T-SPOT.TB在肺結(jié)核早期抗癆治療有效過程中的變化趨勢研究

李曉非，劉紅偉，羅風(fēng)，邱萬

中國為結(jié)核病高流行國家［1］，2017年全球新發(fā)結(jié)核病患者約1 000萬例，我國新發(fā)結(jié)核病患者88.9萬，結(jié)核病疫情嚴(yán)峻［2-3］。控制肺結(jié)核的關(guān)鍵是探索出精準(zhǔn)有效的結(jié)核病診斷及治療監(jiān)測新方法［4-5］。但是當(dāng)前臨床上尚無針對抗癆治療效果快速準(zhǔn)確的評估手段，僅僅通過觀察患者的臨床表現(xiàn)及輔助檢查結(jié)果來推斷治療是否有效，特異度及敏感度均較低［6-7］。因此，探索可快速、特異、正確地反映肺結(jié)核抗癆療效的方法已迫在眉睫。結(jié)核感染T細(xì)胞斑點試驗（T-cell spot of Tuberculosis，T-SPOT.TB）是根據(jù)酶聯(lián)免疫斑點法（enzyme-linked immunospot test，ELISPOT）的原理直接檢測并計數(shù)人新鮮外周血中釋放γ-干擾素的結(jié)核特異性抗原［早期分泌靶向抗原 6（earlysecreting antigen target-6，ESAT-6）、培養(yǎng)濾液蛋白10（culture filtrate protein-10，CFP-10）］刺激活化效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量的方法，在結(jié)核病診斷方面有較高的價值［8-10］。有研究顯示，隨著抗癆治療進(jìn)行，機(jī)體結(jié)核分枝桿菌數(shù)量降低，患者細(xì)胞免疫（抗原特異性免疫）應(yīng)答狀態(tài)隨之改變，繼而可能出現(xiàn)結(jié)核特異性活化效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量的不斷減少，即TSPOT.TB結(jié)果的降低，提示T-SPOT.TB有望成為監(jiān)測肺結(jié)核患者早期抗癆治療效果的指標(biāo)［7，11-13］。目前，國內(nèi)偶有關(guān)于T-SPOT.TB監(jiān)測肺結(jié)核治療效果的報道，且各家研究結(jié)果并不完全一致［6-7，14］?；谝陨蠁栴}，本研究通過分析肺結(jié)核患者抗癆治療前后T-SPOT.TB結(jié)果動態(tài)變化趨勢及機(jī)體對結(jié)核特異性抗原（ESAT-6、CFP-10）刺激免疫應(yīng)答水平的變化，探討T-SPOT.TB在肺結(jié)核早期抗癆治療有效過程中的變化趨勢，以期為臨床肺結(jié)核抗癆療效評估，探索出切實有效的實驗室監(jiān)測指標(biāo)。

1 對象與方法

1.1研究對象 選擇2016年6月—2019年2月在我院結(jié)核科明確診斷為初治活動性肺結(jié)核患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)-肺結(jié)核診斷（WS 288-2017）［15］。（2）依據(jù)《結(jié)核病治療指南》進(jìn)行規(guī)范化抗結(jié)核治療［16-17］。（3）初診及隨訪均在我院做T-SPOT.TB檢測。（4）經(jīng)規(guī)范化抗癆治療，依據(jù)臨床表現(xiàn)及輔助檢查判斷為治療有效者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）來我院就診前已經(jīng)接受過抗結(jié)核治療。（2）隨訪未成功。（3）患有艾滋病、病毒性肝炎、腫瘤等其他疾病導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)受影響者。依據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)，最終納入研究對象50例，男、女各25例，年齡17～65歲，中位年齡27歲。本研究獲昆明市第三人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并與患者簽署知情同意書。

1.2主要材料 T-SPOT.TB試劑盒、溫控水平離心機(jī)（18～25℃，離心力≥1 800×g）。RPMI-1640培養(yǎng)基（江蘇長星公司）、緩沖液（天津灝洋華科公司）、人外周血淋巴細(xì)胞分離液（天津灝洋華科公司）、顯微鏡（奧林巴斯CX-31）、生物安全柜（青島海爾公司）。

1.3試驗方法

1.3.1標(biāo)本采集 收集患者抗結(jié)核治療前、治療后（30 d、1個月、3個月）血液標(biāo)本，同時對患者歷次就診時的臨床表現(xiàn)做好詳細(xì)記錄。用無菌注射器抽取外周靜脈血5～8 mL至加有肝素鈉的真空采血管中，室溫（18～25℃）保存，4 h內(nèi)完成外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）分離。

1.3.2T-SPOT.TB操作及結(jié)果判讀 試驗操作過程及結(jié)果判讀均按照T-SPOT.TB試劑盒配套說明書嚴(yán)格執(zhí)行。準(zhǔn)確記錄每1個檢測樣本T-SPOT.TB試驗結(jié)果中ESAT-6抗原孔、CFP-10抗原孔的具體斑點數(shù)值。根據(jù)抗原ESAT-6和/或抗原CFP-10孔的反應(yīng)判斷結(jié)果，陽性結(jié)果參照以下兩條標(biāo)準(zhǔn)中的任意一條：（1）空白對照孔斑點數(shù)為0～5個時：（抗原ESAT-6或抗原CFP-10孔的斑點數(shù)）-（空白對照孔斑點數(shù)）≥6。（2）空白對照孔斑點數(shù)為6～10個時：（抗原ESAT-6或抗原CFP-10孔的斑點數(shù)）≥2×（空白對照孔斑點數(shù)）。

1.4療效觀察 患者抗結(jié)核治療采取自行服藥方式，遵醫(yī)囑門診定期復(fù)查。臨床表現(xiàn)（如咯血、消瘦、胸痛、發(fā)熱等）持續(xù)緩解及輔助檢查提示病灶消失或鈣化等為有效病例，納入本次研究［18］；若抗癆治療后臨床表現(xiàn)及輔助檢查結(jié)果無明顯變化或病情加重，則視為無效病例［19］，予以剔除。

1.5質(zhì)量控制 課題數(shù)據(jù)采集前，對相關(guān)專業(yè)人員分別參照《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)》（WS 288-2017）、《結(jié)核病治療指南》和TSPOT.TB（免疫斑點法）操作說明書等，統(tǒng)一進(jìn)行規(guī)范化培訓(xùn)。嚴(yán)格按照納入及排除標(biāo)準(zhǔn)收集數(shù)據(jù)，信息調(diào)查留取紙質(zhì)版，采用雙人雙錄方式錄入檢測數(shù)據(jù)，請專業(yè)技術(shù)人員進(jìn)行TSPOT.TB試驗操作且整個操作過程均達(dá)到質(zhì)量控制目標(biāo)。注：《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)》（WS 288-2017）未實施之前，本研究入組病例診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)》（WS 288-2008）。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。不符合正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，不同時間點比較采用Friedman秩和檢驗；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1肺結(jié)核患者抗癆治療有效過程中T-SPOT.TB斑點數(shù)變化趨勢 T-SPOT.TB斑點數(shù)（ESAT-6抗原孔、CFP-10抗原孔、“ESAT-6+CFP-10”抗原孔）在初診行短程標(biāo)準(zhǔn)抗結(jié)核治療前和治療后30 d、1個月、3個月基本呈逐漸降低的趨勢（P＜0.05），見圖1、表1。

Fig.1 Trends of T-SPOT.TB results before and after treatment at 0.5,1 and 3 months圖1 治療前和治療后0.5、1、3個月T-SPOT.TB結(jié)果變化趨勢

2.2治療前及治療3個月后機(jī)體對ESAT-6、CFP-10刺激應(yīng)答變化趨勢 與治療前相比，機(jī)體在治療3個月后對ESAT-6和CFP-10抗原刺激應(yīng)答反應(yīng)均下降。ESAT-6應(yīng)答變化升高占比14.00%（7/50）、降低占比86.00%（43/50）；CFP-10應(yīng)答變化升高占比4.00%（2/50）、降低占比96.00%（48/50），治療3個月后機(jī)體對ESAT-6、CFP-10應(yīng)答反應(yīng)變化一致（χ2=1.954，P=0.162）。

Tab.1 Comparison of T-SPOT.TB results between different time points表1 不同時間點T-SPOT.TB結(jié)果的差異性比較 ［M（P25，P75）］

3 討論

T-SPOT.TB是利用當(dāng)機(jī)體T淋巴細(xì)胞再次受到具有毒力的結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后可活化為分泌結(jié)核分枝桿菌特異性γ-干擾素的效應(yīng)T細(xì)胞，檢測并計數(shù)效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量，以評估機(jī)體是否被結(jié)核分枝桿菌感染的一種手段；該試驗中的抗原在致病結(jié)核分枝桿菌RD1區(qū)上：Rv3874編碼的CFP-10抗原和Rv3875編碼的ESAT-6抗原［20-23］。有研究顯示，結(jié)核分枝桿菌抗原特異性效應(yīng)T細(xì)胞一旦失去致病菌的刺激就會很快凋亡，且結(jié)核病患者若不進(jìn)行任何臨床干預(yù)，其T-SPOT.TB結(jié)果不變；但隨著抗癆治療的有效進(jìn)行，機(jī)體結(jié)核分枝桿菌抗原特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答水平隨之改變，效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量會隨著機(jī)體內(nèi)細(xì)菌載量的下降而下降［24-25］；說明TSPOT.TB結(jié)果可能會隨著患者抗癆治療病情好轉(zhuǎn)而不斷降低甚至轉(zhuǎn)陰，從而進(jìn)一步提示T-SPOT.TB可能成為評估活動性肺結(jié)核抗癆治療效果的一個新的敏感指標(biāo)［26-29］。

本次初步研究發(fā)現(xiàn)T-SPOT.TB斑點數(shù)在肺結(jié)核早期抗癆治療有效過程中呈下降趨勢。吳家寶等［12］對9例活動性肺結(jié)核患者也進(jìn)行了4個時間點（治療前，治療后2、4、6個月）的追蹤觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著抗癆治療地有效進(jìn)行，結(jié)核分枝桿菌抗原特異性淋巴細(xì)胞的數(shù)量隨著機(jī)體致病菌負(fù)荷的下降而變化。Park等［30］觀察并記錄確診的33例活動性肺結(jié)核患者抗癆治療前及治療結(jié)束時的數(shù)據(jù)，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)ESAT-6和CFP-10的平均斑點計數(shù)分別下降了27和24，指出隨著抗癆治療地有效進(jìn)行，T-SPOT.TB結(jié)果明顯下降。以上研究結(jié)果均與本研究結(jié)果相似。Wang等［29］對13例正在抗癆治療的肺外結(jié)核患者進(jìn)行了連續(xù)T-SPOT.TB檢測，發(fā)現(xiàn)在抗癆治療6個月后，ESAT-6和CFP-10抗原孔斑點數(shù)無明顯下降（P=0.191，P=0.061）。汪鍇等［24］對62例脊柱結(jié)核患者進(jìn)行了5個時間點（抗癆治療前、1、3、6和12個月）的追蹤隨訪，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在后4個時間點統(tǒng)計TSPOT.TB結(jié)果轉(zhuǎn)陰人數(shù)/臨床癥狀緩解人數(shù)比值分別為0、8.3%、22.0%和51.3%，提示該試驗不可用于評估脊柱結(jié)核療效。以上研究結(jié)果與本研究結(jié)果不一致，考慮原因可能為：（1）入組樣本量均較少。（2）研究追蹤隨訪時間不同。（3）研究結(jié)核感染部位及病種差異。（4）研究人群的地域及遺傳背景差異。（5）采用T-SPOT.TB判斷疾病預(yù)后的視角不同等。

本研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過3個月治療，機(jī)體對ESAT-6、CFP-10刺激應(yīng)答水平變化一致。何紫琪等［6］對113例結(jié)核病患者治療前、后CFP-10和ESAT-6應(yīng)答變化趨勢分析發(fā)現(xiàn)，治療前、后機(jī)體對CFP-10和ESAT-6抗原應(yīng)答變化有差異，結(jié)核病治療的有效監(jiān)測手段是CFP-10的定量應(yīng)答，與本研究結(jié)果存在差異。Ewer等［31］對38例結(jié)核菌素皮膚試驗陽性者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其接受3個月預(yù)防性抗癆治療后，RD1區(qū)特異性T細(xì)胞反應(yīng)顯著下降，其中16%的患者在隨訪期間出現(xiàn)RD1區(qū)特異性T細(xì)胞反應(yīng)呈陰性，該現(xiàn)象可能反映了預(yù)防性抗癆治療期間活桿菌數(shù)量的減少，此研究與本研究結(jié)果基本相符。Aiken等［32］研究發(fā)現(xiàn)，抗癆治療1年后，機(jī)體對CFP-10和ESAT-6刺激的應(yīng)答反應(yīng)降低，伴隨著結(jié)核病的成功治療，結(jié)核分枝桿菌特異性抗原斑點計數(shù)顯著下降，提示ELISPOT試驗具有成為衡量結(jié)核病治療效果的潛力。目前關(guān)于肺結(jié)核患者抗癆治療過程中機(jī)體對ESAT-6、CFP-10刺激應(yīng)答水平變化的研究略少，考慮到此研究現(xiàn)狀，分析各研究結(jié)果差異的原因可能是：（1）不同學(xué)者對研究對象的追蹤觀察時間點各不相同。（2）不同患者由于遺傳背景不同，個體存在較大差異。（3）不同科研團(tuán)隊檢測技術(shù)水平差異。（4）樣本量差異導(dǎo)致結(jié)果偏移。（5）研究對象的入組標(biāo)準(zhǔn)、病種及分組差異等。

目前T-SPOT.TB試驗已在世界各地許多實驗室得到廣泛應(yīng)用，關(guān)于探索T-SPOT.TB是否能成為肺結(jié)核療效監(jiān)測有效指標(biāo)方面仍存在爭議，不同研究從不同的視角出發(fā)，探索出其監(jiān)測結(jié)核病療效的結(jié)論也存在較大差異。本研究從探索T-SPOT.TB斑點計數(shù)在肺結(jié)核早期抗癆治療有效過程中的變化趨勢這一視角出發(fā)，得出T-SPOT.TB斑點數(shù)在肺結(jié)核早期抗癆治療有效過程中呈下降趨勢；治療前與抗癆治療有效后（第3個月時）機(jī)體對ESAT-6、CFP-10刺激應(yīng)答水平變化一致的結(jié)論。本研究為探索TSPOT.TB是否能成為肺結(jié)核抗癆療效監(jiān)測的良好指標(biāo)進(jìn)行了初步嘗試。但由于本研究的標(biāo)本量較少、追蹤觀察時間略短、入組人群缺少治療失敗或治療期間病情反復(fù)的患者等不足，可能會使研究結(jié)果產(chǎn)生偏倚，未來仍需更全面、大樣本（尤其是抗癆治療無效結(jié)核病患者）、多中心的前瞻性病例對照研究，為探索T-SPOT.TB是否能成為肺結(jié)核療效監(jiān)測的良好指標(biāo)提供更全面的數(shù)據(jù)支持。