(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)衍生的纖維素手性固定相

諶學(xué)先, 張 鵬, 何義娟, 徐 文, 袁黎明

(云南師范大學(xué), 能源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 化學(xué)化工學(xué)院, 昆明 650500)

手性是自然界的基本屬性之一,與生命也有著密切的關(guān)系。研究手性識別的最主要原動力來自于手性藥物,除此之外其與化學(xué)、化工、環(huán)境、農(nóng)藥、食品、香料、材料等領(lǐng)域也有非常廣闊的聯(lián)系。早在1992年,美國食品藥品管理局(FDA)就要求,新研制的具有手性的藥物必須提供單個對映體的藥理學(xué)和藥物代謝動力學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),因?yàn)閷τ丑w之間常常具有不同的藥效。

色譜分析法由于其非常優(yōu)秀的分辨能力,是目前應(yīng)用最廣的手性拆分方法[1-4],其中高效液相色譜又是色譜分析法中應(yīng)用最為普遍的[5,6]。1973年,Hesse G和Hagel R[7]首先制備出了具有實(shí)用價值的多糖衍生物——微晶三醋酸纖維素,隨后以O(shè)kamoto Y為代表的研究者進(jìn)行了大量的研究[8],先后合成了數(shù)百個多糖類的衍生物[5,6],成功開發(fā)了基于纖維素和直鏈淀粉的商品化手性分離材料。在HPLC以及制備液相色譜手性分離柱中,多糖類無疑是目前使用最為廣泛的,有90%左右的手性樣品可以在該類分離柱中識別。而在這些商品柱中,纖維素三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)(CTDMPC)又是最杰出的代表。

1986年第一次報(bào)道了CTDMPC固定相[9],隨后大量的作者都參考該文將多糖涂漬在氨丙基化的硅膠表面,制備涂漬型的多糖手性柱,且所用硅膠種類多樣[10-15]。但到目前為止,尚未見不同程度衍生的纖維素(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)以及不同硅膠包括粗制硅膠、氨丙基粗制硅膠、精制硅膠、氨丙基精制硅膠、大孔硅膠、氨丙基大孔硅膠作為支撐體對該手性固定相分離能力的影響的系統(tǒng)研究。本研究有助于人們更深刻地理解和更好地設(shè)計(jì)高效液相色譜手性柱的制備方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

粗制硅膠(YQG80球形硅膠,粒徑5 μm,孔徑10 nm,青島美高化工有限公司;因該硅膠價格相對較低,在文中簡稱粗制硅膠);精制硅膠(粒徑5 μm,孔徑10 nm,蘇州納微科技股份有限公司;因該硅膠價格相對較高,在文中簡稱精制硅膠);大孔硅膠(粒徑7 μm,孔徑100 nm,日本Daisogel公司);微晶纖維素、3-氨丙基三乙氧基硅烷、鹽酸、吡啶、甲苯、丙酮、正己烷、異丙醇、甲醇(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司); 3,5-二甲基苯基氨基異氰酸酯(Adamas-Beta試劑有限公司);手性化合物(Sigma-Aldrich和Adamas-Beta試劑有限公司)。

高效液相色譜儀(配有Elite P 1201高壓恒流泵、Elite UV 1201紫外檢測器、EC 2006型色譜工作站,大連依利特分析儀器有限公司);不銹鋼色譜柱(250 mm×2.0 mm)和液相色譜裝柱機(jī)(美國Alltech公司); S-3000N掃描電子顯微鏡(SEM,日本Hitachi Science Systems公司); Bruker Avance Ⅲ 500MHz核磁共振儀(德國Bruker公司);全自動比表面及孔徑分析儀(日本BELSORP-max Ⅱ公司)。

1.2 手性固定相的合成

CTDMPC的合成[8,9]: 150 mL的圓底燒瓶中加入2 g微晶纖維素,在100 ℃下真空干燥5 h,冷卻至室溫。在N2保護(hù)下,依次加入80 mL無水吡啶和7.8 mL 3,5-二甲基苯基氨基異氰酸酯,于90 ℃下回流24 h,得到透明溶液,冷卻后轉(zhuǎn)移到800 mL甲醇中,有白色沉淀析出,減壓抽濾,用大量甲醇洗滌至無吡啶味,60 ℃下真空干燥5 h,得到白色固體。

纖維素-2,3-二(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)(CDDMPC)的合成[10-12]: (1)纖維素6-位伯羥基保護(hù):150 mL的圓底燒瓶中加入2 g微晶纖維素,在100 ℃下真空干燥5 h,冷卻至室溫。在N2保護(hù)下,加入30 mL無水N,N-二甲基乙酰胺,于100 ℃下回流24 h,然后再加入3.0 g氯化鋰、120 mL無水吡啶,在100 ℃下回流12 h,最后加入7.6 g三苯基氯甲烷,于100 ℃下反應(yīng)50 h,冷卻后轉(zhuǎn)移到800 mL甲醇中沉淀、過濾,用甲醇洗滌至無吡啶味,于60 ℃下真空干燥5 h,得到黑色固體3.4 g。(2)纖維素2-,3-位仲羥基異氰酸酯化:150 mL的圓底燒瓶中加入1.5 g的上一步所得產(chǎn)物,在100 ℃下真空干燥5 h后,依次加入60 mL無水吡啶、4.5 mL 3,5-二甲基苯基氨基異氰酸酯,于90 ℃下反應(yīng)24 h,冷卻后轉(zhuǎn)移到1 000 mL甲醇中沉淀、過濾,用甲醇洗滌至無吡啶味,于60 ℃下真空干燥5 h,得到灰色固體3.3 g。(3)纖維素6-位伯羥基去保護(hù):取上一步反應(yīng)所得產(chǎn)物3.3 g,加入到500 mL的圓底燒瓶中,然后依次加入250 mL甲醇和7.5 mL濃鹽酸,室溫下攪拌24 h,過濾、用甲醇洗滌,于60 ℃下真空干燥5 h,得到淺灰色固體2.7 g,即為目標(biāo)產(chǎn)物。

氨丙基硅膠(APS-硅膠)的制備:在N2氣保護(hù)下,在150 mL圓底燒瓶中分別加入10 g粗制硅膠、100 mL含量為10%的鹽酸,在100 ℃條件下回流12 h,冷卻至室溫,用蒸餾水洗滌至中性,真空干燥6 h。將該活化的硅膠加入到150 mL圓底燒瓶中,在N2保護(hù)下依次加入1.2 mL無水吡啶、100 mL無水甲苯、1.6 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷,在90 ℃的條件下回流24 h,冷卻至室溫,用G4型砂芯漏斗減壓抽濾,之后依次用正己烷、甲醇、丙酮洗滌至無吡啶味,最后真空干燥6 h得到白色固體,即為氨丙基硅膠。

1.3 (3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)衍生的纖維素手性固定相的制備

在6個50 mL的燒瓶中分別加入0.4 g CTDMPC和8 mL四氫呋喃,將其溶解,分別涂覆于1.6 g的下述6種硅膠表面,即得到相應(yīng)的固定相:CTDMPC-粗制硅膠(CSP-1)、CTDMPC-APS-粗制硅膠(CSP-2)、CTDMPC-精制硅膠(CSP-3)、CTDMPC-APS-精制硅膠(CSP-4)、CTDMPC-大孔硅膠(CSP-5)、CTDMPC-APS-大孔硅膠(CSP-6)。按照同樣的方法制得:CDDMPC-粗制硅膠(CSP-7)、CDDMPC-APS-粗制硅膠(CSP-8)、CDDMPC-精制硅膠(CSP-9)、CDDMPC-APS-精制硅膠(CSP-10)、CDDMPC-大孔硅膠(CSP-11)、CDDMPC-APS-大孔硅膠(CSP-12),這些固定相中纖維素衍生物的涂漬重量為20%。另外,在50 mL的燒瓶中,取1.2節(jié)的微晶纖維素-DMAc-LiCl溶液1.5 mL,均勻地涂覆于1.6 g大孔氨丙基硅膠表面,得到纖維素-APS-大孔硅膠(CSP-13)手性固定相,該固定相中纖維素的涂漬重量為5.6%,這主要是因?yàn)樵摾w維素溶液的黏度太大而難于涂漬,降低了該纖維素的涂漬重量。

圖1 3種硅膠的孔徑分布圖

1.4 色譜柱的制備

在裝柱前,先將上述制備的13種手性固定相過250目篩,然后分別將1.5 g固定相加入20 mL正己烷/異丙醇(9∶1, v/v)中形成懸浮液,倒入勻漿罐,在40～50 MPa壓力下,用正己烷/異丙醇(9∶1, v/v)作為頂替液裝柱。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前,需用正己烷/異丙醇作為流動相,以0.1 mL/min的流速沖洗色譜柱至基線平穩(wěn)。

1.5 色譜分離條件

流動相:正己烷/異丙醇(9∶1, v/v);流速:0.1 mL/min;色譜柱柱溫:25 ℃;進(jìn)樣量:5 μL;紫外檢測波長:254 nm或230 nm。正己烷和異丙醇使用前需用0.45 μm濾膜過濾,并超聲脫氣處理。用流動相分別將各種外消旋體樣品配制成1 g/L的溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 3種硅膠的元素分析

商品化的色譜硅膠,其制備方法是廠家不公開的技術(shù)。為了能更好地了解硅膠對固定相手性分離的影響,3種硅膠分別進(jìn)行元素分析(見表1)。出乎作者意料的是,三者C、H、N的含量相差甚遠(yuǎn)。因此可以看出,粗制硅膠與另外兩種硅膠在制備方法上應(yīng)該是不同的,而精制硅膠與大孔硅膠之間至少在制備工藝上存在著明顯的差異。

表1 3種硅膠的元素分析數(shù)據(jù)

2.2 3種硅膠的比表面積及孔徑分析

分析了3種商品硅膠的比表面積及孔徑。分別測得粗制硅膠、精制硅膠、大孔硅膠的比表面積為189.46、389.20、21.96 m2/g,孔徑分別為6.75、6.75、58.08 nm。3種硅膠的孔徑分布如圖1所示。

2.3 3種硅膠的掃描電鏡分析

圖2是3種硅膠的掃描電鏡圖?？梢钥闯?3種硅膠的粒徑大小有差異,尤其是粒徑分布有較大的不同。粗制硅膠的尺寸在2.0～3.9 nm范圍,精制硅膠的尺寸在6.6～10.6 nm范圍,大孔硅膠的尺寸在6.2～10.9 nm范圍。尤其是粗制硅膠的顆粒不但偏小一些,一些硅膠的球形還不完整,其中夾雜著一些小塊,而且表面更加粗糙。另外大孔硅膠的孔徑也開始可見。

圖2 3種硅膠的掃描電鏡圖

2.4 表面涂漬CTDMPC的3種硅膠的掃描電鏡分析

高分子溶液就像膠水。將高分子溶液涂漬到硅膠表面后盡量讓硅膠顆粒不粘連在一起,而保證固定相顆粒的高度分散性,這是商品化的多糖手性柱廠家不公開的技術(shù)。圖3是表面涂漬CTDMPC的3種硅膠的掃描電鏡圖。可以看出,由于粗制硅膠的顆粒偏小、硅膠球形常不完整以及表面更粗糙,涂漬CTDMPC時很容易將硅膠顆粒團(tuán)聚在一起。大孔硅膠由于孔大的原因,可以使很大一部分涂漬溶液進(jìn)入到大孔的內(nèi)部,有效地減少了硅膠之間的黏結(jié)。對于精制硅膠,其涂漬效果則介于粗制硅膠和大孔硅膠之間。

圖3 表面涂漬CTDMPC的3種硅膠的掃描電鏡圖

圖4 3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯衍生的纖維素的核磁氫譜

2.5 3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯衍生的纖維素的核磁氫譜分析

纖維素與3,5-二甲基苯基異氰酸酯反應(yīng)后,在核磁氫譜上最明顯的變化就是在化學(xué)位移為1.5～2.5之間出現(xiàn)甲基氫信號。比較圖4 a和b,化學(xué)位移為2.3處,圖4b中的峰降到很低,表明該纖維素衍生物的6位上基本沒有3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯中的甲基氫。這表明該實(shí)驗(yàn)成功地合成了纖維素三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)與纖維素-2,3-二(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)。

2.6 自制的13根纖維素手性柱分別拆分16對外消旋體

為了評價不同程度衍生的(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)纖維素,以及不同硅膠(粗制硅膠、氨丙基粗制硅膠、精制硅膠、氨丙基精制硅膠、大孔硅膠、氨丙基大孔硅膠)作為支撐體對該柱手性分離能力的影響,將1.3節(jié)中的固定相填充到色譜空柱中,自制了13根手性色譜柱。

按照1.5節(jié)中的色譜分離條件,分別考察了其對16種外消旋體的拆分能力。外消旋體及編號分別為:(1)2,2,2-三氟-1-(9-蒽基)乙醇、(2)1-(1萘基)-乙醇、(3)1,1′-聯(lián)-2-萘酚、(4)聯(lián)糠醛、(5)1,2-二苯乙醇酮、(6)二氫黃酮、(7)反-1,2-二苯基環(huán)氧乙烷、(8)特羅格尓堿、(9)3,5-二硝基-N-(1-苯乙基)苯甲酰、(10)華法林、(11)馬來酸氯苯那敏、(12)鹽酸普萘洛爾、(13)美托洛爾、(14)扁桃酸、(15) DNB-亮氨酸、(16)吡喹酮。CSP-1～CSP-13典型的色譜圖見圖5。

圖5 13種手性柱拆分外消旋體的色譜圖

表2 外消旋化合物在6種色譜柱CSP-1～CSP-6上的拆分?jǐn)?shù)據(jù)

表3 外消旋化合物在6種色譜柱CSP-7～CSP-12上的拆分?jǐn)?shù)據(jù)

2.6.1纖維素三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)涂覆的6種硅膠柱

將纖維素三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)涂覆于6種不同的硅膠上,制備的手性柱分別為1.3節(jié)的CSP-1、CSP-2、CSP-3、CSP-4、CSP-5、CSP-6。流動相為正己烷/異丙醇(9∶1, v/v)?？疾爝@6種色譜柱對16種外消旋體的拆分性能(見表2)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,這6種色譜柱對手性化合物表現(xiàn)出較好的拆分性能,共有13種外消旋體得到拆分,其中有7種能在全部6種色譜柱上得到不同程度的拆分。同時,實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明,同種硅膠的氨丙基化與否對外消旋體的拆分有影響。通常認(rèn)為,氨丙基硅烷化處理硅膠的目的是通過氫鍵作用,讓纖維素衍生物能夠固定得更牢固,另外由于硅膠表面性質(zhì)的改變,也會一定程度地影響纖維素衍生物高分子在硅膠表面的聚集與組裝狀態(tài),從而影響固定相的手性識別特性。因此,對某些樣品而言,氨丙基化的硅膠可能具有較好的拆分效果,而對于另外一些樣品,非氨丙基化的硅膠拆分效果似乎會更好一些。不同硅膠作為色譜基質(zhì)材料時,精制硅膠和大孔硅膠的分離效果優(yōu)于粗硅膠;但大孔硅膠由于孔更大,硅膠間黏結(jié)度低一些,所以柱壓更低。將纖維素三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)涂覆于不同色譜基質(zhì)材料表面,對手性樣品的拆分還具有一定的互補(bǔ)作用。

2.6.2纖維素-2,3-二(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)涂覆的6種硅膠柱

將纖維素-2,3-二(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)涂覆于6種硅膠上制備的手性柱,分別為1.3節(jié)中的CSP-7、CSP-8、CSP-9、CSP-10、CSP-11、CSP-12。流動相同樣為正己烷/異丙醇(9∶1, v/v)?？疾炝诉@6種色譜柱對16種外消旋體的拆分性能,它們也都表現(xiàn)出了一定的拆分性能(見表3)。共有8種外消旋體得到拆分,其中有3種手性樣品能在全部6種色譜柱上得到不同程度的拆分。與纖維素三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)涂覆的硅膠柱相比,少拆分開了5個外消旋體,但在纖維素三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)涂覆的硅膠柱上不能拆分的3號和10號,卻在纖維素-2,3-二(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)柱上得到了拆分。另外,實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣也表明,同種硅膠的氨丙基化與否對外消旋體的拆分有影響,不同硅膠作為色譜基質(zhì)材料時,精制硅膠和大孔硅膠的分離效果優(yōu)于粗制硅膠。我們的實(shí)驗(yàn)也表明,大孔硅膠的柱壓低于精制硅膠。該類手性柱之間也有互補(bǔ)性。

2.6.3纖維素溶液涂覆的氨丙基大孔硅膠柱

由于環(huán)糊精也由多個單糖構(gòu)成,非衍生化的環(huán)糊精也有一定的手性識別能力,而文獻(xiàn)中多將多糖衍生物涂漬在氨丙基硅膠的表面[5,6],因此,我們將N,N-二甲基乙酰胺和氯化鋰溶解的纖維素溶液也直接涂敷于氨丙基大孔硅膠表面,得到CSP-13固定相而制成手性柱(CSP-13)。流動相為正己烷/異丙醇(9∶1, v/v)。考察了其對16種外消旋體的拆分性能,結(jié)果只能拆分開4個外消旋體樣品(見表4)。與同種支撐體的CSP-6、CSP-12色譜柱相比,CSP-13拆分開的4種中,有3種是CSP-6和CSP-12未能拆開的,因此3種柱間的互補(bǔ)性較強(qiáng)。

表4 不同程度衍生的(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)纖維素色譜柱手性拆分結(jié)果的比較

因?yàn)榉茄苌沫h(huán)糊精手性柱常在正相、極性有機(jī)相、反相3種模式中使用,因此我們用CSP-13,在以甲醇為流動相的模式下拆分了外消旋體1、3、4號,Rs分別為2.58、2.66、3.62;在乙腈/水(1∶1, v/v)為流動相的反相模式下拆分了外消旋體1、4、6、7、8、16號,Rs分別為0.31、0.50、0.49、0.55、0.59、1.13。因此在16種外消旋體中,CSP-13能識別的手性化合物也達(dá)到了50%。

3 結(jié)論

該文詳細(xì)地研究了不同程度衍生的纖維素(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)以及不同硅膠作為支撐體對該柱手性分離能力的影響。研究結(jié)果顯示,纖維素的取代度和不同的硅膠支撐體皆對手性柱的選擇性產(chǎn)生不同程度的影響,這些不同的手性柱之間可產(chǎn)生一定的互補(bǔ)性。該研究結(jié)果有助于更好地制備高效液相色譜手性柱。