絲裂原活化蛋白激酶和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白激活劑3在膀胱癌中的表達(dá)及其臨床意義

鄧?yán)缀?，徐芳華，曾 濤，徐想達(dá)，巢海潮

1南昌大學(xué)研究生院醫(yī)學(xué)部，南昌 330006 江西省人民醫(yī)院 2病理科 3泌尿外科 4臨床醫(yī)學(xué)研究所，南昌 330006

膀胱癌是泌尿系最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，位居全部惡性腫瘤第8位，具有易復(fù)發(fā)、易進(jìn)展、預(yù)后差等臨床特點(diǎn)[1]。在我國(guó)，其發(fā)病率高居泌尿生殖系腫瘤首位，并呈逐年上升趨勢(shì)，已成為一個(gè)嚴(yán)重危害公民健康的重大疾病[2]。目前，膀胱癌的發(fā)病機(jī)制仍不明確[3]，缺乏特異性的早期篩選、診斷指標(biāo)及有效治療靶點(diǎn)，使得雖然臨床診療水平在不斷提高，但其5年生存率無(wú)明顯改觀。因此，探索新的診斷、預(yù)后標(biāo)志物及基因治療靶點(diǎn)一直是相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)激活劑3(late endosomal/lysosomal adaptor，MAPK and MTOR activator 3，LAMTOR3)是諸多信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)控因子，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及凋亡等生物學(xué)行為方面發(fā)揮了重要作用[4]。近期研究發(fā)現(xiàn)，LAMTOR3與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[5]，但目前鮮有與膀胱癌相關(guān)的報(bào)道。本研究擬通過(guò)檢索基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘信息，并結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及臨床組織標(biāo)本進(jìn)行驗(yàn)證，分析LAMTOR3在膀胱癌中的表達(dá)及其臨床意義，為其相關(guān)基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用提供切入點(diǎn)，為基因芯片數(shù)據(jù)信息挖掘及應(yīng)用提供思路。

材料和方法

基因芯片數(shù)據(jù)篩選Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.Oncomine.org/)是基于腫瘤基因芯片數(shù)據(jù)構(gòu)建的在線數(shù)據(jù)分析平臺(tái)，收錄了多種腫瘤的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及臨床相關(guān)信息[6]。Expression Atlas 數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.ebi.ac.uk/gxa/home)是一種開(kāi)放的科學(xué)資源，可提供不同組織、細(xì)胞類(lèi)型，生物各發(fā)育階段和疾病轉(zhuǎn)歸等相關(guān)的基因表達(dá)信息[7]。本研究以“LAMTOR3/MP1”和“bladder cancer”為關(guān)鍵詞，檢索了Oncomine和Expression Atlas數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)檢索相關(guān)基因表達(dá)譜芯片信息，對(duì)不同細(xì)胞、組織類(lèi)型，各臨床分期、病理分級(jí)等相關(guān)的大數(shù)據(jù)進(jìn)行二次分析。

標(biāo)本來(lái)源2010年1月至2017年12月在江西省人民醫(yī)院收治的行膀胱癌根治術(shù)患者的病理石蠟標(biāo)本63例，新鮮的膀胱癌組織及其配對(duì)的正常組織8對(duì)。63例患者中，男57例，女6例，平均年齡(63.4±7.5)歲(43.2～65.9歲)。所有納入患者的臨床資料完備，均經(jīng)常規(guī)組織病理學(xué)確診為膀胱癌，術(shù)前均未行放療、膀胱化學(xué)灌注、免疫因子等治療。組織臨床分期、病理學(xué)分級(jí)分別參照國(guó)際抗癌聯(lián)盟(Union for International Cancer Control，UICC)2002年TMN分期、世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。本研究經(jīng)江西省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書(shū)(倫理批號(hào)2018040)。

材料和試劑人源性膀胱癌細(xì)胞株UMUC3、J82、5637、T24及人源性正常膀胱永生化細(xì)胞SV-HUC-1均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，其中J82于含10% 胎牛血清的MEM(Gibco，USA)高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，余細(xì)胞株于含10% 胎牛血清的RPMI 1640(Gibco，USA)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：37℃、5% CO2、飽和濕度。RNA提取試劑盒及2×EasyTaq PCR Super Mix購(gòu)自北京全式金生物公司，LAMTOR3及GAPDH內(nèi)參引物購(gòu)自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；兔抗人LAMTOR3及鼠抗人β-actin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Gene Tex試劑公司，羊抗兔二抗購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司，Pro-light HRP化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑購(gòu)自天根生化科技有限公司，DAB酶底物顯色試劑盒購(gòu)自福州邁新生物公司。

RT-PCR法檢測(cè)LAMTOR3 mRNA表達(dá)采用RNA提取試劑盒提取組織及細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)法定量。按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。引物序列：LAMTOR3上游引物序列為5’-ATGGCGGATGACCTAAAGCG-3’，下游引物序列為5’-GAAACTTCCACAACTTGTCTCAGTTC-3’；GAPDH上游引物序列為5’-ACAGCCTCAAGATCATCAGC-3’；下游引物序列為5’-GGTCAT GAGTCCTTCCACGAT-3’。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，程序設(shè)定：預(yù)變性95℃ 30 s；循環(huán)參數(shù)95℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 30 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。設(shè)置3次平行實(shí)驗(yàn)。

Western blot檢測(cè)LAMTOR3蛋白水平收集膀胱癌組織及正常膀胱組織，加入裂解液充分裂解，制備細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定各蛋白濃度。配置相應(yīng)濃度的SDS-PAGE電泳凝膠，依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、10%脫脂牛奶封閉。一抗孵育，4℃搖床過(guò)夜；第2天回收一抗后加入二抗孵育1 h；TBST洗膜5次，每次5 min；ECL法顯影，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。采用Image J軟件分析各條帶灰度值，分別計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量并使用Adobe Illustrator軟件作圖。

免疫組織化學(xué)法使用石蠟標(biāo)本制作4 μm切片。按免疫組織化學(xué)SP法試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：將切片依次經(jīng)過(guò)烤片、水化、高溫高壓抗原修復(fù)、羊血清封閉，稀釋一抗(1∶200)室溫孵育1 h，PBS洗滌再行二抗室溫孵育15 min，蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)膠封片鏡檢；采用等量PBS代替一抗為陰性對(duì)照。切片染色完成后進(jìn)行結(jié)果判定。

結(jié) 果

LAMTOR3在各膀胱癌細(xì)胞株中的表達(dá)Expression Atlas數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果顯示，LAMTOR3在20株膀胱癌細(xì)胞中的基礎(chǔ)表達(dá)水平存在差異，其中，以Hs 172.T、HT-1376、RT4、JMSU-1、T24細(xì)胞株中呈較高表達(dá)(圖1)。

LAMTOR3在膀胱癌組織及正常組織中的表達(dá)Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中Dyrskj?t等[8]報(bào)道的基因芯片數(shù)據(jù)顯示：LAMTOR3在浸潤(rùn)性(t=2.857，P=0.005)及非浸潤(rùn)性膀胱癌組織(t=3.105，P=0.003)中的表達(dá)均明顯高于正常膀胱組織，LAMTOR3在病理分級(jí)越高的膀胱癌組織中表達(dá)越高(P<0.05)。Sanchez-Carbayo等[9]報(bào)道的基因芯片數(shù)據(jù)顯示：LAMTOR3在浸潤(rùn)性膀胱癌組織的表達(dá)明顯高于正常膀胱組織(t=3.766，P=0.00021)，但在非浸潤(rùn)性癌組織中的表達(dá)與正常組織差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-1.001，P=0.81)，LAMTOR3表達(dá)水平與膀胱癌病理分級(jí)有關(guān)(P<0.05)，病理分級(jí)越高，LAMTOR3表達(dá)越高(圖2)。

LAMTOR3：絲裂原活化蛋白激酶和雷帕霉素靶蛋白激活劑3；TPM：每百萬(wàn)映射讀取的轉(zhuǎn)錄組數(shù)
LAMTOR3：late endosomal/lysosomal adaptor，mitogen-activated protein kinase and mammalian target of rapamycin activator 3；TPM：transcripts per million reads
圖1LAMTOR3在各膀胱癌細(xì)胞系中的表達(dá)(顏色越深，表達(dá)越高)
Fig1Expression of LAMTOR3 in bladder cancer cell lines in Expression Atlas(deeper color indicates higher expression level)

LAMTOR3 mRNA/蛋白在膀胱癌細(xì)胞及組織中的表達(dá)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：LAMTOR3 mRNA在膀胱癌細(xì)胞株UMUC3(t=10.84，P=0.0084)、J82(t=21.75，P=0.0021)、5637(t=45.88，P=0.0005)和T24(t=87.58，P=0.0001)中的表達(dá)明顯高于正常人膀胱永生化細(xì)胞SV-HUC-1(圖3A)。在8對(duì)配對(duì)的膀胱癌組織和正常膀胱組織中，LAMTOR3 mRNA在膀胱癌組織中的表達(dá)明顯高于正常組織(t=9.076，P=0.0008；t=17.550，P<0.0001；t=7.792，P=0.0014；t=27.460，P<0.0001；t=32.510，P<0.0001；t=35.110，P<0.0001；t=13.990，P<0.0001；t=20.600，P<0.0001)(圖3B)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：LAMTOR3蛋白水平在癌組織中的表達(dá)也明顯高于正常組織(t=20.560，P<0.0001；t=32.510，P<0.0001；t=30.620，P<0.0001；t=4.865，P=0.0082；t=8.129，P=0.0012；t=19.600，P<0.0001；t=13.030，P=0.0002；t=13.970，P<0.0001)(圖3C)。

LAMTOR3的表達(dá)與膀胱癌臨床病理特征的關(guān)系免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示：LAMTOR3蛋白主要定位于胞漿，染色呈棕褐色，在正常膀胱組織中低表達(dá)，在癌組織中高表達(dá)；在浸潤(rùn)性癌組織中較非浸潤(rùn)性癌組織高表達(dá)(圖4)；其表達(dá)水平與膀胱癌臨床分期(χ2=9.189，P=0.002)、病理分級(jí)(χ2=4.746，P=0.029)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=6.210，P=0.013)密切相關(guān)，但與性別(χ2=0.965，P=0.326)、年齡(χ2=2.126，P=0.145)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(χ2=1.261，P=0.261)等無(wú)明顯相關(guān)性(表1)。

與正常膀胱組織相比，aP<0.05，bP<0.01，cP<0.001
aP<0.05，bP<0.01，cP<0.001 compared with the normal group
圖2LAMTOR3在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)基因芯片中的表達(dá)水平
Fig2Expression level of LAMTOR3 in Oncomine database

Mr：相對(duì)分子質(zhì)量；aP<0.05，bP<0.01，cP<0.001
Mr：relative molecular mass；aP<0.05，bP<0.01，cP<0.001
A.RT-PCR檢測(cè)LAMTOR3 mRNA在各膀胱癌細(xì)胞株及膀胱永生化細(xì)胞的表達(dá)；B.RT-PCR檢測(cè)LAMTOR3 mRNA在8對(duì)配對(duì)的膀胱癌(T)和癌旁組織(N)中的表達(dá)；C.Western blotting檢測(cè)8對(duì)配對(duì)的膀胱癌組織(T)和相鄰的非癌組織(N)中LAMTOR3蛋白表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參對(duì)照
A.RT-PCR was used to detect the expression of LAMTOR3 mRNA in bladder cancer cell lines and bladder immortalized cells；B.RT-PCR was used to detect the expression of LAMTOR3 mRNA in eight paired bladder cancer(T)and paracancerous tissues(N)；C.Western blotting was used to detect the expression of LAMTOR3 protein in eight pairs of bladder cancer tissues(T)and adjacent non-cancer tissues(N)，with β-actin as the internal reference
圖3LAMTOR3 mRNA/蛋白在膀胱癌細(xì)胞及組織中的表達(dá)
Fig3Expressions of LAMTOR3 mRNA/protein in bladder cancer cells and tissues

圖4LAMTOR3分別在正常膀胱組織、非浸潤(rùn)性及浸潤(rùn)性膀胱癌組織中的表達(dá)(HE)
Fig4Expression of LAMTOR3 in normal bladder tissues，non-invasive，and invasive bladder cancer tissue(HE)

討 論

LAMTOR3別名MP1，定位于人染色體4q22.3，是蛋白編碼基因，其編碼的為支架蛋白，由124個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量約為13 623，該支架蛋白主要以蛋白復(fù)合體的方式定位于有絲分裂后期的細(xì)胞核上，通過(guò)MAPK1/胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶2(extracellular signal-regulated kinase 2，ERK2)，以及MAPK激酶MAP2K1/MEK1等，調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與細(xì)胞有絲分裂和生長(zhǎng)過(guò)程[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，LAMTOR3作為調(diào)控因子促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和凋亡[10]，在肺癌[11]、乳腺癌[12]、胃癌[13]、胰腺癌[14]等多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，LAMTOR3參與了雌激素依賴的乳腺癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，對(duì)雌激素受體陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞系的存活至關(guān)重要[12]。Jun等[14]研究發(fā)現(xiàn)，LAMTOR3可調(diào)節(jié)癌細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)因素、氧水平、細(xì)胞內(nèi)能量和氨基酸含量等，誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞迅速增殖，說(shuō)明LOMTOR3在腫瘤的生長(zhǎng)存活及增殖方面發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。同時(shí)有研究表明，LOMTOR3還與腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Park 等[15]研究證實(shí)，LOMTOR3可調(diào)節(jié)腫瘤遷移關(guān)鍵因子p21激活激酶(p21 activated kinases，PAK)[16]，從而抑制前列腺癌細(xì)胞DU145的遷移。Kwon等[17]研究發(fā)現(xiàn)，LOMTOR3通過(guò)驅(qū)動(dòng)ERK1/2活性提高膠質(zhì)瘤腫瘤干細(xì)胞的侵襲力，并證實(shí)其表達(dá)與腦腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)，提示LAMTOR3和腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移、預(yù)后等關(guān)系密切，為腫瘤的診斷和治療提供新的可能。2007年，Araujo等[18]首次提出將LOMTOR3用于乳腺癌的診斷和靶向治療。此外，最近研究報(bào)道LAMTOR3高表達(dá)可增加腫瘤對(duì)放療、化療的抗性；敲除LAMTOR3基因后，肺癌細(xì)胞對(duì)化療敏感性明顯增加[11]。以上研究說(shuō)明，LAMTOR3可能是一個(gè)潛在的腫瘤調(diào)控因子，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

表1 膀胱癌組織中LAMTOR3的表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性Table 1 Correlations between LAMTOR3 and clinicopathological characteristics in bladder cancer patients

LAMTOR3：絲裂原活化蛋白激酶和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白激活劑3
LAMTOR3：late endosomal/lysosomal adaptor，mitogen-activated protein kinase and mammalian target of rapamycin activator 3

本研究檢索了Oncomine和Expression Atlas數(shù)據(jù)庫(kù)，挖掘了LAMTOR3表達(dá)相關(guān)的基因芯片數(shù)據(jù)，分析LAMTOR3在膀胱癌細(xì)胞及組織中的表達(dá)，及其與膀胱癌臨床病理特征的關(guān)系。Expression Atlas數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果顯示，LAMTOR3在20株膀胱癌細(xì)胞中表達(dá)存在差異，以Hs172.T、HT-1376、RT4、JMSU-1、T24細(xì)胞株中表達(dá)較高，提示LAMTOR3和膀胱癌細(xì)胞密切相關(guān)。Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果顯示，LAMTOR3在膀胱癌組織中的表達(dá)明顯高于正常膀胱組織，其表達(dá)水平和膀胱癌病理分級(jí)相關(guān)，提示LAMTOR3在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能扮演了重要的調(diào)控角色。

為進(jìn)一步驗(yàn)證基因芯片數(shù)據(jù)結(jié)果，本研究體外培養(yǎng)膀胱癌細(xì)胞株及收集行膀胱癌根治術(shù)患者的病理石蠟標(biāo)本63例，以及新鮮的膀胱癌組織及其配對(duì)的正常組織8對(duì)，分別采用RT-PCR、Western blot及免疫組織化學(xué)法檢測(cè)LAMTOR3的表達(dá)。結(jié)果顯示，LAMTOR3 mRNA在膀胱癌細(xì)胞株中的表達(dá)明顯高于正常細(xì)胞株，LAMTOR3基因/蛋白在膀胱癌組織中明顯高于正常組織，LAMTOR3蛋白主要定位于胞漿，染色呈棕褐色，在正常膀胱組織中低表達(dá)，在癌組織中高表達(dá)，在浸潤(rùn)性癌組織中較非浸潤(rùn)性癌組織高表達(dá)，其表達(dá)水平與膀胱癌臨床分期、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但與性別、年齡、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等無(wú)明顯相關(guān)性，與生物信息學(xué)相關(guān)分析結(jié)果一致，提示LAMTOR3和膀胱癌關(guān)系密切。

綜上，本研究根據(jù)生物信息分析并結(jié)合細(xì)胞、組織標(biāo)本水平驗(yàn)證，評(píng)估了LAMTOR3在膀胱癌中的表達(dá)及其臨床意義，結(jié)果提示LAMTOR3在膀胱癌細(xì)胞及組織中高表達(dá)，與膀胱癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，為其相關(guān)基礎(chǔ)研究及靶向分子治療提供新的切入點(diǎn)，為基因芯片數(shù)據(jù)信息挖掘及應(yīng)用提供了思路。