gè)外顯子與2個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，而位于其鄰近進(jìn)化枝的剩余PviTIFY11成員均不含內(nèi)含子。結(jié)合進(jìn)化關(guān)系與結(jié)構(gòu)特點(diǎn)將以上成員分屬JAZⅠ組與JAZⅡ組。

PviTIFY3，PviTIFY5，PviTIFY6，PviTIFY9及PviTIFY8b雖位于不同進(jìn)化枝，但保守基序均由TIFY motif與Jas motif組成，同屬JAZ亞家族。其中PviTIFY6的外顯子與內(nèi)含子數(shù)目最多，含有7個(gè)外顯子與6個(gè)內(nèi)含子(PviTIFY6c含有6個(gè)外顯子與5個(gè)內(nèi)含子)，其次為PviTIFY9與PviTIFY3a，由5個(gè)外顯子與4個(gè)內(nèi)含子組成，而PviTIFY3b與PviTIFY3c則由4個(gè)外顯子與3個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，PviTIFY8b與PviTIFY5的外顯子與內(nèi)含子數(shù)目相對(duì)較少，且PviTIFY5a無(wú)3，UTR。以上成員劃歸JAZⅢ組。

PviTIFY8a僅含有TIFY motif，為TIFY亞家族成員，基因結(jié)構(gòu)由3個(gè)外顯子與3個(gè)內(nèi)含子組成，歸于TIFY組。

PviTIFY1與PviTIFY2含有其他亞家族成員沒(méi)有的GATA Zn-finger結(jié)構(gòu)域，為ZML亞家族成員。在PviTIFY1成員中，PviTIFY1b的內(nèi)含子與外顯子數(shù)目最多，由9個(gè)外顯子與8個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，且其長(zhǎng)度在48個(gè)PviTIFY中最長(zhǎng)，其他成員則由8個(gè)外顯子與7個(gè)內(nèi)含子組成，PviTIFY2均含有7個(gè)外顯子與6個(gè)內(nèi)含子，且PviTIFY2b無(wú)5’UTR。以上成員歸為ZML組

TIFY各成員在柳枝稷內(nèi)的分組結(jié)果同其在物種間的劃分結(jié)果(圖1)一致，且每組內(nèi)進(jìn)化關(guān)系較近的成員間具有近乎相同的內(nèi)含子/外顯子組成及蛋白保守基序分布。

圖2 PviTIFY在染色體的分布

圖3 PviTIFY的進(jìn)化樹(shù)、基因結(jié)構(gòu)及保守基序

2.5 PviTIFY啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析

柳枝稷TIFY基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3所示，除PviTIFY11m與PviTIFY11s外，其他46個(gè)柳枝稷TIFY成員的啟動(dòng)子區(qū)都存在4～10種調(diào)控元件，其中大部分成員(60%以上)含有光響應(yīng)、厭氧與缺氧脅迫及JA，ABA信號(hào)調(diào)控元件，半數(shù)成員包含干旱脅迫及GA，IAA信號(hào)調(diào)控元件，少部分成員含有低溫脅迫及SA信號(hào)調(diào)控元件，另有極少部分成員包含生物鐘、細(xì)胞周期及創(chuàng)傷應(yīng)激調(diào)控元件。綜上所述，柳枝稷TIFY基因啟動(dòng)區(qū)存在多種脅迫響應(yīng)元件及激素信號(hào)調(diào)控元件，可能在柳枝稷抗逆反應(yīng)及激素信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮作用。

表3 PviTIFY啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析

2.6 PviTIFY時(shí)空表達(dá)模式分析

柳枝稷TIFY成員在各種組織及發(fā)育階段的表達(dá)特性如圖4所示，PviTIFY中表達(dá)量較高的是10b，10g，10h，10a，10e，10f與11j，11k，11c，11b，11h及6b，6d，這些成員均為JAZ亞家族成員(圖3)。PviTIFY10的6個(gè)成員在剛出現(xiàn)的花序、授粉后25 d的小花與V3期的根中表達(dá)量最高，尤其是PviTIFY10b，它在各種組織與發(fā)育階段的表達(dá)量均是最高的；PviTIFY11的5個(gè)成員在授粉后25 d與30 d的小花中表達(dá)量較高，且PviTIFY11b與PviTIFY11h在V1與V3期的根、整個(gè)地上部、E4期的維管束及剛出現(xiàn)的花序中也有較高表達(dá)；PviTIFY6的兩個(gè)成員中PviTIFY6b在剛出現(xiàn)的花序、E4期的的莖與葉中表達(dá)量較高，在根與地上部也有表達(dá)。綜上所述，這些表達(dá)量較高的PviTIFY10與PviTIFY11可能在花序與根的發(fā)育中發(fā)揮作用，還可能影響產(chǎn)量的形成，而PviTIFY6則可能在植株形態(tài)建成中發(fā)揮功能。

圖4 PviTIFY時(shí)空表達(dá)模式

2.7 PviTIFY10各成員的表達(dá)特性

為驗(yàn)證柳枝稷TIFY成員的激素應(yīng)答及脅迫響應(yīng)特性，我們選取了表達(dá)量較高的PviTIFY10計(jì)8個(gè)基因進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)。

各成員在不同激素處理下的表達(dá)特性如圖5所示：PviTIFY10a，PviTIFY10e與PviTIFY10f在JA處理下表達(dá)量升高，在其他激素處理下表達(dá)量變化不大；PviTIFY10b，PviTIFY10g與PviTIFY10h在JA與IAA處理?xiàng)l件下表達(dá)量是升高的，而在其他激素處理?xiàng)l件下呈現(xiàn)不同程度的下調(diào)表達(dá)；PviTIFY10c在JA處理下表達(dá)量升高最明顯，同時(shí)也受到其他激素不同程度的誘導(dǎo)作用；PviTIFY10d在JA處理?xiàng)l件下先下調(diào)表達(dá)后逐漸上調(diào)表達(dá)，對(duì)其他激素處理響應(yīng)模式規(guī)律性較差。對(duì)每種激素來(lái)說(shuō)，JA可誘導(dǎo)PviTIFY10各成員的表達(dá)，IAA對(duì)PviTIFY10各成員均無(wú)抑制作用；SA，Eth，GA，ABA均可誘導(dǎo)PviTIFY10c，但對(duì)PviTIFY10b，PviTIFY10g與PviTIFY10h的表達(dá)是抑制的。

各基因的脅迫響應(yīng)模式如圖6所示，PviTIFY10各成員在三種脅迫下的表達(dá)模式相同，即鹽處理下各基因的表達(dá)量迅速升高，其中PviTIFY10d在鹽脅迫下表達(dá)量升高最明顯；干旱處理下各基因同樣上調(diào)表達(dá)，且PviTIFY10c表達(dá)量最高；在冷脅迫中各基因表達(dá)量變化不明顯，除PviTIFY10c外，其他成員呈現(xiàn)較低的敏感性。

圖5 PviTIFY10各成員在不同激素處理下的表達(dá)模式

綜上所述，PviTIFY10各成員在JA處理及鹽與干旱脅迫下反應(yīng)強(qiáng)烈，推測(cè)其可能在柳枝稷JA信號(hào)通路及鹽與干旱脅迫防御反應(yīng)中發(fā)揮功能。

3 討論與結(jié)論

柳枝稷為異源四倍體，相對(duì)擬南芥、水稻、二穗短柄草等二倍體物種來(lái)說(shuō)，所包含的TIFY基因家族成員數(shù)目較多，本研究共鑒定到48個(gè)PviTIFY，包含7個(gè)ZML、1個(gè)TIFY、40個(gè)JAZ，各成員TIFY motif的氨基酸序列除TIFYXG形式外包含多種類型，如TLSFXG，TLLFXG，TIVYXG等形式，與前人的報(bào)道一致[2]。TIFY蛋白在擬南芥、水稻、柳枝稷3個(gè)物種間分為6個(gè)類群：PPD，TIFY，ZML，JAZⅠ，JAZⅡ，JAZⅢ，從進(jìn)化距離上看，PviTIFY同OsTIFY的親緣關(guān)系較近。除PviTIFY5b與PviTIFY11s外，其它46個(gè)PviTIFY分布在染色體3以外的染色體上，其中半數(shù)成員集中分布在染色體9，并且PviTIFY11各成員在染色體9成簇排列，這些信息可為成員間的進(jìn)化提供依據(jù)。

柳枝稷TIFY蛋白按照進(jìn)化關(guān)系及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可分為5組：JAZⅠ，JAZⅡ，JAZⅢ，TIFY，ZML，每組內(nèi)進(jìn)化關(guān)系較近的成員間具有近乎相同的內(nèi)含子/外顯子組成及蛋白保守基序分布，同水稻[10]與二穗短柄草[11]的TIFY基因家族成員結(jié)構(gòu)組成規(guī)律相同。另一方面，不同分組的成員間基因及蛋白結(jié)構(gòu)的組成差異為TIFY基因家族的進(jìn)化提供了重要依據(jù)[25]。對(duì)于PviTIFY的基因結(jié)構(gòu)，PviTIFY11成員中除與PviTIFY10位于同一進(jìn)化枝的5個(gè)成員，剩余的14個(gè)成員都不含內(nèi)含子，如PviTIFY11a與PviTIFY11b，同它們?cè)谒九c二穗短柄草中的同源基因一樣，可能在進(jìn)化開(kāi)始時(shí)就沒(méi)有內(nèi)含子，或者在進(jìn)化中內(nèi)含子丟失了[10-11]；對(duì)于PviTIFY的保守基序，JAZ亞家族中僅PviTIFY10與PviTIFY11的N端含有NT motif，同水稻中的OsTIFY10與OsTIFY11[10,26]一樣。此外，其成員PviTIFY10c與PviTIFY11s缺少了Jas domain。這些具有特殊結(jié)構(gòu)的成員可能在柳枝稷的進(jìn)化中具有獨(dú)特性。柳枝稷中ZML亞家族成員的CCT domain分為了兩部分，其N端與JAZ亞家族成員的Jas/CCT-2 motif相似性很高而無(wú)法區(qū)分，GATA domain也由兩部分組成，其C端與JAZ亞家族成員N端的NT基序同樣具有一定程度相似性，另外，在柳枝稷PviTIFY6，PviTIFY10，PviTIFY11保守基序中還存在motif5，其功能有待研究。

圖6 PviTIFY10各成員在不同脅迫處理下的表達(dá)模式

JAZ亞家族的JAZ蛋白不僅是JA信號(hào)的關(guān)鍵因子，還是激素網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控樞紐：水稻OsJAZ9與OsSLR1的互作介導(dǎo)了JA與GA的拮抗作用，進(jìn)而協(xié)調(diào)植株的脅迫響應(yīng)與生長(zhǎng)發(fā)育[27]；棉花(Gossypiumhirsutum) GhJAZ3與GhSLR1的互作實(shí)現(xiàn)了JA與GA對(duì)表皮細(xì)胞分化及伸長(zhǎng)的調(diào)控[28]；黃絲瓜蘚(Pohlianutans)PnJAZ1介導(dǎo)JA與ABA在鹽脅迫下的信號(hào)交談[29]。鑒于PviTIFY啟動(dòng)子區(qū)存在多種脅迫響應(yīng)與激素應(yīng)答元件(表3)，本研究選定了表達(dá)量較高的JAZ亞家族的PviTIFY10成員進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證其在激素與脅迫處理下的表達(dá)特性，結(jié)果表明PviTIFY10對(duì)多種激素及脅迫有強(qiáng)烈反應(yīng)(圖5,6)，推測(cè)其可能在柳枝稷脅迫防御反應(yīng)與激素信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮作用。

柳枝稷JAZ亞家族成員具有明顯的時(shí)空表達(dá)特性，尤以PviTIFYI0各成員在花序、小花及根中的表達(dá)量最為顯著(圖4)。Hakata等[26]發(fā)現(xiàn)水稻TIFY基因過(guò)表達(dá)株系可通過(guò)JA信號(hào)途徑促進(jìn)植株生長(zhǎng)，表現(xiàn)出小花數(shù)目增加，開(kāi)花天數(shù)減少、小花育性降低等農(nóng)藝性狀，其中OsTIFY10b過(guò)表達(dá)株系小花育性降低最少，因而產(chǎn)量較高。在本研究中OsTIFY10b的同源基因PviTIFY10b，同樣受到JA的誘導(dǎo)作用(圖5)，且在剛出現(xiàn)的花序及授粉后的小花中呈現(xiàn)較高表達(dá)(圖4)，結(jié)合基因的表達(dá)特性及同源基因在功能上的保守性推測(cè)PviTIFY10b很可能參與柳枝稷花序發(fā)育過(guò)程進(jìn)而影響產(chǎn)量的形成。不僅如此，PviTIFY10b即Pavir.2NG586800(表2)為柳枝稷花逆轉(zhuǎn)相關(guān)候選基因[30]，本課題組曾對(duì)柳枝稷幼穗分化即花序發(fā)育這一生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行了顯微觀察[31]，且在利用柳枝稷幼穗進(jìn)行人工穗芽誘導(dǎo)時(shí)發(fā)現(xiàn)了柳枝稷花逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象[32-33]，并經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選到與柳枝稷花逆轉(zhuǎn)有關(guān)的候選基因[30]，以上研究可為柳枝稷花序發(fā)育分子調(diào)控機(jī)制解析及分子育種奠定基礎(chǔ)。

本研究利用TIFY結(jié)構(gòu)域(PF06200)從柳枝稷基因組中搜索鑒定了48個(gè)TIFY家族成員，并且依據(jù)其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和前人研究結(jié)果對(duì)家族成員進(jìn)行了分類。通過(guò)對(duì)其染色體定位、基因結(jié)構(gòu)、保守基序組成等生物信息學(xué)進(jìn)行分析，進(jìn)一步確定了柳枝稷TIFY基因家族的分類和進(jìn)化關(guān)系。同時(shí)，通過(guò)分析TIFY基因家族的啟動(dòng)子順式作用元件、時(shí)空表達(dá)模式以及PviTIFY10成員激素應(yīng)答和脅迫響應(yīng)的表達(dá)特性，初步證明了TITY家族參與激素調(diào)控、脅迫應(yīng)答和花序發(fā)育等生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，為進(jìn)一步研究柳枝稷TIFY基因家族成員的功能提供了一定的方向和基礎(chǔ)。