熱休克蛋白A5對雨蛙肽誘導的胰腺腺泡細胞損傷的作用研究

胰腺炎是一種病因較復雜的臨床常見疾病，可分為急性胰腺炎和慢性胰腺炎[1-2]。急性胰腺炎的病情較嚴重，可引起全身并發(fā)癥，出現(xiàn)多功能器官衰竭，甚至危及生命[3]。Lerch等[4]早在1992年已發(fā)現(xiàn)急性胰腺炎的早期損傷部位是胰腺腺泡細胞。在胰腺炎動物模型中，消化酶和溶酶體水解酶的轉運出現(xiàn)障礙，且均出現(xiàn)在細胞內(nèi)的液泡中[5]。隨著細胞生物學和分子生物學的發(fā)展，學者們對腺泡細胞損傷機制的認識不斷深入，這對研究胰腺炎的發(fā)病機制具有重要意義。

熱休克蛋白A5(HSPA5)是HSP 70家族成員之一，其可作為分子伴侶促進正常生長狀態(tài)下的細胞蛋白質成熟，是維持細胞機能和生命的關鍵性調節(jié)物[6]。HSPA5可識別錯誤折疊的多肽，并通過蛋白酶作用使其降解，其也是內(nèi)質網(wǎng)上的一種應激蛋白，在低糖、低氧或缺鈣的應激狀態(tài)下大量表達以維持內(nèi)質網(wǎng)穩(wěn)定，保護細胞對抗生理變化損傷[7]。HSPA5不僅在早期胚胎發(fā)育時是高度激活的，也是低葡萄糖水平、低pH和低氧誘導的結果，而這種環(huán)境非常有利于腫瘤的生長[8]?？傊?，HSPA5可通過阻斷細胞重要蛋白質的變性及聚合而達到保護細胞的作用。HSPA5在多種腫瘤中均高表達，為促癌因子[9]，但其在胰腺腺泡細胞中的作用機制尚未闡明。

雨蛙肽是一類與膽囊收縮素化學結構和藥理作用相似的多肽類物質，具有較強的刺激膽囊收縮和胰酶分泌的作用。雨蛙肽可引起胰酶異常激活、凋亡基因表達、鈣通道調控失調等，從而誘導胰腺腺泡細胞凋亡，引發(fā)組織損傷[10]。這也為體外誘導胰腺腺泡細胞損傷，研究胰腺炎起到了重要作用。

本研究將建立雨蛙肽誘導的胰腺腺泡細胞損傷模型，通過檢測HSPA5的mRNA和蛋白表達，觀察過表達HSPA5和敲除HSPA5對胰腺腺泡細胞淀粉酶活性、乳酸脫氫酶(LDH)漏出率以及細胞增殖和凋亡的影響，以明確HSPA5對雨蛙肽誘導的胰腺腺泡細胞損傷的作用，以期為胰腺炎的早期診斷和治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

胰腺腺泡細胞AR42J購自美國模式培養(yǎng)物保藏所(CRL-1492TM)；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液、雨蛙素、MTT、SDS-PAGE 試劑、胰蛋白酶、ECL發(fā)光液和RIPA蛋白裂解液均購自碧云天生物技術公司；PVDF膜購自德國羅氏診斷有限公司；Biovision淀粉酶活性檢測試劑盒、LDH細胞毒性檢測試劑盒均購自武漢艾美捷科技有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自成都艾為特生物科技有限公司；LipofectamineTM2000脂質體試劑盒購自上?；巧锕?；BCA蛋白定量試劑盒購自美國HyClone Pierce公司；逆轉錄試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；凝膠成像分析儀購自美國Kodak公司；半干轉膜儀和PCR 儀購自美國BIO-RAD公司；流式細胞儀購自美國 FALS CALIBAR BD公司；ABI 7500型實時熒光定量PCR系統(tǒng)購自美國ABI公司；紫外分光光度計購自美國Thermo公司；細胞培養(yǎng)箱購自美國Forma Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)胰腺腺泡細胞AR42J，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，然后進行換液培養(yǎng)傳代。

1.2.2 轉染 為建立雨蛙肽誘導的胰腺腺泡細胞損傷模型，將正常培養(yǎng)的胰腺腺泡細胞AR42J標記為對照組，將分別用高濃度和低濃度的雨蛙肽(1×10-5mol/L、1×10-11mol/L)處理48 h的AR42J細胞標記為Cer-H組、Cer-L組；為檢測HSPA5對胰腺腺泡細胞損傷的影響，將pcDNA3.1-HSPA5、pcDNA3.1、shHSPA5、shCon用LipofectamineTM2000脂質體試劑盒分別轉染至AR42J細胞，轉染6 h后，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用qRT-PCR法確認轉染成功后，將其標記為pcDNA3.1-HSPA5組、pcDNA3.1組、shHSPA5組、shCon組，將不做任何處理的AR42J細胞標記為陰性對照組；為了檢測過表達HSPA5對雨蛙素誘導的胰腺腺泡細胞損傷的影響，分別將pcDNA3.1-HSPA5和pcDNA 3.1用同樣的脂質體方法轉染至Cer-H組細胞，轉染6 h后，更換新鮮培養(yǎng)基再次培養(yǎng)48 h，用qRT-PCR法檢測轉染是否成功，將轉染成功的標記為pcDNA 3.1+Cer-H組、pcDNA 3.1-HSPA5+Cer-H組，不做任何處理的AR42J細胞標記為正常對照組。取對數(shù)生長期的轉染細胞進行淀粉酶活性、LDH漏出率、qRT-PCR、Western blot和流式細胞術檢測。

1.2.3 淀粉酶活性測定 取適量對數(shù)生長期的胰腺腺泡細胞，按照淀粉酶活性檢測試劑盒說明書操作，在405 nm波長下測定細胞的吸光度。細胞中淀粉酶活性與細胞吸光度呈正比。每個樣品做5個重復孔，實驗重復3次。

1.2.4 LDH漏出率測定 取適量胰腺腺泡細胞，按照LDH細胞毒性檢測試劑盒說明書操作，在490 nm波長下測定LDH的吸光度。LDH活性與LDH吸光度呈正比，與LDH漏出率呈反比。漏出率(%)=檢測組LDH OD490/對照組LDH OD490×100 %。每個樣品做5個重復孔，實驗重復3次。

1.2.5 qRT-PCR檢測HSPA5 mRNA表達 取適量對數(shù)生長期細胞，用Trizol法裂解細胞，RNA抽提試劑盒提取RNA并定量。用逆轉錄試劑盒合成cDNA，用qRT-PCR試劑盒檢測HSPA5 mRNA表達，以2-△△Ct法計算定量結果。實驗重復3次。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡率 取適量對數(shù)生長期細胞，用預冷的PBS洗滌2次。用結合緩沖液500 μL懸浮細胞，分別加入5 μL的 Annexin V-FITC和PI，混勻，室溫避光靜置15 min。采用流式細胞儀分析測定細胞凋亡率。細胞總凋亡率(%)=早期凋亡率+晚期凋亡率。每個樣品重復3次。

1.2.7 Western blot檢測HSPA5蛋白表達 取對數(shù)生長期細胞，RIPA裂解后用BCA試劑盒定量，在100 ℃水中變性10 min，離心后取上清進行蛋白上樣。按照Western blot操作流程進行電泳-轉膜-封閉-Ⅰ抗孵育-Ⅱ抗孵育-顯影曝光。Image J軟件分析目的條帶灰度值，以目的條帶灰度值與Actin灰度值的比值表示目的蛋白的表達情況。

2 結果

2.1 不同濃度的雨蛙肽對胰腺腺泡細胞的損傷

如圖1A、1B所示，與對照組相比，高濃度和低濃度雨蛙肽處理的胰腺腺泡細胞的淀粉酶活性、LDH漏出率均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。用MTT法檢測高濃度和低濃度雨蛙肽處理的胰腺腺泡細胞存活率，結果如圖1C所示，與對照組相比，Cer-L組和Cer-H組胰腺腺泡細胞的存活率均顯著降低。用流式細胞術檢測細胞凋亡率，結果如圖1D所示，與對照組相比，Cer-L組和Cer-H組胰腺腺泡細胞的凋亡率均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)?？梢?，不同濃度的雨蛙肽均可造成胰腺腺泡細胞損傷，本研究選用高濃度雨蛙肽用于后續(xù)胰腺腺泡細胞損傷模型的制備。

2.2 HSPA5在雨蛙肽損傷的胰腺腺泡細胞中的表達

與對照組相比，Cer-L組和Cer-H組細胞中HSPA5 mRNA的表達水平均顯著升高(圖2A)，HSPA5的蛋白表達水平均顯著升高(圖2B、2C)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結果顯示HSPA5在雨蛙肽損傷的胰腺腺泡細胞中高表達。

注：與對照組相比，**P<0.01

圖1不同濃度雨蛙肽對各組胰腺腺泡細胞損傷的影響A各組細胞淀粉酶活性比較B各組細胞LDH漏出率比較C各組細胞存活率比較D各組細胞凋亡率比較

注：與對照組相比，**P<0.01

圖2雨蛙肽損傷的胰腺腺泡細胞中HSPA5的表達A各組細胞中HSPA5 mRNA表達的比較B各組細胞中HSPA5蛋白表達的比較(電泳圖)C各組細胞中HSPA5蛋白表達的比較(柱狀圖)

2.3 過表達HSPA5對胰腺腺泡細胞損傷的影響

將pcDNA3.1-HSPA5、pcDNA3.1以脂質體法分別轉染到胰腺腺泡細胞，轉染48 h后，用Western blot檢測HSPA5蛋白的表達，結果如圖3A、3B所示，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-HSPA5組細胞中HSPA5蛋白表達顯著升高。如圖3C、3D所示，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-HSPA5組細胞淀粉酶活性、LDH漏出率均顯著下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)。結果顯示過表達HSPA5可保護胰腺腺泡細胞。

2.4 敲減HSPA5對胰腺腺泡細胞損傷的影響

將shCon、shHSPA5用脂質體法分別轉染至胰腺腺泡細胞，標記為shCon組、shHSPA5組，以觀察敲減HSPA5對胰腺腺泡細胞損傷的影響。與shCon組相比，shHSPA5組細胞中HSPA5蛋白表達水平顯著降低(圖4A)，淀粉酶活性顯著升高(圖4B)，LDH漏出率顯著升高(圖4C)，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)。結果顯示敲減HSPA5可加重胰腺腺泡細胞的損傷。

2.5 過表達HSPA5對雨蛙肽對胰腺腺泡細胞損傷作用的影響

分別將pcDNA3.1、pcDNA3.1-HSPA5用脂質體法轉染至用高濃度雨蛙肽處理的胰腺腺泡細胞，標記為pcDNA3.1+Cer-H組、pcDNA3.1-HSPA5+Cer-H組，用來觀察過表達HSPA5對雨蛙素損傷胰腺腺泡細胞的影響。與正常對照組相比，pcDNA 3.1+Cer-H組細胞淀粉酶活性、LDH漏出率、細胞凋亡率均顯著升高，細胞存活率顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)；正常對照組與pcDNA 3.1-HSPA5+Cer-H組細胞淀粉酶活性、LDH漏出率、細胞存活率、細胞凋亡率的差異均無統(tǒng)計學意義。見圖5。結果顯示過表達HSPA5可減輕雨蛙肽對胰腺腺泡細胞的損傷作用。

注：與pcDNA3.1組相比，**P<0.01

圖3過表達HSPA5對胰腺腺泡細胞損傷的影響A各組細胞中HSPA5蛋白表達的比較(電泳圖)B各組細胞中HSPA5蛋白表達的比較(柱狀圖)C各組細胞淀粉酶活性比較D各組細胞LDH漏出率比較

注：與shCon組相比，**P<0.01

圖4敲減HSPA5對胰腺腺泡細胞損傷的影響A各組細胞中HSPA5蛋白表達的比較B各組細胞淀粉酶活性比較C各組細胞LDH漏出率比較

注：與正常對照組組相比，**P<0.01

圖5過表達HSPA5對雨蛙肽對胰腺腺泡細胞的損傷A各組細胞淀粉酶活性比較B各組細胞LDH漏出率比較C各組細胞存活率比較D各組細胞凋亡率比較

3 討論

雨蛙肽又名雨蛙素、蛙皮素、羚蟾素、羚蟾肽，目前已開發(fā)用于建立大鼠、小鼠、狗和敘利亞倉鼠等急性胰腺炎動物模型，1971年首次由Anastasi等[11]從歐洲兩種蛙的皮膚中提取所得，它是一個具有多種活性結構形式的家族，其結構為10～27個氨基酸，雨蛙肽為14肽，均具有與雨蛙肽相似的C端肽鏈，而且具有許多相同的生理作用[12]。許多研究報道應用雨蛙肽建立胰腺炎模型[13-15]。本研究用不同濃度的雨蛙肽與胰腺腺泡細胞共培養(yǎng)，通過試劑盒檢測細胞淀粉酶活性和LDH漏出率，MTT法檢測細胞存活率，流式細胞術檢測細胞凋亡率，結果顯示不同濃度的雨蛙肽均可造成胰腺腺泡細胞損傷。

1962年Ritossa[16]首次發(fā)現(xiàn)熱休克現(xiàn)象，1974年有學者將在熱休克中發(fā)生抑制的蛋白命名為“HSP”。HSP中較保守和較主要的成員有HSP68、HSP70、HSP72和HSP78，其中HSP70及其編碼基因均具有高度保守性，其在缺血性腦損傷中的研究較多[17]。HSP70是目前哺乳動物細胞中重要的、研究得較為深入的HSP家族，HSPA5為HSP70家族中的一員，其具有HSP70的特性和功能。盡管HSPA5在很多腫瘤組織和腫瘤細胞中高表達，且具有促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用，但HSP70的這種普遍存在、高度保守的特性是細胞保護的基礎，得到了廣泛認可[18-20]。于楓等[21]對HSP70與細胞凋亡的關系的研究發(fā)現(xiàn)，HSP70可阻止變性細胞蛋白質凝集，調節(jié)應激活化蛋白激酶，阻止細胞色素C從線粒體釋放，抑制細胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1 結合，阻止半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)活化，從而抑制細胞凋亡，保護細胞受損。

本研究建立了雨蛙肽刺激AR42J細胞的胰腺炎模型，通過qRT-PCR和Western blot檢測受損的AR42J細胞中HSPA5的mRNA和蛋白表達，發(fā)現(xiàn)HSPA5在受損的AR42J細胞中高表達；此外，通過檢測敲減和過表達HSPA5的AR42J細胞的淀粉酶活性、LDH漏出率、細胞存活率及細胞凋亡率，發(fā)現(xiàn)HSPA5對受損的AR42J細胞具有修復能力，揭示其對雨蛙肽誘導的胰腺腺泡細胞損傷具有保護作用。

綜上所述，HSPA5可保護雨蛙肽誘導的胰腺腺泡細胞損傷，這對急性胰腺炎的靶點治療具有重要意義。