大熊貓幼仔兩種補飼奶粉中揮發(fā)性成分的初步分析

鮮義坤，李 果，李裕冬，王承東，熊鐵一，張貴權(quán)*

（1.四川省自然資源科學研究院，成都 610015；2.大熊貓國家公園珍稀動物保護生物學國家林業(yè)和草業(yè)局重點實驗室，中國大熊貓保護研究中心，四川 臥龍 623006）

大熊貓屬我國特有的、世界著名的萌寵珍稀動物。目前人工飼養(yǎng)的大熊貓母獸胎產(chǎn)仔成活數(shù)最高記錄為3只，約50%的產(chǎn)仔大熊貓產(chǎn)雙胞胎，產(chǎn)后泌乳量難以滿足2～3仔的快速生長發(fā)育需要，個別母獸甚至1 仔也不喂養(yǎng)[1-2]。這就需要用其他動物乳汁或奶粉進行補飼或全人工喂養(yǎng)。

頂空（HS）-固相微萃取（SPME）是用于分析揮發(fā)性化合物的一種前處理技術(shù)，氣相色譜（GC）-質(zhì)譜（MS）聯(lián)用技術(shù)可分離和鑒定樣品中的多種揮發(fā)性組分，HS-SPME與GC-MS的結(jié)合開創(chuàng)了國內(nèi)外分析未知混合型揮發(fā)性成分的新局面。我國科技工作者曾用HS-SPME-GC-MS 方法分析過羊乳和牛乳、豬乳、羊奶粉、羊奶粉和牛奶粉以及驢奶粉中的揮發(fā)性化合物或風味物質(zhì)，為本項研究提供了可借鑒的方法[3-11]。本試驗通過對大熊貓幼仔補飼奶粉的揮發(fā)性成分分析，旨在探尋大熊貓幼仔食物中的香氣物質(zhì)，有助于揭示大熊貓幼仔喜歡的食物氣味及香氣物質(zhì)，也可為研制大熊貓幼仔專用誘食劑（即人造大熊貓乳源性化學信息素）提供原料選擇方面的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供測奶粉

供測奶粉有兩種：奶粉A，為美國某企業(yè)生產(chǎn)；奶粉B，為我國某中外合資企業(yè)生產(chǎn)，屬嬰兒配方奶粉，適用于喂養(yǎng)0～6月齡的嬰兒。上述兩種奶粉均為中國大熊貓保護研究中心（簡稱大熊貓中心）用于補飼大熊貓幼仔多年。奶粉A 樣品采自大熊貓中心臥龍神樹坪基地，奶粉B從成都某超市購買，與大熊貓中心臥龍神樹坪基地飼喂的品牌、型號及適用月齡階段一致。

樣品移入已清洗干凈并經(jīng)濕熱高溫滅菌除味（高溫→室溫→高溫，熱冷間歇，重復(fù)3 次）的10 mL 棕色玻璃瓶中，旋緊瓶蓋，再用無味的封口膜纏繞瓶蓋與瓶頸結(jié)合處數(shù)圈確保密封，以防止奶粉氣味散失和環(huán)境氣味串入，置于-20 ℃冰箱中保存，待測。

1.2 分析儀器

GC-MS 聯(lián)用儀：QP 2010Plus（日本島津公司）。石英毛細管色譜柱：DB-5MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm；20 mL 頂空瓶及其相應(yīng)的密封墊和鋁蓋；均由美國Agilent 公司出品。SPME 頭：50/30 μm DVB/CAR/PDMS；SPME 手動進樣手柄；均由美國Supelco 公司出品。其他器材用品均為測試分析室常規(guī)配置。

1.3 HS-SPME法

稱奶粉1 g入頂空瓶中，加5 mL去離子水，搖勻，再加NaCl 1.5 g，迅速用密封墊和鋁蓋密封，將已老化的萃取頭（250 ℃下老化）插入頂空瓶，將頂空瓶聯(lián)同萃取頭置于電熱恒溫水浴鍋內(nèi)，固定，50 ℃平衡20 min，推出萃取纖維頭至離液面約1 cm處。50 ℃頂空萃取1 h?？s回萃取纖維頭，拔出后快速插入GC進樣口，推出萃取頭解吸3 min。

1.4 GC-MS聯(lián)用分析

1.4.1 GC條件

柱箱溫度40 ℃，進樣溫度270 ℃，進樣模式不分流，進樣時間1 min，載氣為高純氦氣，流量控制模式壓力49.5 kPa，總流量16.0 mL·min-1，柱流量1.0 mL·min-1，線流量36.1 cm·s-1，吹掃流量進樣模式5.0 mL·min-1，分流比10.0；程序升溫模式的起始溫度40 ℃，保持5 min，以5 ℃·min-1速率升至160 ℃，保持2 min，再以10 ℃·min-1速率升至280 ℃，保持20 min。

1.4.2 MS條件

接口溫度220 ℃，離子源溫度200 ℃，電離方式為EI，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍33～500 m·z-1。

1.4.3 數(shù)據(jù)處理

利用GC-MS 工作站軟件和自帶NIST標準譜庫自動檢索各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)。定性檢測需組分質(zhì)譜圖與標準譜圖的匹配度≥80%，結(jié)合質(zhì)譜裂解規(guī)律，同時參照保留時間推定奶粉中的揮發(fā)性成分。定量檢測按峰面積歸一化法自動計算各組分的相對百分含量。剔除從色譜柱和SPME頭上掉下的硅氧烷等“外來”物質(zhì)，不計入統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶粉A的揮發(fā)性成分

大熊貓幼仔兩種補飼奶粉中的揮發(fā)性成分見表1。大熊貓幼仔補飼奶粉A 和奶粉B 中的揮發(fā)性成分總離子流色譜見圖1和圖2。

由表1、圖1 可見，奶粉A 共測出52 種揮發(fā)性成分，其中可推定的揮發(fā)性有機化合物有46 種，歸類于醇4 種、酚1 種、醛4 種、酮2 種、酯2 種、烷烴12種、烯烴6種、芳香烴14種、含硫化合物1種；烴類物質(zhì)較多，達32 種；有12 種成分曾在家畜乳汁（羊乳、牛乳或豬乳，下同）中檢出[4-7]。有15種成分也曾在家畜乳汁加工品——奶粉（羊奶粉或牛奶粉或驢奶粉，下同）中檢出[8-11]。奶粉A中相對含量排前5位的揮發(fā)性成分依次是己醛（34.40%）、1,2,3-三甲基苯（5.47%）、1-戊醇（4.42%）、2-乙基-1-己醇（4.02%）、1,2-二甲基苯（3.67%），合計達51.98%；據(jù)此認為己醛可能對奶粉A 的香氣形成起到重要作用。

表1 大熊貓幼仔2種補飼奶粉中的揮發(fā)性成分

續(xù)表

圖1 大熊貓幼仔補飼奶粉A中的揮發(fā)性成分總離子流色譜

圖2 大熊貓幼仔補飼奶粉B中的揮發(fā)性成分總離子流色譜

2.2 奶粉B的揮發(fā)性成分

由圖2 和表1 可見，奶粉B 僅測出揮發(fā)性成分（已剔除硅氧烷等“外來”物質(zhì)）8種，其中可推定的揮發(fā)性有機化合物有6 種，歸類于醇1 種、醛2種、酮1 種、雜環(huán)化合物1 種、含硫化合物1 種，有4種成分曾在家畜乳汁中檢出[4-7]。有5種成分也曾在家畜乳汁加工品——奶粉中檢出[8,10-11]。奶粉B中相對含量排前5 位的揮發(fā)性成分依次是己醛（65.41%）、二甲基二硫醚（12.87%）、2-庚酮（5.83%）、1-戊醇（5.73%）、庚醛（有待進一步確定，4.17%），合計達94.01%。據(jù)此認為己醛可能也對奶粉B的香氣形成起到重要作用。

2.3 兩種奶粉中揮發(fā)性成分的異同分析

本試驗結(jié)果表明，大熊貓幼仔補飼奶粉A與奶粉B之間相同的成分有5種，分別是：二甲基二硫醚、1-戊醇、己醛、2-庚酮、壬醛，而不同的成分多達40 種，且與文獻報道的家畜乳汁及其奶粉之間也存在一些差異[4-11]。這可能是因為不同種類的動物乳源、不同的動物日糧結(jié)構(gòu)以及與家畜乳汁和奶粉不同的具體分析方法如色譜柱的極性強弱、SPME 頭的型號不同等所致。雖然奶粉A 和奶粉B的相對含量最高的成分均為己醛，但因揮發(fā)性成分的數(shù)量相差較大，可能導致兩種奶粉間以及與家畜乳汁和奶粉在香氣類型或強度上有所不同。

2.4 兩種奶粉中香氣成分的異同分析

測出揮發(fā)性成分之后，再從中篩選出國內(nèi)外廣泛認同的應(yīng)用性單體呈香物質(zhì)（即狹義上的香氣成分，下同），是探尋未知混合型物品中香氣成分的一種簡捷方法。從大熊貓幼仔2種補飼奶粉中測出的揮發(fā)性成分對人而言幾乎都有不同類型、不同強度的氣味，但有些氣味物質(zhì)對人或動物的健康可造成不利影響，沒有通過甚至尚未進行食品或飼料安全性試驗與評估，不能用于食品級或飼料級香原料。不同國家或組織如歐盟的要求、標準、法規(guī)不盡一致，但基本認可具有FEMA 編號的呈香物質(zhì)。由表1 可見，奶粉A 中的香氣成分有14 種，分別是：二甲基二硫醚、1-戊醇、己醛、甲酸己酯、2-庚酮、庚醛、α-蒎烯、β-蒎烯、1-辛烯-3-醇、2-乙基-1-己醇、2-苯基-1-丙醛、2-壬酮、壬醛、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚；奶粉B 只有6 種，分別是：二甲基二硫醚、1-戊醇、己醛、2-庚酮、2-戊基呋喃、壬醛；奶粉A和奶粉B相同的香氣成分有5 種，分別是：二甲基二硫醚、1-戊醇、己醛、2-庚酮、壬醛；相互不同的香氣成分有10種，分別是：甲酸己酯、庚醛、α-蒎烯、β-蒎烯、1-辛烯-3-醇、2-戊基呋喃、2-乙基-1-己醇、2-苯基-1-丙醛、2-壬酮、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚。因兩種奶粉的香氣成分數(shù)量相差8 種，相互不同的香氣成分達10 種，據(jù)此推知這兩種奶粉的香氣類型和強度應(yīng)有一些差異，有待對這兩種奶粉的香氣進行進一步驗證。

3 討 論

3.1 大熊貓幼仔喜歡的香氣物質(zhì)

表1 中具有FEMA 編號的揮發(fā)性成分是國際國內(nèi)公認的、法規(guī)允許在加工類食品中使用并可合成和購買的單體呈香物質(zhì)。本次從奶粉A和奶粉B中共測出15 種香氣成分，對于奶粉的某種香氣類型而言如奶香和腥氣等有著或輕或重、或正或負的貢獻，其中1-戊醇、己醛、2-庚酮、庚醛、1-辛烯-3-醇、2-戊基呋喃、壬醛、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚也存在于圈養(yǎng)大熊貓乳汁中[12]。這8 種成分中可能部分或全部均為大熊貓幼仔喜歡的香氣物質(zhì)，但需要進一步的單體香氣物質(zhì)飼喂試驗驗證。

3.2 奶粉間揮發(fā)性成分的差異原因

表1是大熊貓幼仔兩種補飼奶粉在同一日期用同樣方法經(jīng)同臺儀器檢測的結(jié)果，但兩種奶粉揮發(fā)性成分差異較大，原因可能是用于加工奶粉的乳汁來自不同的動物種類；用于加工奶粉的乳汁輔以其他非乳源性原料調(diào)配而成；即使乳源動物的種類相同，而飼喂日糧組成不同；不同的奶粉生產(chǎn)工藝流程所致。本次分析只是初步測試，還不徹底，某些香氣成分的種類仍不全面，兩種奶粉中存在的香氣成分還有很多未被測出，有待通過不同的SPME溫度和時長、萃取纖維頭類型、GC-MS 型號、程序升溫、色譜柱類型和長度、譜庫版本等關(guān)鍵技術(shù)節(jié)點變化進一步詳盡分析大熊貓幼仔補飼奶粉的揮發(fā)性成分尤其是香氣成分，以便更多地了解大熊貓幼仔食物中的香氣物質(zhì)，進而揭示大熊貓幼仔喜歡的食物氣味和香氣物質(zhì)。

3.3 奶粉中香氣成分的應(yīng)用意義

本試驗測試結(jié)果也為研制大熊貓幼仔專用誘食劑提供了部分原料選擇的參考依據(jù)?？筛鶕?jù)大熊貓乳汁的風味特征和參考上述測出的香氣物質(zhì)，模擬大熊貓乳汁的天然香氣，調(diào)制大熊貓幼仔專用誘食劑，在功能上就是人工仿制大熊貓乳源性化學信息素，讓人工乳、代用奶等食物具有“媽媽”乳味，使幼仔進食過程具有安全感、親切感以及幸福感，緩解從自然母乳向人工食物變換而引起的應(yīng)激反應(yīng)，增強幼仔采食欲望[23]。

表1中具有FEMA 編號的單體呈香物質(zhì)的香氣特征如下：二甲基二硫醚具有強烈的、洋蔥、甘藍、玉米罐頭樣香氣，1-戊醇具有蘋果、香蕉、酵母、酒香香氣，己醛具有強烈的、青香、木香、草香、蔬菜、肉香、水果香氣，甲酸己酯具有強烈的、青香、生水果香氣，2-庚酮具有水果、青香、奶油、奶酪香氣，庚醛具有脂肪、肉、尖刺的香氣，α-蒎烯和β-蒎烯均有松木、松節(jié)油樣香氣，1-辛烯-3-醇具有壤香、蘑菇、真菌、油膩、青香、蔬菜、肉香香氣，2-戊基呋喃具有果香、青香、壤香、骨粉香、根香香氣，2-乙基-1-己醇具有蘑菇香氣，2-苯基-1-丙醛具有青香、壤香、青葉香氣，2-壬酮具有脂肪、奶酪、青香、水果、花香香氣，壬醛具有脂肪、花香、蠟香、柑橘香氣，2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）具有烘烤谷物香氣[24]。

上述15 種呈香物質(zhì)除2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚外均為我國食品安全國家標準——食品添加劑使用標準（GB 2760-2014）中允許在食品中添加使用的單體香原料，但2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚可用作部分加工類食品的抗氧化劑或防腐劑[14-15]。因此，在調(diào)制大熊貓幼仔專用誘食劑時可按照國家有關(guān)規(guī)定和要求酌情酌量有針對性地選用。