香根草對(duì)鎘毒害的生理響應(yīng)
——采用傅里葉變換紅外光譜法(FTIR)

余順慧,張 靜,陳華華,張 波,胡超生,鄧洪平

1 重慶三峽學(xué)院,三峽庫區(qū)水環(huán)境演變與污染防治重慶高校市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 萬州 404100 2 重慶市萬州區(qū)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測站, 萬州 404100 3 重慶市交通規(guī)劃勘察設(shè)計(jì)院,重慶 401121 4西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400715

工業(yè)排污,農(nóng)業(yè)耕作等生產(chǎn)活動(dòng)造成的土壤重金屬污染問題日益嚴(yán)重。目前,我國重金屬污染土壤總面積已達(dá)2×107hm2,占我國耕地總面積的1/5[1]。其中,重金屬鎘(Cd)是毒性最強(qiáng)的元素之一,易溶于水、通過食物鏈,對(duì)人體健康構(gòu)成巨大威脅。如何去除土壤中的重金屬Cd已成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。傳統(tǒng)的物理、化學(xué)修復(fù)方法存在成本高、破壞土壤理化性質(zhì)、易造成二次污染等弊端。植物修復(fù)(Phytoremediation) 是利用植物來轉(zhuǎn)移、容納或轉(zhuǎn)化重金屬污染物使其對(duì)環(huán)境無害的技術(shù),具有成本低,不破壞生態(tài)環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)。這已經(jīng)成為土壤、水體重金屬污染研究領(lǐng)域的一項(xiàng)新興技術(shù)。

高水平的重金屬污染能引起植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)的傷害甚至致死。但在重金屬脅迫早期,當(dāng)脅迫沒有產(chǎn)生生理癥狀時(shí),在細(xì)胞和組織內(nèi)的主要物質(zhì)如蛋白質(zhì)、糖含量、構(gòu)象和分子內(nèi)相互作用等方面都會(huì)發(fā)生變化,而這些變化一般通過測定可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)含量及SOD、POD和CAT酶的活性等指標(biāo)來進(jìn)行研究。但測定這些生理指標(biāo)的方法不但操作復(fù)雜、試劑花費(fèi)較多,而且不能解析蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)結(jié)構(gòu)上的變化[2]。傅立葉變換紅外光譜(FTIR)是一種基于化合物中官能團(tuán)和極性鍵振動(dòng)的結(jié)構(gòu)分析技術(shù)[3],其特點(diǎn)是操作簡單、快速及靈敏度高。目前國內(nèi)學(xué)者已經(jīng)應(yīng)用FTIR技術(shù)研究植物對(duì)重金屬的耐性機(jī)制[4- 6]。薛生國等采用FTIR法探討紫茉莉?qū)b脅迫生理響應(yīng)的影響,發(fā)現(xiàn)紫茉莉通過根系有機(jī)物含量的變化,將植物吸收的Pb 大部分積累在根部,阻止Pb向地上部分運(yùn)輸,有效的保護(hù)了植物地上部分[7]。付川等應(yīng)用FTIR技術(shù)研究紫花苜蓿對(duì)Cu脅迫生理響應(yīng),認(rèn)為植物化學(xué)組分的變化有助于揭示超富集植物的Cu耐性機(jī)理[8]。但國內(nèi)外研究多集中在生物量小,根系不夠發(fā)達(dá)的植物類群[9]。香根草(Vetiveriazizanioides) 為禾本科多年生草本植物,是三峽庫區(qū)的原生物種,具有生物量大、根系發(fā)達(dá)、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn),并且對(duì)重金屬鉛、鎘具有較強(qiáng)的耐性和富集能力,可作為三峽庫區(qū)土壤重金屬污染修復(fù)的備選植物[10]。由此,探討不同Cd處理?xiàng)l件下其化學(xué)組成上的變化將有利于揭示其耐Cd機(jī)制。本研究擬利用FTIR技術(shù),探討不同Cd處理?xiàng)l件下,香根草根、莖、葉的化學(xué)組分變化和毒害機(jī)理,為三峽庫區(qū)重金屬Cd污染防治和土壤植物修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 試驗(yàn)材料及方法

本研究以重慶三峽學(xué)院百安校區(qū)實(shí)驗(yàn)區(qū)的香根草為試驗(yàn)對(duì)象。2016年5 月隨機(jī)選取健壯的、生長較為一致的香根草分蘗苗。先用水洗凈,后移栽到含有Hoagland完全培養(yǎng)液的200 mL錐形瓶中進(jìn)行水培純化7 d。當(dāng)新芽長出后,將植株移入含有不同Cd2+濃度(0、1.0、3.0、5.0、7.0 mg/L)的營養(yǎng)液中進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)。Cd2+以3CdSO4·8H2O形式加入,每個(gè)濃度處理設(shè)3瓶。每3 d換一次培養(yǎng)液,24 h連續(xù)通氣,所有處理培養(yǎng)液的pH值維持在(6.5±0.1)。若瓶內(nèi)液體量減少,則滴加含Cd2+營養(yǎng)液至初始刻度線；若瓶內(nèi)液體變渾濁,則更換帶有Cd2+的營養(yǎng)液。處理10 d后收獲香根草植株。用自來水和去離子水洗凈,再分成兩部分,一部分取葉保存于液氮中備用,用于測定植株亞細(xì)胞組分。另一部分分別取根、莖、葉3部分于105 ℃烘箱殺青30 min,然后于80 ℃烘箱烘中干燥48 h,用鋼磨碎機(jī)研磨成粉末,過200目篩。用于測定植株根、莖、葉樣品的光譜信息。

1.2 傅里葉變換紅外光譜(FTIR)分析

來自于植物各部分的干粉用KBr混合(比例1.5∶100)。用傅里葉紅外光譜儀(日本島津制造IRPrestige-21,光譜范圍4000—400 cm-1,分辨率16 cm-1)測定香根草根、莖、葉樣品的光譜信息。

1.3 Cd2+亞細(xì)胞分布的測定

提取各細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)組分參照湯恵華等[11]方法。取嫩葉2.000 g,按1∶10的比例,加入預(yù)冷的勻漿液〔250 mmol/L蔗糖,50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4),1 mmol/L二硫赤蘚糖醇(C4H10O2S2)〕在4 ℃下研磨成勻漿。勻漿液先后在798 r/min離心10 min,1336 r/min離心15 min,13361 r/min離心20 min,先后得沉淀為細(xì)胞壁、葉綠體、線粒體組分,最后上清液為細(xì)胞質(zhì)組分(含液泡及核糖和蛋白質(zhì)等)。各組分供Cd2+含量測定。

1.4 微波消解樣品測定其重金屬Cd2+含量

精確稱取各樣品0.2000 g,加入酸液(濃HNO3∶濃H2SO4=4∶1),同時(shí)做空白組；將以上溶液在MARS240微波消解系統(tǒng)消解后,冷卻。過濾,濾液在25 mL容量瓶中定容,移入塑料瓶中保存,用AA- 6300原子吸收分光光度計(jì)測定樣品中Cd2+含量(mg/kg干重)[12]。

1.5 計(jì)算和數(shù)據(jù)分析

富集系數(shù) (BF)= 植物地上或地下部分鎘含量/營養(yǎng)液中鎘含量

(1)

轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)(TF)= 植物地上部分鎘含量/根中鎘含量

(2)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用IBM SPSS 20進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和處理,并應(yīng)用Origin 8.0 進(jìn)行紅外光譜數(shù)據(jù)圖譜處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 Cd2+ 脅迫對(duì)香根草重金屬分布的影響

與對(duì)照相比,隨著Cd2+濃度的增大,香根草地下部分、地上部分Cd2+的含量逐漸增加；Cd2+處理后香根草的地下部分Cd2+含量明顯大于地上部分(表1)。當(dāng)用最高Cd2+濃度7 mg/L處理時(shí),此時(shí)香根草出現(xiàn)受害癥狀,表現(xiàn)為幼苗矮化,根長、根體積減小等。按照李東旭等[13]提出的參考值,超富集植物的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)和富集系數(shù)都大于1。本實(shí)驗(yàn)香根草的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)和富集系數(shù)都小于1,說明香根草不屬于超富集植物。但香根草生物量大、根系發(fā)達(dá)、抗逆性強(qiáng)。且具有較強(qiáng)的Cd耐性,可長時(shí)間適應(yīng)低濃度Cd 脅迫,甚至是短時(shí)間的高濃度Cd脅迫[14]。香根草能吸收Cd 并儲(chǔ)存在體內(nèi),具有較強(qiáng)的穩(wěn)定能力,在Cd 污染土壤的修復(fù)方面有一定應(yīng)用潛力[1],香根草作為一種植物修復(fù)的候選物種。

表1 Cd2+脅迫對(duì)香根草植物體內(nèi)的積累和分布情況

Table 1 Accumulation and distribution of cadmium inV.zizanioidestissues and translocation factor in cadmium-treated solutions for 10 days

Cd2+的處理Treatment of cadmium地上部分Shoots/mg/kg地下部分Roots/mg/kgCdBFCdBFTFCk1.60±0.02e-4.93±0.12e-0.32t130.39±0.24d0.8635.18±0.13d0.830.28t265.51±0.25c0.91108.91±0.30c0.400.60t3119.03±0.35b0.75255.68±0.47b0.320.47t4212.49±0.71a0.58290.59±0.98a0.640.73

同列具有不同字母上標(biāo)者為差異顯著(P<0.05); Ck: 對(duì)照 (0 mg/L); t1: 1 mg/L; t2: 3 mg/L; t3: 5 mg/L; t4: 7 mg/L; Cd: 鎘;BF:富集系數(shù);TF: 轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)

2.2 Cd2+ 在香根草葉片內(nèi)的亞細(xì)胞分布

Cd2+在香根草葉片內(nèi)的亞細(xì)胞組分間分布不均勻,其中分配比例最高的是在細(xì)胞質(zhì),細(xì)胞壁次之,含量最少的是在葉綠體和線粒體(表2)。隨著Cd2+濃度的增高,葉片Cd2+總含量及各組分含量增加。當(dāng)Cd2+濃度<3 mg/L時(shí),Cd2+在細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)中的分配比隨Cd2+處理濃度升高而升高,而當(dāng)Cd2+濃度>3 mg/L時(shí),Cd2+在細(xì)胞壁中的分配比例隨Cd2+處理濃度增高而降低,在細(xì)胞質(zhì)中Cd2+的分配比例升高幅度也漸漸減少?？赡苁羌?xì)胞質(zhì)貯存Cd2+的能力有限。

表2 Cd2+在香根草葉片的亞細(xì)胞分布

1)同列具有不同字母上標(biāo)者為差異顯著(P<0.05);2)在括號(hào)里的數(shù)據(jù)為分配比例(%)

研究重金屬的亞細(xì)胞分布是為了確定該元素對(duì)細(xì)胞活動(dòng)的影響[12]。本試驗(yàn)中,細(xì)胞質(zhì)是Cd2+主要貯存部位。細(xì)胞質(zhì)包含液泡、細(xì)胞液、蛋白質(zhì)等成分,大量貯存在香根草細(xì)胞質(zhì)中的Cd2+是否被隔離在液泡中,以減少其毒性,提高香根草對(duì)Cd2+的耐受性,還有待進(jìn)一步研究。細(xì)胞壁是重金屬進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的第一道屏障,細(xì)胞壁中的糖、蛋白質(zhì)及有機(jī)酸等可與金屬離子結(jié)合而貯存部分重金屬,減少重金屬對(duì)植物的毒害[12],這與后面FTIR研究中根、莖一致。Cd2+在葉綠體和線粒體含量最少,降低了Cd2+與有生命活性的原生質(zhì)部分的接觸機(jī)會(huì),使酶的活性不受影響,保證了光合作用和呼吸作用的正常進(jìn)行,這可能是香根草對(duì)Cd2+具有一定耐受性的原因[15]。

2.3 不同濃度Cd2+處理對(duì)香根草根、莖和葉的FTIR分析

圖1 Cd2+處理下香根草根、莖、葉的紅外光譜圖Fig.1 Fourier Transform Infrared spectra of root, stem, leaf of V. zizanioides by cadmium treatment Ck: 對(duì)照 (0 mg/L); t1: 1 mg/L; t2: 3 mg/L; t3: 5 mg/L; t4: 7 mg/L

2.4 香根草特征峰吸光度變化的定量分析

對(duì)不同濃度重金屬處理前后的香根草幼苗的根、莖、葉進(jìn)行了紅外光譜分析, 結(jié)果顯示各組分在重金屬處理前后的峰形基本保持不變。

由香根草的特征峰吸光度變化圖2可見,香根草幼苗根、莖、葉紅外光譜特征峰的吸收強(qiáng)度隨Cd2+濃度的升高而表現(xiàn)出不同的趨勢。根的特征峰吸光度變化為先降后升(見圖2)。在3380—3429 cm-1,2920—2927 cm-1,1631—1645 cm-1,1395—1415 cm-1,1030—1064 cm-1等處,香根草幼苗根在Cd2+濃度低于3.0 mg/L時(shí),該峰的吸光度下降,可能根外表皮細(xì)胞壁的羥基吸附結(jié)合Cd2+形成穩(wěn)定的化合物,使細(xì)胞表面的羥基減少[7]、植物根系不斷分泌有機(jī)酸螯合Cd2+,致使羧酸譜帶下降、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中,肽鍵間氫鍵的結(jié)合力隨著Cd2+濃度的升高而變?nèi)?、?xì)胞壁通過降低果膠甲基化程度,使CEC(陽離子交換能力)提高,從而吸收更多的Cd2+,即通過細(xì)胞壁中積累Cd2+來增強(qiáng)抗逆性等。當(dāng)Cd2+濃度大于3.0 mg/L時(shí),峰值又呈上升趨勢,原因是高濃度的Cd2+可能破壞了根外表皮細(xì)胞壁的羥基吸附結(jié)合Cd2+的機(jī)制,導(dǎo)致根外表皮細(xì)胞壁的羥基無法結(jié)合Cd2+,隨著Cd2+對(duì)香根草毒害的進(jìn)一步加重,其羧酸螯合力變?nèi)?頻帶開始上升、此外不斷增加的Cd2+誘導(dǎo)富脯氨酸蛋白、病害相關(guān)蛋白和富甘氨酸蛋白等一些蛋白合成[7],Didierjean等[20]還認(rèn)為這些重金屬脅迫誘導(dǎo)蛋白可能具有保護(hù)植物細(xì)胞免受重金屬毒害的作用,出現(xiàn)的顯著吸收峰可能與香根草根中氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)類物質(zhì)含量升高等有關(guān)[7]。

香根草莖的特征峰吸光度變化為先升后降趨勢(圖2)。在低濃度時(shí),所有香根草莖的特征峰吸光度隨著Cd2+濃度的升高,先升高(圖2),原因是低Cd2+下促進(jìn)了有機(jī)物如纖維素、半纖維素、多糖等的分泌和運(yùn)輸及氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)等物質(zhì)的產(chǎn)生,通過滲透調(diào)節(jié)來增強(qiáng)抗逆性,而在低濃度Cd2+刺激下,對(duì)峰值變化的主要貢獻(xiàn)是膜脂過氧化作用,隨著Cd2+濃度的升高,膜過氧化程度加深,脂肪族酮類化合物(過氧化產(chǎn)物)在根部積累,引起峰值升高,當(dāng)Cd2+濃度大于3.0 mg/L時(shí),吸光度下降,表明隨著Cd2+毒的加劇,碳水化合物等物質(zhì)的合成和運(yùn)輸都降低、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中肽鍵間氫鍵的結(jié)合力受影響較大。

香根草葉的特征峰吸光度變化也是先升后降趨勢(圖2)。由圖2看出,在低Cd2+濃度時(shí),所有香根草葉的特征峰吸光度隨著Cd2+濃度的增加而上升,先上升的原因是低Cd2+刺激下促進(jìn)了碳水化合物及有機(jī)物的分泌和運(yùn)輸,通過滲透作用來加強(qiáng)葉對(duì)Cd2+的抗逆性 、由根系輸送來的羧酸鹽較多,并以該形式積累在葉片和葉中蛋白質(zhì)、氨基酸和多肽類物質(zhì)含量增加。當(dāng)Cd2+濃度大于3.0 mg/L時(shí),吸光度降低,表明隨著Cd2+毒的加劇,Cd2+阻礙了這些碳水化合物、有機(jī)物及葉中蛋白質(zhì)、氨基酸和多肽類物質(zhì)的合成和運(yùn)輸、根系羧酸螯合力變?nèi)?其羧酸鹽的運(yùn)輸能力也變?nèi)醯?曲線下降。

圖2 Cd2+處理下香根草根、莖、葉的特征峰吸光度變化圖Fig.2 The band height changes of root, stem and leaf in V. zizanioides by cadmium treatment 1030—1064 cm-1: 醇、酯基、醚基或酚類等化合物的C—O鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰;1395—1415 cm-1:甲基的吸收帶;1631—1645 cm-1: N—H酰胺的彎曲振動(dòng)峰;2920—2927 cm-1:羧酸O—H與甲基飽和C—H鍵的伸縮振動(dòng)重疊峰;3380—3429 cm-1:分子間氫鍵O—H自由羥基的伸縮振動(dòng)峰

3 結(jié)論

(1)香根草根組織在2927 cm-1處峰高先下降后上升,表明在低Cd2+(Cd2+<3 mg/L)處理?xiàng)l件下香根草分泌的有機(jī)酸不斷螯合Cd2+,造成羧酸O—H的減少,但隨著Cd2+含量的升高,其羧酸螯合力變?nèi)?有機(jī)酸含量漸漸升高。

(2)香根草莖組織在1631 cm-1峰高處先上升后下降,表明在低Cd2+(Cd2+<3 mg/L)處理?xiàng)l件下香根草產(chǎn)生氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)等物質(zhì),通過滲透調(diào)節(jié)來增強(qiáng)抗逆性,但隨著Cd2+含量的升高,蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中肽鍵間氫鍵的結(jié)合力受影響較大

(3)香根草葉片富集的Cd2+主要分布于細(xì)胞質(zhì)中,其次為細(xì)胞壁,而在線粒體和葉綠體中含量最低。

(4)雖然香根草對(duì)Cd2+的積累還未到達(dá)超富集植物的范圍,但從耐Cd2+能力、地上部分對(duì)Cd2+的富集量、高生物量、生長快等多方面綜合考慮,香根草在遭受Cd2+污染的土壤中植物修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域,擁有潛在的利用價(jià)值。

致謝：東南大學(xué)王大勇教授對(duì)寫作給予幫助,特此致謝。