牦牛酥油磷脂提取工藝研究及脂肪酸成分分析

雷有娟,孫萬成,羅毅皓

（青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧810016）

0 引言

牦牛酥油是牧民用傳統(tǒng)手工從新鮮的牦牛奶中提煉出的一種乳制品，夏季或秋季從牦牛乳中提煉出的酥油呈鮮黃色，而冬季牦牛酥油則呈奶白色，其主要成分為脂肪和水分，還有少量的蛋白質(zhì)。茍鈺姣[1]等發(fā)現(xiàn)牦牛乳中功能性脂肪酸含量顯著高于普通牛乳，并且許多在牦牛原乳中能檢測到的飽和脂肪酸在酥油中未檢測到。牦牛酥油中比例最高的脂肪酸依次為棕櫚酸、油酸、硬脂酸和肉豆蔻酸[2]。眾多研究表明[3-5]，酥油含有多種功能性脂肪酸，例如：亞油酸(CLA)、花生四烯酸(AA)、α-亞麻酸(ALA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。

磷脂包括鞘磷脂和甘油磷脂兩大類，甘油磷脂磷包括磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰絲氨酸（PS）、磷脂酰甘油(PG)和磷脂酸(PA)等[6]。它不僅具有較高的營養(yǎng)價值，還具有調(diào)節(jié)代謝、預(yù)防血管疾病和動脈硬化、延緩衰老等功能[7-9]。乳源磷脂與其他植物來源磷脂的一個重要區(qū)別是，乳源磷脂含有鞘磷脂[10]，目前牛乳脂肪中發(fā)現(xiàn)了五種磷脂，含量最高的是PE、PC和SM，其次是PI和PS[11-13]。磷脂的提取方法包括有機溶劑萃取法、超臨界萃取法、柱層析、膜分離法等[14]。磷脂易溶于乙醇、氯仿、正己烷等有機溶劑，不溶于丙酮，所以被稱為丙酮不溶物，根據(jù)這種特性可對磷脂化合物進(jìn)行初步分離提純[15]。一般是將溶解和沉淀兩種手段結(jié)合使用。我國對磷脂的提取主要集中在大豆、蛋黃和魚下腳料等的提取，而在牦牛酥油中提取幾乎未見報道。本文采用溶劑提取法對牦牛酥油的磷脂進(jìn)行提取并對其脂肪酸組成進(jìn)行分析。

1 實驗

1.1 儀器

雙光束紫外可見分光光度計(UV—2600)，日本島津公司；電熱恒溫水浴鍋,上海比朗儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海恒科學(xué)儀器有限公司）、旋渦混合器（M VS-1），北京東方開物科學(xué)器材有限公司；恒溫震蕩器(THZ-82)，常州國華電器有限公司；醫(yī)用離心機（LC-04C），江蘇正基儀器有限公司；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（Trace DSQ），賽默飛世爾科技公司；電子天平(JM-B 3003)，諸暨市超澤衡器設(shè)備有限公司。

1.2 試劑

牦牛酥油購自青海省祁連縣野牛溝牧民家；正己烷、丙酮、磷酸二氫鉀、鉬酸銨、氫氧化鈉、乙二胺四乙酸二鈉鹽、抗壞血酸、98%濃硫酸、高氯酸、冰醋酸、95%乙醇、無水乙醇、甲醇、氫氧化鉀、酚酞指示劑、氯化鈉、無水硫酸鈉均為分析純；水為去離子水；三氟化硼甲醇，成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牦牛酥油中磷脂的提取方法

精密稱取牦牛酥油2 g于50 m L離心管中，加8 m L正己烷，45℃下水浴1 h（漩渦震蕩使酥油中的磷脂充分溶解），之后在3 000 r/m in的轉(zhuǎn)速下離心10 m in,取上清液于另一干凈的50 m L離心管中，加入丙酮濃縮磷脂，丙酮的添加量為溶液開始變渾濁或者開始產(chǎn)生沉淀時停止加入（大約是上清液體積的2～3倍），震蕩均勻后在4℃冰箱中靜置約25 h。底部沉淀就是粗磷脂，用移液槍吸出上清液，離心，分離出離心管底部粗磷脂后用氮氣吹干，得到磷脂產(chǎn)品,于-20℃冷凍保存。

1.3.2 牦牛酥油磷脂得率計算

式中：m1為提取物質(zhì)量，g；m2為牦牛酥油原料質(zhì)量，g。

1.3.3 磷脂純度的測定

采用抗壞血酸-鉬藍(lán)法[16]測定牦牛酥油提取物中總磷脂，磷脂純度計算公式如下：

式中：m為提取物中的含磷量，g；w為測定樣品所用提取物的質(zhì)量，g；26.3—每毫克磷相當(dāng)于磷脂的毫克數(shù)。

1.3.4 試驗設(shè)計

1.3.4.1 單因素試驗設(shè)計

取白色和黃色牦牛酥油，固定提取條件：液固比4 m L/g，正己烷提取時間60 m in，提取溫度45℃，丙酮沉淀時間25 h,當(dāng)其他因素不變時，改變單一因素，以正己烷浸提磷脂的得率和純度為指標(biāo)，分別探討液固比（3、4、5、6、7 m L/g）、提取時間（30、40、50、60、70 m in）、提取溫度（35、40、45、50、55℃）、丙酮沉淀時間(15、20、25、30、35 h)4個因素對正己烷浸提磷脂提取效果的影響。

1.3.4.2 正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以液固比、提取時間和提取溫度為因素，各選出3個水平設(shè)計三因素三水平的L9(34)正交試驗，以確定正己烷浸提粗磷脂的最佳工藝參數(shù),因素水平見表1。

表1 正正交試驗因素水平表

1.3.5 分析方法

1.3.5.1 樣品甲酯化

取0.5 g牦牛酥油粉末磷脂于具塞試管中，加入10 m L甲醇和1 g氫氧化鉀，蓋住瓶口，于65℃恒溫震蕩培養(yǎng)2 h。取出冷卻后，加入濃鹽酸酸化至pH為2～3，再加入10 m L正己烷，震蕩均勻，靜置10 m in待其分層，取正己烷層（上層）于另一干燥試管中，用氮氣干燥正己烷，獲得干燥的游離脂肪酸。加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的BF31 m L，90℃水浴2 h；取出冷卻后，移入離心管中，加2 m L正己烷，震搖，3 500 rpm離心2 m in，取正己烷層氮氣吹干，進(jìn)行GC分析。

1.3.5.2 GC-M S分析

柱子型號DB-5M S 60m×0.25mm×0.25μm廣州費尼根儀器有限公司；色譜柱：柱子型號為ZB-5M S 60 m×0.25 mm×0.25μm。程序升溫條件：初始溫度60℃，保持1 m in；以10℃/m in，升溫至180℃，保持0 m in，以4℃/m in，升溫至280℃，保持10 m in，以20℃/m in，升溫至300℃，保持2 m in；載氣：高純H e(99.999%)，進(jìn)樣口溫度：280℃，進(jìn)樣量：1.0 m L/m in，傳輸線溫度：285℃；離子源溫度：250℃；溶劑延遲時間7 m in。質(zhì)量掃描范圍：40～550 u。

2 結(jié)果分析

2.1 檢測波長選擇

在500～900 nm波長每隔10 nm測定吸光度值，在819 nm處有最大吸收，故選擇819 nm作為檢測波長。

圖1 波長選擇

2.2 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 磷含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 單因素試驗結(jié)果

2.3.1 提取時間對牦牛酥油磷脂得率與純度的影響

圖3 提取時間對牦牛酥油磷脂提取效果的影響

提取時間對牦牛酥油磷脂得率與純度的影響如圖3所示，隨著提取時間的延長,牦牛酥油磷脂得率和純度先增加后趨于平緩。當(dāng)提取時間為60 m in時，黃酥油與白酥油的磷脂得率最高，分別為6.30%和5.47%。當(dāng)提取時間為50 m in時，黃酥油與白酥油的磷脂純度最高，分別為58.08%和53.16%。當(dāng)提取時間高于60 m in后，正己烷中溶解度不大的物質(zhì)的溶解量逐漸積累、増加，最終導(dǎo)致磷脂純度的下降。因此，綜合考慮提取時間在50～60 m in為宜。

2.3.2 提取溫度對牦牛酥油磷脂得率與純度的影響

提取溫度對牦牛酥油磷脂得率與純度的影響如圖4所示，隨著提取溫度的升高,牦牛酥油磷脂得率和純度先增加后趨于平緩。白酥油和黃酥油的磷脂得率在35℃～50℃之間呈上升趨勢，50℃時磷脂得率最高，分別為6.30%和5.71%，當(dāng)大于50℃時得率開始下降。而白酥油和黃酥油的磷脂純度在35℃～45℃之間呈上升趨勢，45℃時磷脂純度最高，分別為63.56%和55.36%，當(dāng)大于45℃時純度有所下降，但都在50%以上。這可能是由于溫度的升高，使溶解度增大，所以在一定溫度范圍內(nèi)，牦牛酥油磷脂得率與純度均增加。但溫度過高，會導(dǎo)致其他雜質(zhì)如色素等的溶解，產(chǎn)品純度下降，但隨溫度繼續(xù)升高到一定程度后，磷脂分子在正己烷中的溶解度達(dá)到平衡，并且料液間氣化層的形成，阻礙溶劑進(jìn)入，導(dǎo)致得率下降。因此，綜合考慮提取溫度在45℃～55℃為宜。

圖4 提取溫度對牦牛酥油磷脂提取效果的影響

2.3.3 液固比對牦牛酥油磷脂得率與純度的影響

圖5 液固比對牦牛酥油磷脂提取效果的影響

正己烷用量與牦牛酥油質(zhì)量之比對磷脂得率與純度的影響如圖5所示，隨著液固比的增加,磷脂得率先增加后趨于平緩。當(dāng)正己烷用量與牦牛酥油液固比為5∶1時,黃酥油與白酥油的磷脂得率最高,分別為6.41%和5.47%?？赡苁钦和橛昧康脑龆?，導(dǎo)致牦牛酥油與溶劑接觸面積的增大，促進(jìn)磷脂的溶出，得率增加。但當(dāng)液固比超過5 m L/g時，提取能力達(dá)到飽和，過量的正己烷只能造成資源的浪費。隨著液固比的增加,磷脂純度也是先增加后趨于平緩。當(dāng)正己烷用量與牦牛酥油液固比為6∶1時,黃酥油與白酥油的磷脂純度最高，分別為51.3%和53.78%。但由于正己烷用量增大到一定程度，一些非磷脂成分在溶液中的溶解度升高，導(dǎo)致純度下降。因此，綜合考慮磷脂的得率和純度，液固比在5～6 m L/g為宜。

2.3.4 丙酮沉淀時間對牦牛酥油磷脂得率與純度的影響

丙酮沉淀時間對牦牛酥油磷脂得率與純度的影響如圖6所示，隨著去油時間的延長，磷脂得率和純度先增加后趨于平緩。白酥油和黃酥油的磷脂得率在15～25 h之間呈上升趨勢，25 h時磷脂得率最高，分別為6.30%和5.47%，當(dāng)大于25 h時磷脂得率趨于平緩。而白酥油和黃酥油的磷脂純度在15～30 h之間呈上升趨勢，30 h時磷脂純度最高，分別為50.28%和52.05%，當(dāng)大于30 h時純度趨于平緩。這可能是由于隨著丙酮沉淀時間的延長，除油率隨之增大，當(dāng)時間繼續(xù)延時，丙酮揮發(fā)溶解的中性油又析出，使得純度降低，因此，確定除油時間為25 h。

表2 正交試驗因素水平表

圖6 丙酮沉淀時間對牦牛酥油磷脂提取效果的影響

2.4 正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗對提取工藝的初步探索，進(jìn)行正交試驗。考慮到丙酮沉淀時間30 h時，提取得到的磷脂其提取率和純度均較好，本研究將丙酮沉淀時間固定為30 h，著重探討提取時間、提取溫度、液固比的影響，各選出三個水平，設(shè)計了三因素三水平的L9(34)的正交試驗，試驗因素水平見表1，正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

由正交表可知，黃酥油磷脂得率的直觀分析結(jié)果顯示，最佳提取條件為A2B2C2，各因素對磷脂得率的影響主次順序為C＞A＞B；黃酥油磷脂純度的最佳提取條件為A3B3C3，各因素對磷脂純度的影響主次順序為A＞C＞B；考慮在產(chǎn)品質(zhì)量為首要目標(biāo)，同時盡可能保證產(chǎn)品的得率，因而磷脂純度的直觀分析結(jié)果成為首選。因此本研究優(yōu)先考慮磷脂純度指標(biāo)，液固比選擇6 m L/g，提取溫度選擇55℃，而考慮到提取時間對磷脂得率和純度影響都不大，但是當(dāng)提取時間為60 m in時磷脂的得率和純度都相對較高，并且與單因素試驗結(jié)果相符合，因此，綜合考慮黃酥油提取最優(yōu)組合為A3B2C3，即最佳試驗條件為：液固比6 m L/g，提取時間60 m in，提取溫度55℃。

白酥油磷脂得率的直觀分析結(jié)果顯示，最佳提取條件為A1B2C3，各因素對磷脂得率的影響各因素的主次順序為A＞B＞C。磷脂純度最佳提取條件為A3B2C1，各因素的主次順序為C＞B＞A。同理，優(yōu)先考慮磷脂純度指標(biāo)，液固比選6 m L/g，提取時間選擇60 m in，提取溫度選擇55℃。綜合考慮白酥油提取最優(yōu)組合為A3B2C1，即最佳試驗條件為：液固比6 m L/g，提取時間60 m in，提取溫度45℃。

2.5 驗證試驗

對最優(yōu)工藝條件進(jìn)行驗證，在A3B2C3和A3B2C1條件下分別對黃酥油和白酥油進(jìn)行3次平行試驗，黃酥油磷脂得率為6.74%，純度為62.96%，白酥油磷脂得率為4.97%，純度為58.09%。該結(jié)果在保證產(chǎn)品品質(zhì)的同時，得到較高的得率。

2.6 酥油脂肪酸組成的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

對牦牛酥油以及經(jīng)正己烷提取丙酮沉降后的磷脂，進(jìn)行脂肪酸組成分析，結(jié)果如表3所示。牦牛酥油中檢出36種脂肪酸，其中飽和脂肪酸26種，白色和黃色牦牛酥油飽和脂肪酸含量分別占脂肪酸總量的75.89%和73.73%，不飽和脂肪酸10種，由單不飽和脂肪酸與多不飽和脂肪酸組成，分別占脂肪酸總量的24.12%和26.27%。還有5種支鏈脂肪酸，分別占脂肪酸總量的9.1%和5.28%。主要的脂肪酸為肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸和油酸；單不飽和脂肪酸6種，分別占脂肪酸總量的23.10%和23.84%，多不飽和脂肪酸4種，分別占脂肪酸總量的1.02%和2.43%。

牦牛酥油磷脂中共檢測出29種脂肪酸，其中飽和脂肪酸24種，白色和黃色酥油磷脂飽和脂肪酸含量分別占總量的94.28%和97.04%。不飽和脂肪酸5種，分別占脂肪酸總量的5.72%和2.96%。主要為肉豆蔻酸、棕櫚酸和硬脂酸。單不飽和脂肪酸4種，分別占脂肪酸總量的5.39%和2.25%，多不飽和脂肪酸1種，分別占脂肪酸總量的0.33%和0.71%。支鏈脂肪酸5種，分別占脂肪酸總量的3.95%和3.24%。

可以看出牦牛酥油與酥油磷脂相比，脂肪酸組成以及含量有較大差別。如酥油磷脂中支鏈脂肪酸、單不飽和脂肪酸和中鏈脂肪酸含量顯著低于牦牛酥油中的含量；牦牛酥油中含有的多種不飽和脂肪酸(如EPA、DHA等)在酥油磷脂中并未檢測出，并且牦牛酥油不飽和脂肪酸含量達(dá)24%以上，是酥油磷脂的五倍以上；酥油磷脂中飽和脂肪酸含量明顯高于牦牛酥油中，尤其是棕櫚酸和硬脂酸?，F(xiàn)已有許多研究證明不飽和脂肪酸尤其是多不飽和脂肪酸具有多種生物學(xué)功能，如CLA具有抗腫瘤、降低膽固醇、抗動脈粥樣硬化形成、免疫調(diào)節(jié)等作用[17-18]；ALA具有降低膽固醇含量、保護(hù)視力、抑制衰老、降血脂的功能[19]，AA有助于嬰幼兒的成長發(fā)育、降血脂、降血壓和降血膽固醇[20]；EPA和DHA具有預(yù)防心血管疾病，抗炎抗過敏，健腦明目等作用[21]，有研究表明支鏈脂肪酸具有具有抗癌作[22-23]。由表3可以看出牦牛酥油中功能性脂肪酸種類豐富，含有油酸、CLA、AA、EPA、DHA等多種功能性成分，但AA、EPA、DHA在酥油磷脂中并未檢測出。

表3 牦牛酥油及磷脂脂肪酸組成及相對含量 %

3 結(jié)論

通過單因素試驗和正交試驗確定出黃色牦牛酥油磷脂最佳提取的工藝為液固比6 m L/g，提取時間60 m in，去油時間25 h，提取溫度55℃，在此工藝條件下粗磷脂得率為6.74%，純度為62.96%；白色牦牛酥油最佳提取的工藝為液固比6 m L/g，提取時間60 m in，去油時間25 h，提取溫度45℃，在此工藝條件下粗磷脂得率為4.97%，純度為58.09%。對原料及產(chǎn)物經(jīng)過氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析脂肪酸組成，牦牛酥油中檢出36種脂肪酸，其中飽和脂肪酸26種，占脂肪酸總量的73.73%～75.89%，不飽和脂肪酸10種，占脂肪酸總量的24.12%～26.27%；磷脂中共檢測出29種脂肪酸，其中飽和脂肪酸24種，占脂肪酸總量的94.28%～97.04%，不飽和脂肪酸5種，占脂肪酸總量的2.96%～5.72%。牦牛酥油與酥油磷脂脂肪酸組成以及含量差別較大，酥油磷脂中支鏈脂肪酸、單不飽和脂肪酸和中鏈脂肪酸含量顯著低于牦牛酥油；牦牛酥油不飽和脂肪酸含量是酥油磷脂的5倍以上，并且牦牛酥油中含有的多種不飽和脂肪酸(如EPA、DHA等)在酥油磷脂中并未檢測出。本工藝成本較低，操作簡單，易于產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，以期為牦牛酥油磷脂提取工藝的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。