高效液相體積排阻色譜法測(cè)定口蹄疫滅活疫苗146S抗原含量及疫苗質(zhì)量評(píng)估

朱元源，徐嫄，鄒興啟，楊延麗，劉麗麗，萬建青，李翠，徐璐，張乾義，夏應(yīng)菊，王兆，郎洪武，王琴，張松平，趙啟祖

高效液相體積排阻色譜法測(cè)定口蹄疫滅活疫苗146S抗原含量及疫苗質(zhì)量評(píng)估

朱元源1，徐嫄1，鄒興啟1，楊延麗2，劉麗麗2，萬建青1，李翠1，徐璐1，張乾義1，夏應(yīng)菊1，王兆1，郎洪武1，王琴1，張松平2，趙啟祖1

（1中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2中國科學(xué)院過程工程研究所/生化工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190）

口蹄疫疫苗質(zhì)量評(píng)價(jià)方法對(duì)疫苗生產(chǎn)企業(yè)和監(jiān)管部門進(jìn)行質(zhì)量控制尤為重要，146S抗原含量是評(píng)價(jià)口蹄疫疫苗質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)。蔗糖密度梯度離心法（sucrose density gradient centrifugation，SDGC）是公認(rèn)經(jīng)典的測(cè)定口蹄疫146S抗原含量的方法，但存在檢測(cè)耗時(shí)長、過程復(fù)雜、重復(fù)性差等缺點(diǎn)，影響了疫苗的質(zhì)量監(jiān)測(cè)?？谔阋邷缁钜呙?46S抗原含量高效液相體積排阻色譜法（size-exclusion high-performance liquid chromatography, SE-HPLC）是一種簡便、快速、自動(dòng)化程度高、高效的測(cè)定方法。【】在初步建立的采用SE-HPLC測(cè)定口蹄疫滅活疫苗146S抗原含量方法的基礎(chǔ)上，針對(duì)不同類型、不同濃縮純化生產(chǎn)工藝制備的口蹄疫滅活疫苗，進(jìn)一步確認(rèn)SE-HPLC法在檢測(cè)過程中的普適性勢(shì)在必行。利用口蹄疫146S抗原標(biāo)準(zhǔn)品建立SE-HPLC法標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程，用于檢測(cè)樣品的146S含量。采用SE-HPLC法和SDGC法分別檢測(cè)146S抗原標(biāo)準(zhǔn)品1倍、2倍、4倍、8倍、16倍稀釋的5個(gè)樣品和市場(chǎng)上隨機(jī)選取的22批疫苗， 計(jì)算146S抗原含量，對(duì)比分析兩種方法的相關(guān)性。用SE-HPLC法，3次重復(fù)檢測(cè)不同企業(yè)生產(chǎn)的134批口蹄疫滅活疫苗146S抗原含量，通過色譜圖特異性、檢測(cè)值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation ，RSD）分析SE-HPLC法的重復(fù)性，評(píng)價(jià)該方法的適用性，分析市場(chǎng)流通疫苗的總體質(zhì)量情況。SE-HPLC法建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，峰面積與146S抗原含量的線性關(guān)系良好（2=0.9981，=8）。口蹄疫146S抗原標(biāo)準(zhǔn)品5個(gè)稀釋樣品和22批口蹄疫疫苗的146S抗原含量檢測(cè)結(jié)果表明，口蹄疫146S抗原含量檢測(cè)SDGC法和SE-HPLC法高度正相關(guān)（R2=0.9994，S=5；R2= 0.9602，v=22）。134批口蹄疫滅活疫苗中，146S抗原含量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差5%的疫苗批次分別占疫苗總批次（134批）、單價(jià)苗總批次（18批）、雙組分及雙價(jià)苗總批次（76批）、三價(jià)苗總批次（40批）的81.34%、72.22%、85.53%、80.00%；146S抗原含量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤10%的疫苗批次占疫苗總批次（134批）的97.76%?？谔阋?46S抗原含量SE-HPLC法檢測(cè)重復(fù)性良好，其中疫苗146S抗原含量2—4μg·mL-1時(shí)，檢測(cè)重復(fù)性最好。所有批次疫苗均檢測(cè)到目的峰，目的峰的平均起峰、最高峰、落峰時(shí)間分別為SE-HPLC法進(jìn)樣后的11.58、12.90、14.93min，平均持續(xù)3.36min。134批口蹄疫滅活疫苗146S抗原含量為1.11—80.36μg·mL-1，其中單價(jià)苗、雙價(jià)苗、雙組分苗、三價(jià)苗146S抗原含量均值分別為2.07、2.40、2.85、13.14 μg·mL-1?？谔阋邷缁钜呙?46S 抗原含量SE-HPLC法適用性好、重復(fù)性高、高效、快速、簡便，能夠用于檢測(cè)不同類型的口蹄疫滅活疫苗，從而進(jìn)行疫苗的質(zhì)量監(jiān)測(cè)和評(píng)估。市場(chǎng)流通的口蹄疫滅活疫苗146S含量較高，疫苗質(zhì)量較好。

高效液相體積排阻色譜法；口蹄疫滅活疫苗；146S；疫苗質(zhì)量

0 引言

【研究意義】隨著我國口蹄疫疫苗懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)工藝的普及、濃縮純化技術(shù)的提高，以及疫苗質(zhì)量新標(biāo)準(zhǔn)的頒布，制造優(yōu)質(zhì)、高效口蹄疫疫苗已成為大勢(shì)所趨。國內(nèi)口蹄疫疫苗生產(chǎn)企業(yè)制備工藝不同，疫苗質(zhì)量良莠不齊，缺乏穩(wěn)定、可靠的疫苗質(zhì)量評(píng)價(jià)方法是主要原因之一，口蹄疫疫苗質(zhì)量的評(píng)價(jià)方法對(duì)生產(chǎn)企業(yè)、養(yǎng)殖戶以及疫苗監(jiān)管部門都具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】動(dòng)物攻毒試驗(yàn)是目前評(píng)價(jià)口蹄疫疫苗質(zhì)量的最重要的方法之一[1-4]。但該方法存在檢測(cè)周期長、成本高昂、陰性動(dòng)物難以獲得等缺點(diǎn)，難以用于疫苗質(zhì)量控制。因?yàn)榭谔阋卟《就暾《玖Ｗ?46S具有最強(qiáng)的免疫原性，是影響疫苗免疫效果的關(guān)鍵要素[5-6]，所以146S抗原含量的檢測(cè)是體外評(píng)價(jià)疫苗質(zhì)量的關(guān)鍵，是國際口蹄疫疫苗庫儲(chǔ)備抗原的重要指標(biāo)，也是大型疫苗生產(chǎn)企業(yè)除疫苗種毒免疫原性、內(nèi)毒素含量、雜質(zhì)蛋白含量外最受關(guān)注的指標(biāo)。蔗糖密度梯度離心法[7-9]是目前公認(rèn)傳統(tǒng)經(jīng)典的檢測(cè)口蹄疫146S抗原含量的方法，但該方法檢測(cè)過程復(fù)雜、不同單位檢測(cè)重復(fù)性差，且耗時(shí)、耗力，從而制約了技術(shù)的推廣。近十余年來，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所探索了不同的方法和策略評(píng)估口蹄疫疫苗質(zhì)量，包括免疫印跡，單抗夾心ELISA，超速離心、蔗糖密度梯度離心等方法，均不能滿足口蹄疫146S抗原含量檢測(cè)特異性、重復(fù)性、普適性等要求。為了解決口蹄疫146S定量檢測(cè)存在的問題，國內(nèi)外學(xué)者開發(fā)了其它定量測(cè)定口蹄疫病毒粒子的方法。有研究者通過制備級(jí)體積排阻色譜將口蹄疫疫苗中的146S與其它雜質(zhì)分離，采用紫外檢測(cè)器檢測(cè)其特征吸收峰，并經(jīng)過對(duì)比，證明體積排阻色譜檢測(cè)結(jié)果與蔗糖密度梯度離心具有一致性[10]。在此基礎(chǔ)上又發(fā)展出采用高效體積排阻色譜法測(cè)定146S抗原含量的技術(shù)，通過高效液相色譜系統(tǒng)及分析色譜柱可進(jìn)行自動(dòng)化、高通量、高靈敏度的測(cè)定[11]。經(jīng)過中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所的研究，該方法已初步應(yīng)用于市售口蹄疫滅活疫苗146S抗原含量的定量測(cè)定[12-13]。鑒于口蹄疫滅活疫苗生產(chǎn)工藝復(fù)雜，抗原或疫苗破乳水相中殘存的宿主細(xì)胞DNA等干擾物容易干擾SE-HPLC法目的峰的特異出現(xiàn)?？赏ㄟ^在抗原色譜分離前應(yīng)用核酸內(nèi)切酶進(jìn)行酶切處理，從而排除干擾，準(zhǔn)確測(cè)定[10-11]，拓寬該方法的適用性。但該方法對(duì)大規(guī)模疫苗樣本的檢測(cè)應(yīng)用效果未知，是否適用于國內(nèi)不同企業(yè)生產(chǎn)的不同類型疫苗的檢測(cè)也未知?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】利用SE-HPLC法和SDGC法分別檢測(cè)口蹄疫146S抗原標(biāo)準(zhǔn)品1、2、4、8、16倍稀釋的5個(gè)樣品和市場(chǎng)上隨機(jī)選取的22批疫苗， 計(jì)算146S抗原含量，對(duì)比分析兩種方法的相關(guān)性。采用改進(jìn)的SE-HPLC法，3次重復(fù)檢測(cè)不同企業(yè)生產(chǎn)的134批口蹄疫滅活疫苗146S抗原含量，驗(yàn)證該方法的重復(fù)性、普適性、特異性，并初步評(píng)價(jià)市售疫苗的質(zhì)量。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了口蹄疫146S抗原含量SE-HPLC法與蔗糖密度梯度離心法的高度相關(guān)性，制訂了國內(nèi)口蹄疫滅活疫苗146S抗原含量SE-HPLC法測(cè)定的操作規(guī)程，為使用該方法進(jìn)行檢測(cè)的操作人員及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析人員提供具體的技術(shù)指標(biāo)及參數(shù)，推動(dòng)了該方法在全國范圍的普及和應(yīng)用，為快速、高效、便捷的進(jìn)行口蹄疫滅活疫苗制備全過程監(jiān)管提供了技術(shù)策略，為開展口蹄疫滅活疫苗質(zhì)量評(píng)估提供路徑。

1 材料與方法

本試驗(yàn)于2018年4月至2019年4月在中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究室完成。

1.1 疫苗、有機(jī)試劑及酶

疫苗：口蹄疫滅活疫苗134批，包括單價(jià)苗18批，雙價(jià)苗及豬雙組分苗76批，三價(jià)苗40批。A型、Asia1型、O型PD50均大于10.05。有機(jī)試劑：正戊醇（北京化工公司）。酶：核酸酶Benzonase Nuclease（Novagen公司）。

1.2 色譜柱、色譜儀及色譜條件

色譜柱：基質(zhì)為親水修飾的硅膠基質(zhì)高效液相體積排阻色譜柱，孔徑45—50nm，TSKgel G4000SWXL （7.8 mm×30 cm）（TOSOH公司）；保護(hù)柱：TSKgel guard column SWXL（6.0 mm×4 cm）（TOSOH公司）。色譜儀：高效液相色譜儀L-2000 型（Hitachi 公司）；流動(dòng)相：pH 7.2—7.4的50 mmol·L-1磷酸緩沖液，含 0.1 mol·L-1Na2SO4，0.2μm濾膜過濾脫氣處理。色譜條件：高效液相色譜儀配備的紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長：259nm，流速：0.6mL·min-1，進(jìn)樣量：100μL，采集時(shí)間：30min。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

用pH 7.2—7.4的50 mmol·L-1磷酸緩沖液將濃度為60 μg·mL-1146S抗原標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行系列稀釋，HPLC進(jìn)樣檢測(cè)。采用系統(tǒng)自動(dòng)積分146S在259 nm下的峰面積，以峰面積為橫坐標(biāo)，相應(yīng)146S濃度為縱坐標(biāo)，在EXCEL程序中繪制線性趨勢(shì)線作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程應(yīng)達(dá)到2＞0.990。

1.4 疫苗破乳

分別吸取疫苗1 350 μL與正戊醇150 μL，至同一2 mL離心管中，充分振蕩使其破乳。4℃靜置1 h后3 000 r/min，4℃，離心10min，用注射器緩慢插入底部吸取底層水相，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，再3 000 r/min，4℃，離心10min，用注射器緩慢吸取下層清亮水相抗原200μL。

1.5 抗原水相處理

加入Benzonase酶 0.5μL，室溫下200r/min振蕩反應(yīng)1h后，3 000 r/min，4℃，離心10min，吸取150μL透明水相至色譜瓶，按照HPLC色譜條件HPLC進(jìn)樣檢測(cè)。

1.6 146S含量的計(jì)算

HPLC法檢測(cè)過程中，檢測(cè)樣品色譜圖中146S特征峰保留時(shí)間在11—16min。對(duì)259 nm下的146S峰面積積分，得檢測(cè)樣品146S峰面積，將峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，即得146S在每mL破乳水相中的濃度。由于疫苗制備是根據(jù)佐劑ISA 206與水相抗原質(zhì)量比1:1進(jìn)行乳化，根據(jù)二者密度計(jì)算，應(yīng)將測(cè)定結(jié)果乘以體積系數(shù)0.46，即得每mL油佐劑滅活疫苗中146S濃度（μg·mL-1）。

1.7 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）分析

每批疫苗樣品的146S抗原含量，采用SE-HPLC法進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.8 蔗糖密度梯度離心法（sucrose density gradient centrifugation，SDGC）

制備 15%—45%均勻線性蔗糖梯度，將破乳水相進(jìn)行蔗糖密度梯度超速離心，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD259nm值，根據(jù)公式計(jì)算 146S的含量[7]。

1.9 高效液相體積排阻色譜法與經(jīng)典方法蔗糖密度梯度離心法比對(duì)

將口蹄疫146S抗原標(biāo)準(zhǔn)品用磷酸緩沖液做1、2、4、8、16倍稀釋，對(duì)稀釋后的146S抗原標(biāo)準(zhǔn)品分別用146S抗原含量SE-HPLC法與SDGC法檢測(cè)。隨機(jī)選取22批疫苗，進(jìn)行146S抗原含量 HPLC法和SDGC法檢測(cè)。根據(jù)146S抗原含量檢測(cè)結(jié)果，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，驗(yàn)證146S抗原含量SE-HPLC法與SDGC法檢測(cè)的相關(guān)性、有效性和可行性。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及標(biāo)準(zhǔn)色譜峰

將146S 抗原標(biāo)準(zhǔn)品系列稀釋樣品的色譜峰面積與濃度進(jìn)行線性回歸處理，得到146S的回歸方程為：=64409- 80431，2=0.998，具有良好的線性關(guān)系（圖1）。146S抗原標(biāo)準(zhǔn)品在高效液相色譜儀中顯示出特征性色譜峰，146S 抗原出峰時(shí)間為11—16min，最高峰的保留時(shí)間為12.947min（圖2、3）。

2.2 口蹄疫滅活疫苗146S抗原含量SE-HPLC法與SDGC的檢測(cè)比對(duì)

2.2.1 口蹄疫146S抗原標(biāo)準(zhǔn)品兩種方法的比對(duì) 將口蹄疫146S抗原標(biāo)準(zhǔn)品用磷酸緩沖液做1、2、4、8、16倍稀釋，對(duì)稀釋后的146S抗原標(biāo)準(zhǔn)品分別用SE-HPLC法與SDGC法檢測(cè)（表1）。

圖1 口蹄疫滅活疫苗146S抗原定量分析標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 口蹄疫146S抗原標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)色譜圖

表1 口蹄疫146S抗原標(biāo)準(zhǔn)品SE-HPLC法與SDGC法檢測(cè)比對(duì)

圖3 口蹄疫146S抗原標(biāo)準(zhǔn)品原始濃度色譜圖

以口蹄疫146S抗原標(biāo)準(zhǔn)品SE-HPLC法測(cè)定的146S抗原含量為橫坐標(biāo)x，SDGC法測(cè)定的146S抗原含量為縱坐標(biāo)y，通過統(tǒng)計(jì)分析方法，得到線性回歸方程為：y=0.6401 x+ 0.4640，相關(guān)系數(shù)R2= 0.9994，P＜0.05（P=6.07E-06），T檢驗(yàn)差異顯著。2越接近1說明回歸線擬合程度越好，y與x相關(guān)程度越高。P＜0.05說明兩組數(shù)據(jù)差異顯著。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明：y與x線性關(guān)系顯著，高度正相關(guān)，即口蹄疫146S抗原標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)SDGC法和SE-HPLC法高度正相關(guān)。

2.2.2 22批口蹄疫滅活疫苗兩種方法的比對(duì) 隨機(jī)選取22批口蹄疫滅活疫苗，分別采用 SE-HPLC法與SDGC進(jìn)行146S抗原含量測(cè)定（表2）。以22批口蹄疫滅活疫苗SE-HPLC法測(cè)定的146S抗原含量為橫坐標(biāo)x，SDGC測(cè)定的146S抗原含量為縱坐標(biāo)y，通過統(tǒng)計(jì)分析方法，得到線性回歸方程為：=0.6019 x+0.4809，相關(guān)系數(shù)R2= 0.9602，P＜0.05（P=9.26E- 15），T檢驗(yàn)差異顯著。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明：y與x線性關(guān)系顯著，高度正相關(guān)，即口蹄疫滅活疫苗146S抗原檢測(cè)SDGC法和SE-HPLC法高度正相關(guān)。

表2 口蹄疫疫苗146S抗原含量檢測(cè)SE-HPLC法與SDGC比對(duì)

綜上所述，口蹄疫146S抗原含量SE-HPLC法和SDGC法高度正相關(guān)?？谔阋?46S抗原含量SE-HPLC法測(cè)定的146S抗原含量是SDGC法的1.02—2.10倍，146S抗原含量越高，差異越大；口蹄疫146S抗原含量SE-HPLC法重復(fù)性好。

2.3 SE-HPLC法檢測(cè)重復(fù)性及適用性

采用口蹄疫146S抗原含量SE-HPLC法檢測(cè)134批口蹄疫滅活疫苗，包括單價(jià)苗18批、雙組分苗及雙價(jià)苗76批、三價(jià)苗40批，每批疫苗進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)定，計(jì)算檢測(cè)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（表3）。采用核酸酶處理后再進(jìn)行SE-HPLC檢測(cè)的方法均能檢測(cè)到疫苗中完整的146S特征峰，表明該方法具有良好的適用性，對(duì)不同企業(yè)的不同類型疫苗均能進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)樣品通過SE-HPLC法3次重復(fù)性檢測(cè)分別得到3個(gè)146S含量數(shù)值（μg·mL-1），其中146S抗原含量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜5%的批次分別占疫苗總批次（134批）、單價(jià)苗總批次（18批）、雙組分及雙價(jià)苗總批次（76批）、三價(jià)苗總批次（40批）的為81.34%、72.22%、85.53%、80.00%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差10%的疫苗批次占疫苗總批次（134批）的97.76%。結(jié)果表明，口蹄疫146S抗原含量SE-HPLC法重復(fù)性高，其中三價(jià)苗、單價(jià)苗的檢測(cè)重復(fù)性高于雙組分苗及雙價(jià)苗的檢測(cè)重復(fù)性。

表3 口蹄疫滅活疫苗146S抗原含量SE-HPLC法檢測(cè)重復(fù)性分析

2.4 口蹄疫滅活疫苗146S抗原含量分析

根據(jù)以上分析，口蹄疫疫苗146S抗原含量SE-HPLC法具有重復(fù)性高、適用性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，可用于市售不同疫苗的質(zhì)量監(jiān)測(cè)。采用該方法對(duì)目前國內(nèi)市售的疫苗質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果見表4。134批口蹄疫滅活疫苗中，疫苗146S抗原含量（Y，μg·mL-1）均值Y＞2、Y＞4、Y＞6的疫苗批次分別占疫苗總批次的73.88%（99/134）、33.58%（45/134）、22.39%（30/134），146S抗原含量均值最低為1.11μg·mL-1，均值最高為80.36μg·mL-1。其中單價(jià)苗抗原146S含量（μg·mL-1）平均值Y＞2的疫苗批次占單價(jià)苗總批次的61.11%（11/18），雙組分苗抗原146S含量平均值Y＞4μg·mL-1的疫苗批次占雙組分苗總批次的23.08%（9/39），三價(jià)苗抗原含量146S平均值Y＞6μg·mL-1的疫苗批次占三價(jià)苗總批次的60.00%（24/40）。單價(jià)苗、雙價(jià)苗、雙組分苗、三價(jià)苗的146S抗原含量（μg·mL-1）均值為2.07、2.40、2.85、13.14，平均每個(gè)毒株的146S抗原含量（μg·mL-1）：三價(jià)苗＞單價(jià)苗＞雙組分苗＞雙價(jià)苗。疫苗146S抗原含量（Y，μg·mL-1）2≤Y≤4時(shí)，檢測(cè)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小，檢測(cè)重復(fù)性高。

2.5 口蹄疫滅活疫苗146S目的色譜峰特征性指標(biāo)

選取134批疫苗，共計(jì)檢測(cè)樣品402個(gè)，其目的色譜峰的平均起峰、最高峰、落峰時(shí)間為SE-HPLC進(jìn)樣后的11.58、12.90、14.93min，平均持續(xù)3.36min。疫苗樣品色譜峰的最早起峰、最早落峰時(shí)間為11、16min，目的色譜峰的持續(xù)時(shí)間為2.5—5min。

表4 口蹄疫滅活疫苗146S抗原含量及檢測(cè)分析

2.6 口蹄疫滅活疫苗的典型色譜曲線分析

疫苗破乳水相樣品，在色譜分離之前，應(yīng)用核酸內(nèi)切酶Benzonase進(jìn)行酶切處理，徹底進(jìn)行核酸酶消化，以排除宿主細(xì)胞DNA等的干擾，避免與146S目的峰交叉的干擾峰或異常峰出現(xiàn)。酶處理后（圖4）干擾物消除明顯，保證了目的峰的特異性（11—16 min）以及146S抗原含量檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

3 討論

口蹄疫病毒顆粒為球形，直徑為27—30nm，病毒粒子無囊膜，呈二十面體對(duì)稱的顆粒。其蛋白衣殼包裹基因組RNA組成完整病毒粒子，有60個(gè)VP1、VP2、VP3和VP4結(jié)構(gòu)蛋白分子組成，其中表面結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2和VP3立體結(jié)構(gòu)位于病毒粒子表面，VP4位于內(nèi)部[14]?？谔阋咄暾《玖Ｗ釉谡崽翘荻戎械南鄬?duì)沉降系數(shù)為146S，完整病毒顆粒146S或75S空衣殼在酸性、堿性或一定溫度條件下降解為12S和5S粒子，降解后的小分子無免疫原性[6,15-19]。因此口蹄疫滅活疫苗的質(zhì)量控制關(guān)鍵在于監(jiān)測(cè)完整病毒粒子146S而不受降解的12S的干擾，且SE-HPLC檢測(cè)方法本身不會(huì)導(dǎo)致不穩(wěn)定的146S發(fā)生損失。

過去30多年， Barteling開發(fā)的146S蔗糖密度梯度離心法提供了一個(gè)可靠的病毒濃度測(cè)定方法[7]。該方法將樣品上樣于均勻分布的15%—45%蔗糖密度梯度上層，然后進(jìn)行超速離心。但連續(xù)蔗糖密度梯度的制備需要純手工配制或用簡單的梯度混合器，后期紫外分光檢測(cè)過程和人為因素影響較大，整個(gè)操作過程關(guān)鍵環(huán)節(jié)多，造成樣品檢測(cè)重復(fù)性差、周期長、人力成本和運(yùn)行成本較高?？谔阋?46S高效液相體積排阻色譜法依據(jù)口蹄疫病毒粒子的物理性狀而建立，口蹄疫滅活疫苗生產(chǎn)過程中半成品及成品疫苗中病毒顆粒和其他紫外吸光分子大小差異顯著，不同分子組分進(jìn)入分子篩時(shí)，大分子不能進(jìn)入顆粒內(nèi)部，先于小分子被流動(dòng)相洗脫至柱外，各組分按照分子尺寸大小先后洗脫，起到分離和純化的作用。該方法由Spitteler等[11]于2011年首次建立，因其高效、快速、便捷等優(yōu)勢(shì)引起重視。阿根廷口蹄疫疫苗制造商BIOGENESIS-BAGO S.A.公司開發(fā)SE-HPLC法并用于口蹄疫疫苗生產(chǎn)和質(zhì)量控制，專利申請(qǐng)已在阿根廷、巴西、美國和中國歸檔[20-22]。中國科學(xué)院過程工程研究所率先在國內(nèi)開發(fā)該方法并驗(yàn)證[23-24]，目前與中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所聯(lián)合負(fù)責(zé)該方法的改進(jìn)和應(yīng)用[12-13]。SE-HPLC定量檢測(cè)146S和多角度激光散射定性檢測(cè)146S病毒顆粒大小配合，被推薦用于口蹄疫滅活疫苗中間產(chǎn)品和終產(chǎn)品檢測(cè)[10]。雖然口蹄疫146S抗原含量SE-HPLC法與SDGC法原理不同，但都是通過理化特性測(cè)定抗原含量。口蹄疫146S抗原標(biāo)準(zhǔn)品1倍、2倍、4倍、8倍、16倍稀釋的5個(gè)樣品和22批口蹄疫疫苗的146S抗原含量檢測(cè)結(jié)果表明，口蹄疫146S抗原含量檢測(cè)SDGC法和SE-HPLC法高度正相關(guān)（R= 0.9994，n=5；R=0.9602，n=22），22批口蹄疫疫苗146S抗原含量檢測(cè)SE-HPLC法檢測(cè)值均比SDGC法檢測(cè)值高（表1、2），差異顯著，前者測(cè)定的146S抗原含量是后者的1.02—2.10倍。

前表示加酶處理前；后表示加酶處理后

迄今我國有七家口蹄疫滅活疫苗生產(chǎn)企業(yè)，各企業(yè)均已實(shí)現(xiàn)懸浮培養(yǎng)技術(shù)制備抗原、超速離心和中空纖維柱等濃縮純化工藝進(jìn)行改進(jìn)，但詳細(xì)工藝不統(tǒng)一，由此制備的疫苗抗原中所含的穩(wěn)定劑、鹽離子等成分不同[25-28]，導(dǎo)致在大規(guī)模使用SE-HPLC方法時(shí)出現(xiàn)干擾峰（圖5-加酶處理前）。本研究所用的SE-HPLC方法已進(jìn)行過改進(jìn)和優(yōu)化（圖4-加酶處理后），制備的口蹄疫146S抗原標(biāo)準(zhǔn)品保證了檢驗(yàn)的一致性和準(zhǔn)確性。口蹄疫146S目的色譜峰特征性指標(biāo)的收集便于研究者或使用者在具體運(yùn)用該方法操作時(shí)參考執(zhí)行。134批市售口蹄疫滅活疫苗中，SE-HPLC法檢測(cè)的146S抗原含量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）RSD≤10%的疫苗批次占97.76%，檢測(cè)重復(fù)性好（表2）；疫苗146S含量2—4μg·mL-1時(shí)，檢測(cè)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差最?。ū?）；單價(jià)苗、雙價(jià)苗、雙組分苗、三價(jià)苗均成功采用SE-HPLC法進(jìn)行了檢測(cè)。以上結(jié)果表明該檢驗(yàn)方法具有普適性、重復(fù)性、一致性。

國家中長期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃(2012—2020年)中將我國部分地區(qū)列為口蹄疫免疫無疫區(qū)。制備和提供穩(wěn)定、優(yōu)質(zhì)、高效、純凈的口蹄疫疫苗成為防控該病和實(shí)現(xiàn)目標(biāo)的關(guān)鍵。在對(duì)SE-HPLC監(jiān)測(cè)的準(zhǔn)確性和適用性進(jìn)行檢驗(yàn)后，對(duì)134批口蹄疫滅活疫苗抗原146S含量進(jìn)行檢測(cè)。所有抽檢疫苗146S含量（Y，μg·mL-1）均值Y＞2占73.88%，說明口蹄疫疫苗總體質(zhì)量較好；所有類型疫苗包括單價(jià)苗、雙價(jià)苗、雙組分苗、三價(jià)苗的抗原146S含量μg·mL-1均值分別為2.07、2.40、2.85、13.14μg·mL-1，不同類型疫苗抗原濃度均高于2 μg·mL-1。根據(jù)口蹄疫滅活疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，成品疫苗大多規(guī)定每頭份口蹄疫146S抗原含量高于0.9μg·mL-1。臨床免疫時(shí)，牛每頭注射1—3mL，羊每頭份注射0.5—1mL，豬每頭份注射1—2mL，134批疫苗成品檢測(cè)結(jié)果顯示146S抗原含量符合相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求[29]。目前，我國口蹄疫疫苗檢驗(yàn)項(xiàng)目須按OIE標(biāo)準(zhǔn)增加純度檢驗(yàn)項(xiàng)目[1]，以便實(shí)現(xiàn)口蹄疫感染與免疫的鑒別診斷[30-33]，實(shí)現(xiàn) OIE口蹄疫無疫認(rèn)證的標(biāo)準(zhǔn)，這對(duì)口蹄疫滅活疫苗的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提出了更高要求?？谔阋咭呙?46S抗原含量SE-HPLC法具有簡便、高效、快速等特性，適用于口蹄疫疫苗生產(chǎn)企業(yè)全過程的質(zhì)量監(jiān)測(cè)和終產(chǎn)品檢測(cè)，有助于進(jìn)一步提升我國口蹄疫疫苗質(zhì)量，進(jìn)而推動(dòng)整個(gè)產(chǎn)業(yè)鏈水平的提高，為我國重大動(dòng)物疫病防控提供切實(shí)可行的技術(shù)支撐。

4 結(jié)論

4.1 口蹄疫滅活疫苗完整病毒粒子（146S）高效液相體積排阻色譜法是一種快速、高效、便捷的定量檢測(cè)有效抗原含量的方法，適于不同生產(chǎn)工藝制備的不同類型的口蹄疫滅活疫苗146S抗原含量測(cè)定。

4.2 不同生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的134批口蹄疫滅活疫苗，疫苗146S抗原含量全部符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，其中146S抗原含量大于2μg·mL-1的占73.88%，疫苗質(zhì)量普遍較高。

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Determination of 146S Antigen in Inactivated Foot-and-Mouth Disease Vaccine by Size-exclusion High-performance Liquid Chromatography and Quality Evaluation of Vaccine

ZHU YuanYuan1, XU Yuan1, ZOU XingQi1, YANG YanLi2, LIU LiLi2, WAN JianQing, LI Cui1, XU Lu1, ZHANG QianYi1, XIA YingJu1, WANG Zhao1, LANG HongWu1, WANG Qin1, ZHANG SongPing2, ZHAO QiZu1

（1China Institute of Veterinary Drug Control, Beijing 100081;2National Key Laboratory of Biochemical Engineering/Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190）

【】As vaccine manufacturers and regulatory departments, the quality evaluation method of foot-and-mouth disease (FMD) vaccine is particularly important in quality control, where the 146S antigen is the key index. For the quantification of 146S antigen in FMD vaccine, sucrose gradient density centrifugation (SGDC) is recognized as a classical method but the process is complex, time-consuming and poorly repeatable, which affect the quality monitor of vaccines. Size-exclusion high-performance liquid chromatography (SE-HPLC) is previously reported as a simple, rapid, highly automated and efficient technology for analysis of 146S content. 【】A method of 146S antigen determination in inactivated FMD vaccine by SE-HPLC has been preliminarily established. However, the applicability, repeatability and effectiveness of this method are unknown in the FMD vaccines produced by different manufacturers with different concentration and purification processes. Hence, it is imperative to confirm the universality of the SE-HPLC method.【】Here, the standard curve and regression equation of SE-HPLC method were established with FMD 146S antigen standard, which were used for 146S antigen detection of samples. Moreover, using five samples with 1, 2, 4, 8 and 16 times dilution of 146S antigen standard and 22 batches of vaccine randomly selected in the market, the 146S antigen was detected by SE-HPLC and SDGC respectively, and the correlation between the two methods was analyzed. Further, 134 batches of inactivated FMD vaccines products from different manufacturers in the market were detected three times each for 146S content by SE-HPLC. By analysis of chromatogram specificity of SE-HPLC method and relative standard deviation of 146S content, we confirmed its repeatability and reliability in evaluating all types of vaccine. Finally, 146s content was operated for the quality of FMD vaccines in the market. 【】The standard curve of SE-HPLC method showed good linearity between peak area and concentration of FMD 146S antigen standard (2=0.9981,=8).The detection results of 146S content in 5 diluted 146S antigen standards and 22 batches of FMD vaccine demonstrated that there was a highly positive correlation between SDGC and SE-HPLC methods (R2=0.9994,S=5;R2= 0.9602,v=22). Among 134 batches of vaccines, the vaccine batches with 146S content relative standard deviation RSD＜5% accounted for 81.34%, 72.22%, 85.53% and 80.00% of the total vaccine batches (134 batches), total monovalent vaccine batches (18 batches), total bicomponent and bivalent vaccine batches (76 batches) and total trivalent vaccine batches (40 batches), respectively. The vaccine batches with 146S content RSD≤10% accounted for 97.76% of the total vaccine batches (134 batches). The SE-HPLC method for detection 146S content in FMD vaccines performed good repeatability, and best repeatability appeared in 2-4μg·mL-1146S content of the vaccines. Target peaks could be detected in all batches of vaccine, the average peak starting time, peak and peak falling time of objective chromatographic peaks were 11.58 min, 12.90 min and 14.93 min after HPLC sampling. The average retention of peak was 3.36min. The average 146S content was 1.11-80.36μg·mL-1in all vaccines, 2.07 μg·mL-1in monovalent vaccines, 2.40 μg·mL-1in bivalent vaccines, 2.85 μg·mL-1in bicomponent vaccines and 13.14 μg·mL-1in trivalent vaccines respectively.【】These results provided proof that SE-HPLC assay was universal, highly repeatable, reliable, rapid and simple for detection 146S content in various types of current inactivated FMD vaccines in the market, which could be used to monitor and evaluate the quality of the vaccine. FMD vaccines in the market had high 146S content and good vaccine quality.

size-exclusion high-performance liquid chromatography; inactivated foot-and-mouth disease vaccine; 146S; quality of the vaccine

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.20.019

2019-01-28；

2019-05-08

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃資助（2018YFC1200501），國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃資助（2016YFD0501500）

朱元源，E-mail：zhuyuanyzz@163.com。

趙啟祖，E-mail：zhaoqizu@163.com

（責(zé)任編輯 林鑒非）