MTA及iRoot BP Plus對人牙髓干細(xì)胞增殖活性的影響

俞琪 鄧淑麗

【摘 ?要】 目的：研究并比較MTA及iRoot BP Plus對人牙髓干細(xì)胞（human dental pulp stem cells， hDPSCs）增殖活性的影響。方法：將MTA及iRoot BP Plus制備成濃度稀釋比例為0、0.001、0.01、0.1、0.2、1的條件浸取液，檢測培養(yǎng)1、3、7天時細(xì)胞的增殖活性及3、7天時的堿性磷酸酶（alkaline phosphatase， AKP）表達(dá)量。結(jié)果：使用不同濃度的MTA及iRoot BP Plus浸取液培養(yǎng)hDPSCs時，隨著培養(yǎng)時間的增加，細(xì)胞數(shù)量顯著增多（p <0.05）。但高濃度（稀釋比例為1）MTA浸取液存在明顯的細(xì)胞毒性作用。在相同培養(yǎng)時間下，iRoot BP Plus比相同稀釋比例的MTA更能促進(jìn)hDPSCs的增殖且高濃度培養(yǎng)無細(xì)胞毒性。使用不同濃度的MTA及iRoot BP Plus浸取液培養(yǎng)hDPSCs時，隨著培養(yǎng)時間的增加，AKP表達(dá)量顯著增高（p <0.05）。但在高濃度iRoot BP Plus組中，hDPSCs的AKP表達(dá)量隨時間明顯下降。在相同濃度下，iRoot BP Plus組的第3天AKP表達(dá)量普遍高于MTA組;但低濃度（稀釋比例0.001）AKP表達(dá)量低于MTA組（p <0.05）。在低濃度下（比例為0.001及0.01），iRoot BP Plus組第7天的AKP表達(dá)量普遍高于MTA組（p <0.05）;但高濃度（比例為0.1、0.2和1）的AKP水平低于MTA組（p <0.05）。結(jié)論： MTA對hDPSCs的促礦化能力較強(qiáng)，但高濃度下存在一定的細(xì)胞毒性作用。iRoot BP Plus相較MTA具有更好的生物相容性，不會抑制hDPSCs增殖分化。但兩者均對細(xì)胞的AKP表達(dá)量具有一定的抑制作用，且隨著培養(yǎng)時間的增加，高濃度時iRoot BP Plus的抑制作用更為顯著。

【關(guān)鍵詞】牙髓干細(xì)胞;MTA;iRoot BP Plus;堿性磷酸酶;細(xì)胞活性

【中圖分類號】R181.3+2 ??【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A???【文章編號】1004-7484（2019）10-0184-03

牙髓干細(xì)胞（Dental Pulp Stem Cells，DPSCs）是位于牙髓內(nèi)的成體干細(xì)胞，由神經(jīng)嵴發(fā)育而來[1，2]。DPSCs廣泛存在于成熟及年輕恒牙根尖底部，可以定植在根管壁上，進(jìn)而分化為成骨細(xì)胞，能形成牙本質(zhì)- 牙髓樣結(jié)構(gòu)，在牙髓再生術(shù)中發(fā)揮著重要作用[3，4]。

生物陶瓷材料MTA（Mineral Trioxide Aggregate）及iRoot BP plus作為新興的髓腔修補(bǔ)及蓋髓材料，相較傳統(tǒng)修復(fù)材料具有更好的生物相容性、穩(wěn)定性、抗菌性和細(xì)胞安全性。MTA可誘導(dǎo)細(xì)胞成骨、硬組織形成[5-7]，但同時也存在著操作不便、著色等問題[8]。iRoot BP plus相較MTA具備更好的生物相容性和促進(jìn)牙本質(zhì)形成鈣化橋的能力[8，9]，且無著色問題。

本實(shí)驗(yàn)擬探討iRoot BP Plus相較MTA對hDPSC的增殖及促成骨能力的影響，以期為臨床決策作一定的參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?實(shí)驗(yàn)材料 PROROOT MTA （Dentsply，美國），iRoot BP Plus （Innovative Bioceramic Inc. 加拿大）;CCK-8試劑盒（BestBio，中國），堿性磷酸酶測試盒（南京建成生物）

1.1 ?DPSCs的分離、提純和鑒定 選取在浙江大學(xué)附屬口腔醫(yī)院12～24歲的患者，因正畸或阻生拔除的完整恒牙（無牙周及牙體疾病）。拔除前后牙齒表面充分消毒，置入4℃含青霉素及鏈霉素的磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）中轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行取樣（所有操作均經(jīng)患者及其監(jiān)護(hù)人同意）。分離牙冠后用改良組織塊酶消化法[10]行原代培養(yǎng)，培養(yǎng)至P3代備用，并進(jìn)行成脂成骨誘導(dǎo)能力的鑒定。

1.2 材料浸取液的制備 MTA及iRoot BP Plus調(diào)拌后37℃硬化48h后取出，5ml 含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)液浸取培養(yǎng)48h后過濾，制備成不稀釋、1：5、1：10、1：100及1：1000比例稀釋的條件浸取液備用。

1.3 ?CCK-8測定不同濃度MTA及iRoot BP Plus對hDPSCs細(xì)胞增殖活性的影響 取生長良好的P3代hDPSCs，充分消化計(jì)數(shù)后以每孔50個細(xì)胞接種，培養(yǎng)24h后換成上述不同稀釋比例的MTA及iRoot BP的浸取培養(yǎng)液。10%FBS的α-MEM培養(yǎng)液作陰性對照，隔天換液。分別在培養(yǎng)1d、3d、7d時用酶標(biāo)儀于450nm處測量吸光值。

1.4 不同濃度MTA及iRoot BP Plus對hDPSCs堿性磷酸酶表達(dá)量的影響 ?取生長良好的P3代hDPSCs，充分消化計(jì)數(shù)后以105 /ml接種，培養(yǎng)24h后更換不同濃度的MTA及iRoot BP培養(yǎng)基。10% α-MEM培養(yǎng)液作對照，隔天換液。分別在培養(yǎng)3d、7d時酶標(biāo)儀于520nm處測量吸光值，562nm處測定蛋白含量，校準(zhǔn)AKP測定值誤差。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 所測數(shù)據(jù)用SPSS 24.0（IBM） 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果用±s表示，計(jì)數(shù)資料使用單因素方差分析和t檢驗(yàn)。使用Graphpad Prism 5 繪制統(tǒng)計(jì)圖。p <0.05視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度MTA及iRoot BP Plus對hDPSCs細(xì)胞增殖活性的影響

不同濃度的MTA及iRoot BP Plus條件浸取液培養(yǎng)hDPSCs，隨著培養(yǎng)時間的增加，細(xì)胞數(shù)量顯著增高（p <0.05）。未經(jīng)稀釋的MTA浸取液（比例為1）在培養(yǎng)7天后對細(xì)胞活性存在明顯的抑制作用（p <0.05）（圖1.1A）。不同培養(yǎng)時間，iRoot BP Plus對細(xì)胞增殖活性的影響存在一濃度依賴的正態(tài)分布曲線，且當(dāng)比例為0.1～0.2時對hDPSCs的促進(jìn)作用最強(qiáng)（圖1.1B）。

在相同培養(yǎng)時間下，iRoot BP Plus比相同比例的MTA更能促進(jìn)hDPSCs的增殖，且長時間培養(yǎng)時，在高濃度區(qū)段（稀釋比例為0.1/0.2/1）未產(chǎn)生細(xì)胞抑制（p<0.05）（圖1.2）

2.2 不同濃度MTA及iRoot BP Plus對hDPSCs堿性磷酸酶表達(dá)量的影響 ?不同濃度的MTA及iRoot BP Plus條件浸取液處理hDPSCs，隨著培養(yǎng)時間的增長，AKP表達(dá)量顯著升高（p<0.05）（圖2.1）。

培養(yǎng)3天后，稀釋比例為0.001的MTA組AKP表達(dá)量高于對照組，其余組低于對照組（p<0.05），且隨著濃度的增加，表達(dá)量越低;iRoot BP Plus組不同濃度浸取液對hDPSCs的AKP表達(dá)量影響較對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖2.2A）。培養(yǎng)7天后，MTA組稀釋比例為0.001及1時， AKP表達(dá)量顯著低于對照組（p <0.05），其余組較對照組無差異（圖2.2B）;iRoot BP Plus組的AKP表達(dá)量較對照組顯著下降（p<0.05）且在高濃度區(qū)段（0.1/0.2/1），隨著濃度的增加，AKP表達(dá)量越少。但比例為0.01的處理組， hDPSCs的AKP表達(dá)隨時間增加（p<0.05）。

相同稀釋比例的浸取液培養(yǎng)hDPSCs，培養(yǎng)3天時，iRoot BP Plus組AKP表達(dá)量普遍高于MTA組，但稀釋比例為0.001時，表達(dá)量低于MTA組（p<0.05）（圖2.2A）。培養(yǎng)7天后，低濃度（0.001/0.01）的iRoot BP Plus組AKP表達(dá)量普遍高于MTA組，僅0.01組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;高濃度（0.1/0.2/1），表達(dá)量較低（圖2.2B）。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中，相同稀釋比例的iRoot BP Plus比MTA更能促進(jìn)細(xì)胞增殖，且高濃度時未出現(xiàn)細(xì)胞抑制。該結(jié)果表明iRoot BP Plus不會抑制細(xì)胞生長或增殖，且其生物相容性優(yōu)于MTA。類似研究[12]將hDPSCs分別接種于MTA、iRoot BP Plus上，MTA存在明顯的細(xì)胞毒性，而iRoot BP Plus在培養(yǎng)早期顯著增加細(xì)胞活性，但隨著培養(yǎng)時間增長，其細(xì)胞增殖活性下降。Zhang[13]等比較了MTA和iRoot BP Plus的體內(nèi)外生物學(xué)活性，發(fā)現(xiàn)iRoot BP Plus相較MTA能組裝更多羥基磷灰石，且可濃度依賴性促進(jìn)牙髓干細(xì)胞的黏附及遷移，牙本質(zhì)橋形成及牙源性蛋白（DSP/DMP1）及黏附相關(guān)分子（Vincullin/p-Paxillin）的表達(dá)。而Samyuktha[14]等的研究卻發(fā)現(xiàn)iRoot BP 處理人成骨細(xì)胞及牙周膜細(xì)胞后，細(xì)胞毒性高于MTA。 MTA內(nèi)含三氧化二鉍，對細(xì)胞毒性影響較大[15]。其機(jī)制在于鉍類化合物可直接作用DNA，下調(diào)Bcl-2等蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]。iRoot BP Plus用氧化鉭及氧化鋯代替三氧化二鉍，因此無細(xì)胞毒性。

AKP參與硬組織的礦化和形成，是檢測細(xì)胞成骨分化的早期指標(biāo)之一[17]。本實(shí)驗(yàn)中，低濃度（稀釋比例為0.001～0.1）的MTA及iRoot BP Plus均能促進(jìn)hDPSCs的AKP表達(dá)，表明iRoot BP Plus和MTA均有一定的促礦化作用。有研究表明[18，19]，MTA可通過NF-κB、ERK/p38通路誘導(dǎo)根尖牙乳頭干細(xì)胞成牙及成骨分化。培養(yǎng)7天后，MTA及iRoot BP Plus中多組濃度的AKP表達(dá)量出現(xiàn)明顯下降。這可能與細(xì)胞數(shù)量增多有關(guān)。鏡下觀察到細(xì)胞呈堆疊狀生長，無法有效接觸培養(yǎng)液，因此影響了生長代謝。加上高濃度MTA的細(xì)胞毒性作用，細(xì)胞數(shù)量明顯下降，AKP代謝減少。高濃度MTA組的AKP表達(dá)量高于iRoot BP Plus組可能因?yàn)楦邼舛萯Root BP Plus雖會促進(jìn)細(xì)胞增殖，但也會抑制胞內(nèi)AKP代謝，這與一些研究結(jié)果類似。Dedeus G[20]等研究推測iRoot BP對細(xì)胞代謝水平的影響高于其對細(xì)胞密度層面的影響。Modareszadeh M R[21]等發(fā)現(xiàn)在不同培養(yǎng)時間下，iRoot BP Plus顯著降低細(xì)胞AKP水平。

材料塊及條件浸取液的制備過程可能是導(dǎo)致不同研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在偏差的原因。Hakki[22]利用MTA的上清液研究其對成牙骨質(zhì)細(xì)胞的作用，這一方法使得材料的濃度得以量化。而iRoot BP Plus作為預(yù)調(diào)膏劑可直接使用，兩者雖浸取比例相同，但其真實(shí)濃度無法完全一致。在濕潤環(huán)境下，iRoot BP Plus其內(nèi)的硅酸鈣可以水解生成硅酸鈣水合物凝膠及氫氧化鈣，后者與磷酸鹽反應(yīng)生成羥基磷灰石和水，水又可繼續(xù)參與反應(yīng)[23]。相較于根管內(nèi)環(huán)境，本實(shí)驗(yàn)的iRoot BP Plus材料塊固化過程中只有一底面接觸濕潤環(huán)境，其余面濕化不足，材料塊內(nèi)、外表面的固化程度存在差異[24]，造成浸取液濃度誤差。另外iRoot BP Plus材料塊在48h后體積膨脹明顯，增加了其浸取表面積/浸取液體積比值，使浸取液濃度增高。Walsh RM[25]等研究結(jié)果證實(shí)了iRoot BP固化過程中的體積膨脹。而MTA固化后因水分蒸發(fā)，會出現(xiàn)一定的體積收縮，浸取表面積減小，使浸取濃度偏低。

4 結(jié)論

MTA對hDPSCs的促礦化能力較強(qiáng)，但高濃度下存在一定的細(xì)胞毒性作用。iRoot BP Plus相較MTA具有更好的生物相容性，不會抑制hDPSCs增殖分化。但兩者均對細(xì)胞的AKP表達(dá)量具有一定的抑制作用，且隨著培養(yǎng)時間的增加，高濃度時iRoot BP Plus的抑制作用更為顯著。

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浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目（基金號：2016KYA118）