沙蔥螢葉甲氣味結(jié)合蛋白GdauOBP20的基因克隆、 原核表達(dá)及其結(jié)合特性

李玲，譚瑤，周曉榕，龐保平

沙蔥螢葉甲氣味結(jié)合蛋白GdauOBP20的基因克隆、 原核表達(dá)及其結(jié)合特性

李玲，譚瑤，周曉榕，龐保平

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原昆蟲研究中心，呼和浩特 010020）

【】沙蔥螢葉甲（）是近年來在內(nèi)蒙古草原上暴發(fā)成災(zāi)的新害蟲，本文旨在克隆沙蔥螢葉甲氣味結(jié)合蛋白基因的cDNA全長序列，明確其重組蛋白與寄主植物揮發(fā)物的結(jié)合特性，為揭示沙蔥螢葉甲嗅覺的分子機理打下基礎(chǔ)。基于沙蔥螢葉甲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用RACE技術(shù)對沙蔥螢葉甲氣味結(jié)合蛋白基因進(jìn)行cDNA全長克??；利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測分析其編碼蛋白的理化特性和結(jié)構(gòu)特征；通過原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的蛋白，并使用Ni-NTA Agarose親和層析柱進(jìn)行重組蛋白純化。最后采用熒光競爭結(jié)合的方法，以N-苯基-1-萘胺（N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN）為熒光探針，檢測GdauOBP20重組蛋白與13種主要寄主揮發(fā)物的結(jié)合情況。的cDNA全長序列為567 bp（GenBank登錄號MK250532），其中5′末端非編碼區(qū)長24 bp，3′末端非編碼區(qū)長123 bp，具有ployA尾結(jié)構(gòu)；開放閱讀框（ORF）全長為420 bp，編碼139個氨基酸。氨基酸序列中含有4個保守的半胱氨酸位點，屬于Minus-C OBP亞家族。預(yù)測蛋白三級結(jié)構(gòu)中含有6個螺旋和兩對由半胱氨酸形成的二硫鍵。成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體并獲得了高純度的重組蛋白。重組蛋白GdauOBP20與熒光探針1-NPN的結(jié)合常數(shù)為12.8 μmol·L-1，結(jié)合能力較好，可作為本試驗的熒光報告子。在所測的13種主要寄主植物揮發(fā)物中，除與二烯丙基三硫醚無結(jié)合能力外，GdauOBP20重組蛋白與其他12種寄主植物揮發(fā)物均有不同程度的結(jié)合能力，其中與對二甲苯和環(huán)庚三烯的結(jié)合能力最強，解離常數(shù)分別為22.91和26.55 μmol·L-1，而與月桂烯結(jié)合能力最弱，解離常數(shù)為116.29 μmol·L-1。沙蔥螢葉甲GdauOBP20能與寄主植物的多種主要揮發(fā)性物質(zhì)結(jié)合，推測其可能在沙蔥螢葉甲對寄主植物的定位過程中發(fā)揮重要的作用。

沙蔥螢葉甲；氣味結(jié)合蛋白；RACE克隆；原核表達(dá)；熒光競爭結(jié)合試驗

0 引言

【研究意義】在昆蟲的眾多感覺系統(tǒng)中，嗅覺感受系統(tǒng)對于其生命活動起到了至關(guān)重要的作用，昆蟲通過嗅覺感器接觸和分析外界氣味信息，從而保證其尋偶、覓食和產(chǎn)卵等生命活動的正常進(jìn)行[1-2]。氣味結(jié)合蛋白（odorant binding protein，OBP）是一類水溶性小分子蛋白，它能選擇性地結(jié)合并運輸疏水性氣味分子通過感受器淋巴液到達(dá)相應(yīng)的氣味受體，從而產(chǎn)生神經(jīng)沖動，在化學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著關(guān)鍵的作用[2-5]。研究昆蟲OBP與揮發(fā)物的結(jié)合能力，對揭示其嗅覺機理具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】沙蔥螢葉甲（）屬鞘翅目（Coleoptera），葉甲科（Chrysomelidae），螢葉甲亞科（Galerucinae），是一種主要危害沙蔥（）、多根蔥（）、野韭（）等百合科蔥屬植物的寡食性害蟲，自2009年在內(nèi)蒙古錫林郭勒盟草原上首次大面積暴發(fā)成災(zāi)以來，危害程度日益加重，已經(jīng)成為內(nèi)蒙古草原上重要的害蟲，嚴(yán)重影響了草原的生態(tài)環(huán)境質(zhì)量和畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[6-7]。筆者實驗室前期從沙蔥螢葉甲成蟲轉(zhuǎn)錄組中鑒定出29條編碼氣味結(jié)合蛋白的基因，并對它們的表達(dá)譜進(jìn)行了分析，其中特異性地表達(dá)于成蟲觸角中，表明其可能在沙蔥螢葉甲氣味識別中起關(guān)鍵作用[8]。目前對OBP功能的研究多集中于其對不同氣味物質(zhì)結(jié)合特性，涉及到的昆蟲種類有美洲大蠊（）、中華蜜蜂（）、松褐天牛（）、棗實蠅（）、棉鈴蟲（）、美洲斑潛蠅（）、梨小食心蟲（）及斜紋夜蛾（）等[9-16]，也有研究者開始應(yīng)用RNAi[17-21]和CRISPR/Cas9[22]研究OBP的功能，有助于揭示昆蟲的化學(xué)感受機理?！颈狙芯壳腥朦c】氣味結(jié)合蛋白在沙蔥螢葉甲與環(huán)境化學(xué)信息交流中起著重要作用，然而，目前對沙蔥螢葉甲氣味結(jié)合蛋白功能的研究尚未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用RACE技術(shù)克隆的cDNA全長序列，并通過構(gòu)建原核表達(dá)載體誘導(dǎo)重組蛋白大量表達(dá)，利用熒光競爭結(jié)合試驗對重組蛋白與寄主植物的主要揮發(fā)物的結(jié)合能力進(jìn)行測定，為揭示沙蔥螢葉甲嗅覺感受機理打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

2017年5月于內(nèi)蒙古錫林郭勒盟鑲黃旗采集沙蔥螢葉甲幼蟲，置于人工氣候培養(yǎng)箱中以沙蔥進(jìn)行飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件為溫度（26±1）℃，相對濕度60%—80%，光周期16L﹕8D。待成蟲羽化3 d后用手術(shù)刀切取雄蟲觸角，用液氮速凍后存放于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA的提取及cDNA的合成

取3日齡雄成蟲觸角40 mg，液氮迅速冷凍研磨后使用TaKaRa Mini BEST Universal RNA Extraction Kit提取總RNA，分別用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳和微量分光光度計NanoPhotometer? P 330（Implen，Germany）檢測RNA完整性和測定RNA濃度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）合成cDNA第一鏈。

1.3 GdauOBP20全長cDNA克隆

根據(jù)筆者實驗室測得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選并分析得到OBP20的中間片段，在序列兩端設(shè)計引物（表1），以雄成蟲觸角cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增。反應(yīng)體系：cDNA模板1 μL，正反向引物各1 μL，Premix TaqTM（V2.0 plus dye）（TaKaRa）12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，用DNA凝膠回收試劑盒回收純化目的片段，連接pMD19-T克隆載體（TaKaRa），轉(zhuǎn)化到大腸桿菌（）感受態(tài)細(xì)胞DH5（TIANGEN）后涂布含氨芐icillin（Amp）的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12 h，挑取白色單菌落進(jìn)行PCR驗證，然后將驗證正確的菌液于LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，再將菌液進(jìn)行送樣測序。

3′-和5′-末端序列擴增：根據(jù)上一步測序驗證結(jié)果，設(shè)計3′-和5′-特異性引物（表1），按照SMARTer? RACE 5′/3′ Kit（TaKaRa）試劑盒說明書進(jìn)行末端擴增，采用降落式PCR程序如下：94℃ 30 s，72℃ 2 min，5個循環(huán)；94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 2 min，5個循環(huán)；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 2 min，20個循環(huán)。再以擴增產(chǎn)物為模板進(jìn)行巢氏PCR，程序如下：94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 2 min，25個循環(huán)。得到擴增產(chǎn)物處理方法同上。測序得到的3′-、5′-目的片段序列與中間片段進(jìn)行拼接，最終得到該基因cDNA全長序列。

表1 本研究所用引物

下劃線部分為酶切位點The restriction sites are underlined

1.4 GdauOBP20序列的生物信息學(xué)分析

使用PredictProtein（https://www.predictprotein. org/）預(yù)測氨基酸序列中的二硫鍵位置和蛋白二級結(jié)構(gòu)；運用在線軟件Swiss-Model（https://www. swissmodel.expasy.org/）對蛋白三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。

1.5 GdauOBP20重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

根據(jù)開放閱讀編碼框序列，設(shè)計帶有I和R I酶切位點的引物（去除信號肽）（表1）。將PCR產(chǎn)物克隆到pMD19-T載體，測序成功的pMD19-T/質(zhì)粒和表達(dá)載體pET-28a進(jìn)行雙酶切，然后將載體片段與目的片段經(jīng)T4 DNA Ligase（New England Biolabs，NEB）連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5后涂布含卡那霉素Kanamycin的LB固體培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)，鑒定為陽性克隆送樣測序。將測序驗證后的pET28a/表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）（TIANGEN）中，挑取單菌落經(jīng)PCR鑒定，陽性克隆菌落接種于1 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩過夜培養(yǎng)。次日，將所得菌液按1/100的比例接種于新鮮培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)，當(dāng)OD600值達(dá)到0.6—0.8時，吸取一半的菌液于新的無菌EP管中，加入終濃度為1 mmol·L-1IPTG，另一半作為陰性對照，37℃振蕩培養(yǎng)4 h。用SDS-PAGE檢測重組蛋白表達(dá)情況。將表達(dá)良好的重組蛋白進(jìn)行大量誘導(dǎo)，離心收集菌體，經(jīng)超聲波破碎后分別收集上清和沉淀，用SDS-PAGE檢測重組蛋白表達(dá)形式。

使用Ni-NTA Agarose親和層析柱（QIAGEN）進(jìn)行重組蛋白純化，用3 500 Da的透析袋在PBS緩沖液中過夜透析。經(jīng)3 000 Da的超濾管濃縮后，用BCA法測定蛋白濃度。

1.6 GdauOBP20重組蛋白的配基結(jié)合試驗

試驗所用熒光探針1-NPN和氣味標(biāo)準(zhǔn)品均購自SIGMA-ALDRICH公司，使用色譜級的甲醇配制成1 mmol·L-1的儲備液。用HITACHI（F-7000）熒光分光光度計測定重組蛋白和1-NPN的結(jié)合能力。儀器參數(shù)設(shè)置如下：激發(fā)狹縫10 nm，發(fā)射狹縫10 nm，靈敏度2 s，激發(fā)光波長337 nm，掃描發(fā)射光波長范圍350—700 nm。取2 mL 2 μmol·L-1的重組蛋白溶液于1 cm寬的石英比色皿中，逐次加入2 μmol·L-11-NPN直至熒光強度值達(dá)到飽和值。每次加入1-NPN后進(jìn)行掃描并記錄熒光值。利用其熒光值計算出該蛋白與1-NPN的結(jié)合常數(shù)，在GraphPad Prism 7.0軟件中進(jìn)行Scatchard分析。然后通過競爭結(jié)合試驗測定氣味物質(zhì)和蛋白的結(jié)合能力。在競爭結(jié)合試驗中，將被測氣味物質(zhì)逐次加入重組蛋白GdauOBP20與1-NPN的混合體系中至終濃度為100 μmol·L-1，每次記錄熒光強度值。每個氣味重復(fù)測定3次。利用公式Ki= IC50/（1+[1-NPN]/K1-NPN）計算結(jié)合常數(shù)，其中IC50為熒光強度降至50%時加入的配基濃度，[1-NPN]為未結(jié)合的1-NPN濃度，K1-NPN為重組蛋白GdauOBP20與1-NPN的結(jié)合常數(shù)[23]。

2 結(jié)果

2.1 GdauOBP20全長cDNA的克隆及序列分析

經(jīng)3′和5′ RACE克隆和中間片段拼接得到cDNA全長序列567 bp（圖1），已在GenBank中注冊，登錄號為MK250532。其中5′末端非編碼區(qū)長24 bp，3′末端非編碼區(qū)長123 bp，具有ployA尾結(jié)構(gòu)。開放閱讀框全長420 bp，編碼139個氨基酸，含有4個保守的半胱氨酸位點，屬于Minus-C OBP亞家族。蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，該蛋白中螺旋（helix）、折疊（strand）和卷曲環(huán)（loop）分別占56.1%、12.9%和30.9%。以西方蜜蜂（）ASP5（SMTL ID：3r72.1 ）為模板對其進(jìn)行蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，目的蛋白與模板的氨基酸序列相似性為26.09%。模型結(jié)果顯示GMQE值為0.66，GMEAN值為-2.21，該值＞-4.0，說明模型的質(zhì)量較高[24]。從圖2可以看出，該蛋白含有6個螺旋，由4個半胱氨酸殘基形成的兩對二硫鍵Cys38- Cys69和Cys107-Cys127分別連接著1-3和4-6，維持著該蛋白空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。

2.2 GdauOBP20重組蛋白的表達(dá)與純化

誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果顯示，在15 kD左右出現(xiàn)一條蛋白條帶。對重組蛋白進(jìn)行不同IPTG濃度下誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果表明GdauOBP20重組蛋白在IPTG終濃度為0.5—0.8 mmol·L-1范圍內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)效果最好（圖3-A）。表達(dá)形式檢測結(jié)果顯示，GdauOBP20重組蛋白在上清中不表達(dá)，而是存在于沉淀中以包涵體的形式表達(dá)（圖3-B）。因此，對包涵體進(jìn)行復(fù)性處理后過柱純化得到GdauOBP20重組蛋白。

起始密碼子和終止密碼子用方框標(biāo)注，信號肽用下劃線標(biāo)注，保守的半胱氨酸用圓圈標(biāo)注

圖2 GdauOBP20蛋白的3-D結(jié)構(gòu)預(yù)測模型

2.3 GdauOBP20重組蛋白與配基的結(jié)合試驗

重組蛋白GdauOBP20與熒光探針1-NPN的結(jié)合曲線見圖4-A。隨1-NPN濃度的增加，熒光強度逐漸增強，多項式擬合相關(guān)系數(shù)為0.9966，結(jié)合常數(shù)為12.8 μmol·L-1。Scatchard分析線性相關(guān)系數(shù)為0.9414（圖4-B）。以1-NPN為探針，測定了13種沙蔥揮發(fā)物與GdauOBP20重組蛋白的結(jié)合能力。結(jié)果顯示（表2），除與二烯丙基三硫醚沒有結(jié)合能力外，GdauOBP20重組蛋白與其他12種寄主植物揮發(fā)物均有不同程度的結(jié)合能力，其中與對二甲苯的結(jié)合能力最強，解離常數(shù)K值為22.91 μmol·L-1，其次為環(huán)庚三烯，K值為26.55 μmol·L-1。其他10種寄主植物揮發(fā)物的結(jié)合能力從大到小依次為二甲基三硫醚、二甲基二硫醚、苯甲酸甲酯、2-己烯醛、二烯丙基硫醚、順-2-己烯-1-醇、己醛、1,3-二噻烷、二烯丙基二硫及月桂烯，K值范圍為31.01—116.29 μmol·L-1。

表2 GdauOBP20重組蛋白與所測配基的親和力

M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn) Protein molecular weight marker；1：未誘導(dǎo)對照組 Control group without induction；2—6：經(jīng)不同濃度IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)產(chǎn)物（0.1、0.5、0.8、1.0、1.5 mmol·L-1） Expressed products induced by different concentrations of IPTG；7：上清蛋白 Protein in bacterial supernatant；8：包涵體蛋白 Protein in bacterial inclusion；9：純化的GdauOBP20重組蛋白separated and purified recombinant protein GdauOBP20

圖4 GdauOBP20與1-NPN的結(jié)合分析（A、B）及與配基的熒光競爭結(jié)合（C、D）

3 討論

在前期研究中從沙蔥螢葉甲成蟲轉(zhuǎn)錄組中鑒定出29條OBP基因，半定量RT-PCR和qRT-PCR檢測結(jié)果表明，在觸角中高度表達(dá)，而在頭（去掉觸角）、胸、腹、足和翅等組織中不表達(dá)，推測其在沙蔥螢葉甲尋找寄主植物或配偶過程中起著重要作用[8]。本研究采用RACE技術(shù)克隆得到了的cDNA全長序列，并在原核表達(dá)系統(tǒng)中成功誘導(dǎo)表達(dá)出重組蛋白，為進(jìn)一步研究其功能打下了基礎(chǔ)。

筆者課題組采用頂空收集法和GC-MS技術(shù)從其最適寄主植物——沙蔥中鑒定出32種揮發(fā)性化合物（未發(fā)表），本研究從中選取13種主要化合物進(jìn)行了熒光競爭結(jié)合試驗。結(jié)果表明，GdauOBP20與4種有機硫化物均能結(jié)合，其中二烯丙基二硫（別名大蒜素）是沙蔥揮發(fā)物中含量最高的組分。這些硫化物具有強烈的刺激性氣味，也是蔥、蒜等百合科蔥屬植物的標(biāo)志性成分[25-27]。這一結(jié)果與沙蔥螢葉甲只取食沙蔥、多根蔥、野韭等百合科蔥屬植物相一致[6]。因此，GdauOBP20可能在沙蔥螢葉甲尋找寄主植物過程中起著重要作用。對二甲苯、環(huán)庚三烯和苯甲酸甲酯在濃度為100 μmol·L-1時，能將相對熒光強度降至15%，說明GdauOBP20與這3種環(huán)狀化合物均能較好地結(jié)合，推測該蛋白在結(jié)構(gòu)上可能更易于與環(huán)狀化合物相結(jié)合。GdauOBP20與月桂烯的結(jié)合能力較弱，解離常數(shù)為116.29 μmol·L-1，這一結(jié)果與二化螟（）Minus-C CsupOBP1的結(jié)合特性一致[28]，而B型煙粉虱（）BtabOBP8與月桂烯的結(jié)合能力較強，解離常數(shù)為21.53 μmol·L-1[29]，并且月桂烯對B型煙粉虱有吸引作用[30]。造成這一差異的原因可能是月桂烯為花香氣味物質(zhì)，廣泛存在于綠色開花植物中[29]，對B型煙粉虱等廣食性昆蟲具有引誘作用，而沙蔥螢葉甲和二化螟等寡食性昆蟲是以其寄主植物特異性揮發(fā)物作為尋找寄主的信號物質(zhì)。總體上看，GdOBP20對多數(shù)供試的主要寄主揮發(fā)物的結(jié)合能力不強，可能與供試的寄主揮發(fā)物種類較少有關(guān)，也可能是其本身結(jié)合能力較弱。因此，在今后的研究中應(yīng)增加寄主揮發(fā)物的種類，同時采用行為學(xué)試驗、EAG及RNAi等技術(shù)進(jìn)一步驗證GdauOBP20在寄主植物定位中的作用。

4 結(jié)論

沙蔥螢葉甲氣味結(jié)合蛋白GdauOBP20具有PBP-GOBP家族的典型結(jié)構(gòu)，屬于Minus-C OBP亞家族。該蛋白與其寄主植物的多種主要揮發(fā)性氣味物質(zhì)具有不同程度的結(jié)合能力，推測其在沙蔥螢葉甲對寄主植物的定位過程中可能發(fā)揮重要的作用。

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Molecular Cloning, Prokaryotic Expression and Binding Characterization of Odorant Binding Protein GdauOBP20 in

LI Ling, TAN Yao, ZHOU XiaoRong, PANG BaoPing

(Research Center for Grassland Entomology, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010020)

【】is a new pest with outbreak status in the Inner Mongolia grasslands in recent years. The objective of this study is to clone the full-length cDNA sequence of, and clarify the binding property of the recombinant protein to main host plant volatiles, which will lay a necessary foundation for revealing the molecular mechanism of olfaction in【】RACE technique was used to clone the full-length cDNA ofbased on the transcriptome database of. the physicochemical properties and structural characteristics of the encoded protein were predicted and analyzed by bioinformatics software. The recombinant protein GdauOBP20 was induced to express by constructing prokaryotic expression system, and purified by using the Ni-NTA Agarose affinity column. Finally, the fluorescence competitive assay was applied, and N-phenyl-1-naphthylamine (1-NPN) was selected as the fluorescence probe to measure the binding profiles of GdauOBP20 recombinant protein with 13 main host plant volatiles.【】The full-length cDNA ofis 567 bp (GenBank accession number: MK250532), with the non-coding regions of 5′ and 3′ ends of 24 bp and 123 bp, respectively, and a ployA tail structure. The open reading frame (ORF) is 420 bp, encoding 139 amino acids. The amino acid sequence of GdauOBP20 contains 4 conserved cysteine residues, indicating that it belongs to Minus-C OBP subfamily. The three-dimensional structure prediction of GdauOBP20 contains six alpha helix and two pairs of disulfide bonds formed by cysteine. The recombinant expression vector was successfully constructed, and the recombinant protein with high purity was obtained. The binding capacity of the recombinant protein GdauOBP20 to the fluorescence probe 1-NPN was strong with a binding constant of 12.8 μmol·L-1, indicating that it could be used as the fluorescence reporter in this experiment. Affinities of recombinant protein GdauOBP20 with 13 main host plant volatiles were tested. Among them, except diallyl trisulfide, other 12 volatiles showed certain binding capacities with the recombinant protein, and p-xylene and 1,3,5-cycloheptatriene displayed the strongest affinity with the dissociation constants of 22.91 and 26.55 μmol·L-1, respectively, whereas myrcene exhibited the weakest binding affinity with the dissociation constant of 116.29 μmol·L-1.【】GdauOBP20 has a certain binding capacity with main host plant volatiles, suggesting that it may play an important role in the localization of host plants.

; odorant binding protein; RACE cloning; prokaryotic expression; fluorescence competitive binding assay

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.20.020

2019-03-11；

2019-04-18

國家自然科學(xué)基金（31360441）

李玲，E-mail：279165876@qq.com。

龐保平，E-mail：pangbp@imau.edu.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）