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    酶水解-液相色譜法測(cè)定嬰幼兒食品中的色氨酸

    2019-11-07 07:12:34孫立臻別梅馮峰王駿祝建華劉艷明張峰
    中國(guó)乳品工業(yè) 2019年9期

    孫立臻,別梅,馮峰,王駿,祝建華,劉艷明,張峰

    (1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院,濟(jì)南250100;2.山東省特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心,濟(jì)南250100;3.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院,北京100176)

    0 引言

    L-色氨酸(L-Tryptophan)是人體必需的一種氨基酸[1],嬰幼兒如果缺乏色氨酸,會(huì)導(dǎo)致其蛋白質(zhì)和脂肪代謝障礙,影響其正常的生長(zhǎng)發(fā)育[2-3]。我國(guó)的標(biāo)準(zhǔn)[4-5]中,均規(guī)定嬰幼兒食品中允許添加L-色氨酸,并對(duì)含量有明確要求。但我國(guó)缺乏相關(guān)產(chǎn)品中色氨酸的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn),使政府監(jiān)管和企業(yè)質(zhì)量控制難以有效開展。

    目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于乳粉中色氨酸的檢測(cè)的報(bào)道較少,對(duì)特殊醫(yī)學(xué)食品中色氨酸的檢測(cè)的報(bào)道幾乎沒有。已有的色氨酸的檢測(cè)方法主要有分光光度計(jì)法[6-7]、離子交換色譜法[8]、液相色譜[9-10]和液-質(zhì)聯(lián)用法[11]等方法,前處理過程一般為堿水解法[12-14],堿水解法水解產(chǎn)物復(fù)雜、重現(xiàn)性差、靈敏度較低[15]。本研究建立了一種準(zhǔn)確測(cè)定嬰幼兒食品中色氨酸含量的酶解-高效液相色譜法。該法準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好,對(duì)N IST標(biāo)準(zhǔn)乳粉(1849a)的測(cè)定結(jié)果滿意,可用于市售嬰幼兒配方乳粉及醫(yī)學(xué)食品中色氨酸含量的檢測(cè),為乳粉和醫(yī)學(xué)食品中色氨酸的監(jiān)管提供了技術(shù)支持。

    1 實(shí)驗(yàn)

    1.1 材料與試劑

    L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品Bepure;XBridge C 18色譜柱(150 mm×4.6 mm,3.5μm);甲醇(色譜純);T ris堿;鹽酸;乙酸;氫氧化鋰;蛋白酶;N IST乳粉標(biāo)準(zhǔn)品(1849a);乳粉和醫(yī)學(xué)食品。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Waters e2695高效液相色譜儀(配備熒光檢測(cè)器2475和二極管陣列檢測(cè)器2998);AB204-S型電子天平;SB-800DTD型超聲波清洗器;3-18K型冷凍離心機(jī);Milli-Q超純水制備器;渦旋混合器;DNP-9162BS-III電熱恒溫培養(yǎng)箱。

    1.3 試劑的配制

    1.3.1 L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

    準(zhǔn)確稱取10 m g(精確到0.1 m g)L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品于10 m L容量瓶中,用水溶解并定容至刻度,混勻。然后用水逐級(jí)稀釋到質(zhì)量濃度為0.2~100μg/m L,臨用前配制。

    1.4 色譜條件

    W aters Xbridge C 18色譜柱(3.5μm,150 mm×4.6 mm);流動(dòng)相:A為甲醇,B為0.1%乙酸;流速0.8 m L/m in;進(jìn)樣體積10μL;激發(fā)波長(zhǎng)295 nm,發(fā)射波長(zhǎng)345 nm;柱溫35℃;等度洗脫條件為:甲醇0.1%,乙酸水=10∶90。

    1.5 樣品處理

    1.5.1 游離色氨酸的測(cè)定

    稱取混合均勻的固體試樣500 m g(精確到0.1 m g)于50 m L刻度管中,加入2 m L水,超聲溶解,加入12 m L甲醇,充分混勻沉淀蛋白,用水定容至50 m L刻度,冷凍離心,濾液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾,液相色譜測(cè)定。

    1.5.2 色氨酸總量的測(cè)定(酶水解法)

    稱取混合均勻的固體試樣200 m g(精確到0.1 mg)于50 m L帶螺紋的離心管中,加入0.5 m L蛋白酶溶液(質(zhì)量濃度5 mg/m L),3.0 m L Tris堿緩沖液(濃度為0.1 m o l/L,p H=8.5),200μL甲醇,超聲溶解,混合均勻,于50℃恒溫培養(yǎng)箱中18 h至酶解完全待樣品冷卻至室溫,加入12 m L甲醇。用水定容至50 m L,混勻后冷凍離心,濾液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾,液相色譜測(cè)定。

    1.5.3 色氨酸總量的測(cè)定(堿水解法)

    稱取混合均勻的固體試樣200 m g(精確到0.1 m g),置于帶螺紋的聚四氟乙烯水解管中,加5 m L濃度為4 mol/L的氫氧化鋰溶液,充氮?dú)夂?,旋緊蓋子,放入(110±1)℃恒溫干燥箱,水解20 h。冷卻至室溫,混勻開管,用水將水解液定量地轉(zhuǎn)移到50 m L刻度管中,濃度為6 m ol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值到中性,并用水定容至刻度,混勻后冷凍離心,濾液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾,液相色譜測(cè)定。

    1.5.4 空白實(shí)驗(yàn)

    除不加試樣外,其他操作步驟同試樣的操作步驟。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 水解方式的考察

    本研究選取嬰幼兒配方乳粉和醫(yī)學(xué)食品進(jìn)行了堿水解法和酶水解法的對(duì)比,表1結(jié)果表明,酶水解法的測(cè)定結(jié)果(扣除空白值)均不同程度的高于堿水解法的結(jié)果。乳粉的測(cè)定結(jié)果差異較小,在6.3%~9.0%之間;醫(yī)學(xué)食品的測(cè)定結(jié)果差異較大,在6.0%~21.2%之間,差異最大的是含有大量游離色氨酸的氨基酸配方醫(yī)學(xué)食品,其次是添加了不同程度水解乳清蛋白粉的深度水解配方醫(yī)學(xué)食品和部分水解配方醫(yī)學(xué)食品,而無(wú)乳糖配方、早產(chǎn)兒配方和全營(yíng)養(yǎng)配方的醫(yī)學(xué)食品測(cè)定結(jié)果差異稍小。

    根據(jù)產(chǎn)品標(biāo)簽分析,氨基酸配方和部分/深度水解配方的醫(yī)學(xué)食品中添加的是游離色氨酸和經(jīng)過不同程度水解得到的小分子肽段,高濃度的堿液對(duì)其具有不同程度的破壞作用,導(dǎo)致其結(jié)果比酶水解法偏低很多;其余幾種配方的醫(yī)學(xué)食品與乳粉的基質(zhì)類似,調(diào)整的僅是維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)指標(biāo),故其測(cè)定結(jié)果的差異程度與乳粉類似。無(wú)論是從操作的簡(jiǎn)便程度,還是結(jié)果的準(zhǔn)確度上考慮,酶水解法都更適用于乳粉和醫(yī)學(xué)食品中色氨酸的測(cè)定。

    表1 堿水解法與酶水解法的結(jié)果對(duì)比

    2.2 酶解條件的優(yōu)化

    2.2.1 酶解溫度

    以標(biāo)準(zhǔn)乳粉1849a((184±10)m g/100g)作為實(shí)驗(yàn)樣品,固定酶的加入量(0.5 m L)和酶解時(shí)間(18 h),分別考察反應(yīng)體系在40,45,50,55,60℃等不同溫度下的結(jié)果;結(jié)果表明,當(dāng)酶解溫度為50℃,達(dá)到酶解峰值,如圖1所示。

    2.2.2 酶解時(shí)間

    以標(biāo)準(zhǔn)乳粉1849a作為試驗(yàn)樣品,固定酶的加入量(0.5 m L)和酶解溫度(50℃),分別考察反應(yīng)體系在不同酶解時(shí)間(14,16,18,20,22,24 h)的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)酶解的時(shí)間超過16 h以后,結(jié)果趨于穩(wěn)定,證明酶解充分。綜合時(shí)間、效率、準(zhǔn)確度等因素,18 h為最佳的酶解時(shí)間,結(jié)果如圖2所示。

    2.2.3 酶的用量

    以標(biāo)準(zhǔn)乳粉1849a作為實(shí)驗(yàn)樣品,固定酶解溫度(50℃)和酶解時(shí)間(18 h),分別考察酶的用量對(duì)結(jié)果的影響。結(jié)果均為扣除試劑空白以后的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)酶的用量超過0.5 m L以后,結(jié)果趨于穩(wěn)定,綜合考慮到成本等問題,酶的最佳用量為0.5 m L,結(jié)果如圖3所示。

    圖1 1849a在不同酶解溫度下的結(jié)果

    圖2 1849a在不同酶解時(shí)間下的結(jié)果

    圖3 1849a在不同酶用量下的結(jié)果

    2.3 色譜條件的優(yōu)化

    2.3.1 色譜柱

    本研究比較了Therm o Acclaim C 8(3.0 mm×150 mm,3μm),Waters Xbridge C 18(4.6 mm×150 mm,3.5μm),W aters Atlantis T 3(4.6 mm×250 mm,5μm)3種類型的色譜柱,驗(yàn)證色氨酸的色譜保留行為。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,色氨酸在3種色譜柱條件下均能有很好的保留,從方法的適用性及普及性上考慮,C 18色譜柱更為常規(guī)和普及,故最終選擇Waters Xbridge C 18(4.6 mm×150 mm,3.5μm)柱作為分析柱。

    2.3.2 流動(dòng)相

    本研究分別考察了甲醇-0.5 m o l/L磷酸二氫鈉緩沖鹽溶液(pH=2.3),甲醇-0.1%磷酸水溶液,甲醇-0.1%乙酸水溶液3種流動(dòng)相體系,在合適的有機(jī)相洗脫條件下,均能夠很好的分離目標(biāo)物,且無(wú)干擾,綜合考慮磷酸鹽容易堵塞色譜柱、不易沖洗等原因,最終選擇甲醇-0.1%乙酸水溶液作為流動(dòng)相條件。

    2.3.3 檢測(cè)器

    L-色氨酸具有吲哚環(huán)的結(jié)構(gòu),因此在紫外檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器上均有較強(qiáng)的吸收。L-色氨酸在219 nm和278 nm處均有較強(qiáng)的紫外吸收,光譜圖(見圖4)。考慮到219 nm附近的干擾較多,故選擇278 nm作為紫外檢測(cè)器測(cè)定波長(zhǎng)。本研究分別考察了乳粉1849a在278 nm處的紫外色譜圖和激發(fā)波長(zhǎng)295 nm,發(fā)射波長(zhǎng)345 nm處的熒光色譜圖(見圖5)。結(jié)果表明,L-色氨酸在紫外檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器上均具有良好的響應(yīng),目標(biāo)峰處均無(wú)干擾。通過對(duì)樣品的測(cè)試表明,兩種檢測(cè)器的定量結(jié)果無(wú)差異,結(jié)果如圖6所示??紤]到熒光檢測(cè)器具有更強(qiáng)的特異性,故選擇熒光檢測(cè)器作為主要的定量手段,紫外檢測(cè)器作為輔助定性定量的手段,本研究的方法學(xué)數(shù)據(jù)均為熒光檢測(cè)器的結(jié)果。

    圖4 L-色氨酸的光譜圖

    圖5 L-色氨酸的色譜圖

    圖6 紫外檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器定量結(jié)果

    2.4 方法線性及檢出限

    在上述優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,本研究考察了色氨酸在0.2~100μg/m L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系和相關(guān)系數(shù),結(jié)果表明色氨酸在該濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,線性回歸方程為

    Y=388456X+36512,相關(guān)系數(shù)(r)大于0.9999。綜合考慮信噪比和儀器分析的線性范圍,確定方法的檢出限和定量限分別為1.5 m g/100g和5 mg/100g。本方法的靈敏度完全能夠滿足對(duì)乳粉和醫(yī)學(xué)食品中色氨酸的檢測(cè)需求。

    2.5 精密度與回收率

    本研究對(duì)乳粉1849a進(jìn)行了6平行的測(cè)定實(shí)驗(yàn),并通過向樣品中添加低、中、高3個(gè)濃度水平的色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,使樣品中色氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為(284,684,1184)m g/100g,每個(gè)水平平行測(cè)定6次,按上述樣品制備方法操作,分別得到精密度和回收率。結(jié)果表明,本方法色氨酸的回收率在99.0%~105.3%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.52%~2.01%,結(jié)果如表2所示。這說明本方法完全能夠滿足實(shí)際樣品檢測(cè)的需求。

    3 方法應(yīng)用

    本研究依照上述所建立的方法對(duì)購(gòu)自市場(chǎng)和企業(yè)不同品牌、不同配方的國(guó)內(nèi)外乳粉和醫(yī)學(xué)食品進(jìn)行了測(cè)定。并分別比較了各種配方的樣品中游離色氨酸與總色氨酸的關(guān)系。

    嬰幼兒配方乳粉中最常見的是牛奶粉和羊奶粉,奶粉中乳蛋白的水解是色氨酸的主要來源。本研究測(cè)定了來自不同品牌的5種牛奶粉和5種羊奶粉的色氨酸,結(jié)果如表3所示。多數(shù)奶粉中游離色氨酸的量低于定量限,說明樣品中的色氨酸來源于乳蛋白的水解。而牛奶粉5的游離色氨酸的量為25 m g/100g,樣品標(biāo)簽顯示其添加了單體色氨酸,這與本研究的結(jié)果一致。

    表2 L-色氨酸的加標(biāo)回收率及精密度

    特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品的常見配方有6種,包括氨基酸代謝障礙配方、乳蛋白深度水解配方、乳蛋白部分水解配方、全營(yíng)養(yǎng)配方(母乳營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑)、早產(chǎn)/低出生體重兒配方和低乳糖配方。本研究對(duì)6種配方的樣品進(jìn)行了測(cè)定,并比較了游離色氨酸的比重,結(jié)果如表4所示。根據(jù)GB 25596規(guī)定,氨基酸代謝障礙配方中添加的是游離態(tài)氨基酸,包括L-色氨酸,研究結(jié)果顯示氨基酸代謝障礙配方中游離色氨酸占總色氨酸的99%以上;乳蛋白深度水解配方適用于食物蛋白過敏的嬰兒,不含有食物蛋白,添加成分為深度水解為氨基酸和肽段的乳清蛋白粉,研究結(jié)果顯示乳蛋白深度水解配方中既有游離態(tài)的色氨酸,也有水解色氨酸,游離色氨酸占總色氨酸的37.6%~61.4%;部分水解乳清蛋白粉配方添加的是經(jīng)加工分解成小分子乳蛋白、肽段和氨基酸的乳清蛋白粉,會(huì)有少量游離色氨酸的檢出,這與本研究結(jié)果相吻合,游離色氨酸占總色氨酸的6.4%~10.8%;其他配方(無(wú)/低乳糖配方、早產(chǎn)/低出生體重兒配方和全營(yíng)養(yǎng)配方)的醫(yī)學(xué)食品僅在普通乳粉的基礎(chǔ)上,對(duì)能量、乳糖、某些礦物質(zhì)和維生素等的含量進(jìn)行了調(diào)整,因此總色氨酸的量均來自于蛋白水解色氨酸,這與本研究的結(jié)果一致,這幾種配方的醫(yī)學(xué)食品中游離色氨酸的量均低于定量限。

    表3 乳粉中游離色氨酸及總色氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比對(duì)結(jié)果

    表4 特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中游離色氨酸及總色氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)比對(duì)

    4 結(jié)論

    本研究通過酶水解法,建立了嬰幼兒配方乳粉和特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中色氨酸的高效液相色譜法。該方法準(zhǔn)確度好,靈敏度高。將該方法應(yīng)用于實(shí)際乳粉和醫(yī)學(xué)食品的檢測(cè)結(jié)果表明,不同基質(zhì)和配方的樣品之間,色氨酸的總量差異較大,游離色氨酸占色氨酸總量的比重也各不相同。本方法為制定嬰幼兒配方食品特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中色氨酸的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)提供了技術(shù)支持。

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