實(shí)時(shí)熒光PCR的探針熔解曲線分析與質(zhì)譜分析應(yīng)用于耳聾基因診斷的對(duì)比研究

王格

(珠海市婦幼保健院 廣東 珠海 519000）

先天性耳聾是由多種環(huán)境和/或遺傳因素共同作用導(dǎo)致，也可由單一基因或不同基因的復(fù)合突變所導(dǎo)致，在新生兒期的發(fā)病率約為1‰～1.86‰[1]。目前針對(duì)基因檢測(cè)的方法主要有質(zhì)譜分析技術(shù)（MALDI-TOF-MS）[6]、基因測(cè)序技術(shù)[2]、反向點(diǎn)雜交技術(shù)和熔解曲線技術(shù)。實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)的探針熔解曲線分析法(Probe melting curve analysis，PMCA)，臨床應(yīng)用日趨廣泛，能夠在一次擴(kuò)增之后通過(guò)檢測(cè)PCR產(chǎn)物多色熒光熔解曲線就可鑒定多種突變。本研究以DNA測(cè)序技術(shù)為金標(biāo)準(zhǔn)，比較PMCA和質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)突變耳聾基因的性能，評(píng)價(jià)其作為常規(guī)檢測(cè)耳聾基因技術(shù)的可行性。

1.資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年1月－4月在珠海市婦幼保健院出生，經(jīng)MALDITOF-MS技術(shù)診斷為耳聾基因攜帶者的嬰兒臍帶血標(biāo)本92份和正常標(biāo)本4份，本研究得到珠海市婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受檢者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本處理 上述臍帶血標(biāo)本均采用乙二胺四乙酸三鉀(EDTA—K2)抗凝，采用致善快速DNA提取儀抽提人類白細(xì)胞基因組DNA，采用紫外分光儀于260、280 nm處測(cè)定吸光度(A)值，以鑒定所抽提DNA的質(zhì)量并計(jì)算其濃度，保證所抽提的DNA符合質(zhì)量要求，使用時(shí)稀釋至20 ng/ul。

1.2.2 耳聾基因的檢測(cè) PCR的探針熔解曲線分析試劑盒由廈門(mén)致善生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。檢測(cè)位點(diǎn)包括中國(guó)人群常見(jiàn)4個(gè)耳聾基因的20種基因突變，分別為GJB2：c.35delG，c.167delT，c.176-191del16bP，c.235delC，c.299-300delAT；GJB3：c.538C＞T，c.547G＞A；mtDNA：m.1494C＞T，m.1555A＞G；SLC26A4：c.749T＞C；c.754T＞C，c.919-2A＞G，c.1174A＞T，c.1226G＞A，c.1229C＞T，c.1707+5G＞A，c.1975G＞C，c.2017T＞A，c.2162C＞T，c.2168A＞G。20種突變分為A、B、C、D四管進(jìn)行。檢測(cè)過(guò)程如下：先將泡罩包裝的耳聾檢測(cè)PCR 反應(yīng)管A/B/C/D從試劑盒取出，瞬時(shí)離心，然后將預(yù)先稀釋好的待測(cè)DNA標(biāo)本25ul直接加到含PCR反應(yīng)液粉末的A/B/C/D四管中，蓋嚴(yán)管蓋后于渦旋振蕩器中充分振蕩混勻20s，短暫離心后，轉(zhuǎn)移至SLAN-96上進(jìn)行PCR擴(kuò)增及熔解曲線分析。然后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)所采集的熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.3 檢測(cè)結(jié)果不一致樣本的測(cè)序 檢測(cè)結(jié)果不一致樣本外送華大基因進(jìn)行測(cè)序分析。

2.結(jié)果

2.1 耳聾基因檢測(cè)方法的比較

96例患者經(jīng)兩種方法進(jìn)行耳聾基因的檢測(cè)，其中94例檢測(cè)結(jié)果相同，分別為90例具有耳聾基因突變的患者和4例無(wú)耳聾基因突變患者。2例患者耳聾基因檢測(cè)結(jié)果不同。具體見(jiàn)表。

表 96例患者耳聾基因檢測(cè)結(jié)果

2.2 兩種檢測(cè)方法差異樣本的分析

對(duì)2例檢測(cè)結(jié)果不同的樣本進(jìn)行了測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)都具有SLC26A4：281C＞T的突變，而熔解曲線法檢測(cè)的耳聾基因沒(méi)有包括該位點(diǎn)。

3.討論

我國(guó)新生兒聽(tīng)力篩查陽(yáng)性率為1‰，而14歲以下兒童的耳聾患病率約為3.5‰，其中每年約有2.4萬(wàn)遺傳性耳聾兒童不能通過(guò)新生兒聽(tīng)力篩查檢測(cè)出來(lái)[2]。MALDI-TOF-MS作為常用的新生兒耳聾基因的篩查方法，具有高通量?jī)?yōu)點(diǎn)，但高昂的設(shè)備和試劑費(fèi)用以及適合大批量檢測(cè)，嚴(yán)重限制了該技術(shù)的普及，基本都是外送第三方檢測(cè)公司，時(shí)效性不足。熔解曲線法具有簡(jiǎn)單快速的特點(diǎn)，而且對(duì)設(shè)備與場(chǎng)地要求相對(duì)較低，醫(yī)療機(jī)構(gòu)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室即可開(kāi)展，具有巨大的應(yīng)用潛力。

我們選取了2017年1月－4月96例樣本，其中90例經(jīng)MALDI-TOF-MS檢測(cè)為陽(yáng)性，采用熔解曲線法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示突變位點(diǎn)相同。4例樣本經(jīng)MALDI-TOF-MS檢測(cè)為陰性，熔解曲線法檢測(cè)也為陰性。有2例樣本MALDI-TOF-MS檢測(cè)為陽(yáng)性，熔解曲線法檢測(cè)為陰性，將該樣本進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)兩例皆存在SLC26A4：281C＞T位點(diǎn)的雜合突變，而熔解曲線法耳聾基因檢測(cè)沒(méi)有包括該位點(diǎn)。兩種檢測(cè)方法只有兩個(gè)耳聾基因檢測(cè)位點(diǎn)不同，都位于SLC26A4區(qū)域，MALDI-TOF-MS為281C＞T,589G＞A,熔解曲線法為749T＞C,754T＞C，國(guó)內(nèi)對(duì)新生兒281C＞T,589G＞A位點(diǎn)的突變進(jìn)行了一定的篩查，藍(lán)培基[3]對(duì)廣東省韶關(guān)市328例新生兒進(jìn)行耳聾基因檢測(cè)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)281和589位點(diǎn)的基因突變，李振安[4]對(duì)40672例佛山市新生兒進(jìn)行耳聾基因篩查，發(fā)現(xiàn)281C＞T,589G＞A雜合突變各2例。唐燕青[5]對(duì)21386例廣西新生兒進(jìn)行耳聾基因篩查，發(fā)現(xiàn)589G＞A雜合突變2例，281C＞T雜合突變1例。在前期研究中，我們對(duì)珠海9775例新生兒進(jìn)行耳聾篩查，發(fā)現(xiàn)了2例589G＞A雜合突變，沒(méi)有存在281C＞T的突變[6]。PU Dai[7]等人在205例非綜合征型感音神經(jīng)性聽(tīng)力受損而顳骨無(wú)異?；純褐袡z測(cè)出一例749T＞C突變,H-J Parkde[8]等人在86例耳聾患兒在檢測(cè)出1例754T＞C的突變。檢測(cè)結(jié)果顯示在新生兒耳聾基因檢測(cè)方面上述兩種方法具有良好的一致性。但該研究還存在著以下幾個(gè)方面的不足：（1）陰性樣本數(shù)量不足；（2）兩種檢查方法中4個(gè)耳聾基因18個(gè)相同的熱點(diǎn)突變位點(diǎn)只評(píng)估了13個(gè)；（3）需進(jìn)行多重突變的評(píng)估。

綜上所述，熔解曲線法與MALDI-TOF-MS在檢測(cè)新生兒耳聾基因方面具有良好的一致性，可以替代MALDI-TOF-MS，值得在臨床推廣應(yīng)用，可以促進(jìn)遺傳性耳聾患者的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早干預(yù)，對(duì)該病的防控，提高出生人口素質(zhì)具有重要的意義。