抑制TUBB3基因表達對胃癌細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響及機制研究

胃癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，其早期癥狀不明顯，大部分患者確診時已處于進展期，加之患者對目前的治療方式有不同程度的不良反應，導致胃癌的治療效果不佳[1-3]。因此，探索更佳的治療方法對于提高胃癌治療效果和改善預后尤為重要?；蛑委熓钱斍把芯康臒狳c，在改善腫瘤患者預后中取得了較顯著的成果[4]。探究與腫瘤發(fā)病、進展相關(guān)的基因的作用機制能夠為治療提供靶點。目前研究顯示3型β微管蛋白(TUBB3)基因在非小細胞肺癌、乳腺癌、食管鱗狀細胞癌等多種腫瘤組織中的表達高于正常組織，提示TUBB3基因表達與腫瘤發(fā)生具有一定的相關(guān)性[5-7]。多項研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中TUBB3基因呈高表達[8-9]，推測TUBB3基因與胃癌發(fā)生有一定的關(guān)系。本研究采用體外培養(yǎng)人胃癌SGC-7901細胞，觀察抑制細胞中TUBB3基因的表達對細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物學特性的影響，并對其作用機制進行初步探討，以期為胃癌的治療和預后提供新的基因靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌SGC-7901細胞(中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫)；RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胰蛋白酶(美國HyClone公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；TUBB3 siRNA及siRNA control(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒(美國Invitrogen公司)；實驗所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成；RNA提取試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Promega公司)；SYBR Green Gene Expression Assay試劑盒(大連寶生物工程有限公司)；CCK-8試劑盒、二甲基亞砜(碧云天生物技術(shù)研究所)；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(日本Takara公司)；孔徑8 μm Transwell小室、Matrigel基質(zhì)膠(美國BD公司)；PCNA、Cleaved Caspase-3、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)抗體及HRP標記的二抗(美國SantaCruz公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

人胃癌SGC-7901細胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(含青霉素和鏈霉素雙抗)中，置于5% CO2、飽和濕度的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)SGC-7901細胞生長狀態(tài)，每2～3日更換1次新鮮培養(yǎng)液。待細胞生長至匯合度達85%時，以胰蛋白酶消化傳代。取處于對數(shù)生長期的細胞用于轉(zhuǎn)染實驗。轉(zhuǎn)染前24 h將SGC-7901細胞以胰酶消化，將細胞以5×105個/孔接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。當細胞密度達70%時將TUBB3 siRNA和siRNA control分別轉(zhuǎn)染人胃癌SGC-7901細胞，記為TUBB3 siRNA組和陰性對照組(NC)組，以不做任何處理的人胃癌SGC-7901細胞記為空白對照組(Control組)。轉(zhuǎn)染步驟嚴格按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作。

1.3 qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后細胞中TUBB3 mRNA表達水平

SGC-7901細胞轉(zhuǎn)染后48 h收集各組細胞，按照RNA提取試劑盒說明書提取細胞中RNA，經(jīng)分光光度計檢測RNA純度和濃度后，以反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，將cDNA濃度調(diào)整為50 ng/μL，以SYBR Green Gene Expression Assay試劑盒進行熒光定量PCR擴增，以GAPDH為內(nèi)參，用相對定量2-△△CT計算細胞中TUBB3 mRNA相對表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 Western blot檢測細胞中蛋白表達水平

收集轉(zhuǎn)染后48 h的各組SGC-7901細胞，加入細胞裂解液提取各組細胞中總蛋白，蛋白樣品經(jīng)BCA蛋白定量檢測試劑盒定量后，取40 μg蛋白樣品加樣至10%聚丙烯酰胺凝膠上樣孔進行電泳。電泳結(jié)束后采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后在含5%脫脂奶粉的封閉液中室溫孵育4 h。分別使用TUBB3一抗(1∶800倍稀釋)、PCNA一抗(1∶800倍稀釋)、Cleaved Caspase-3一抗(1∶1 000倍稀釋)、MMP-2一抗(1∶1 000倍稀釋)4 ℃孵育過夜。PBST洗滌3次，加入二抗室溫孵育2 h。用ECL發(fā)光試劑盒顯色，在凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照，計算目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶灰度值表示TUBB3、PCNA、Cleaved Caspase-3、MMP-2蛋白相對表達水平。

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖能力

將各組SGC-7901細胞分別接種于96孔板中，接種密度為1×103/孔，用CCK-8法分析各組細胞的增殖能力。分別在培養(yǎng)24、48、72 h時進行檢測，每個時間點設置3個平行復孔，在每孔細胞中添加10 μL的CCK-8試劑，置于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，在酶標儀450 nm處檢測各孔細胞的吸光度值(A值)。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡水平

將轉(zhuǎn)染后48 h的各組SGC-7901細胞用0.25%的胰蛋白酶消化，收集至EP管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用預冷的PBS洗滌細胞2次，離心去上清，用結(jié)合緩沖液重懸細胞，加入5 μL碘化丙啶輕輕混勻，再加入5 μL Annexin V-FITC室溫避光孵育15 min，上流式細胞儀檢測各組SGC-7901細胞的凋亡率。

1.7 Transwell實驗檢測細胞侵襲和遷移能力

Matrigel基質(zhì)膠用無血清培養(yǎng)基稀釋(置冰上操作)，將稀釋的Matrigel膠鋪于Transwell小室膜底部，晾干待用。將轉(zhuǎn)染后48 h的各組SGC-7901細胞消化收集，用無血清培養(yǎng)基重懸細胞，制成2×105個/mL的單細胞懸液，取200 μL接種于含Matrigel膠的Transwell小室上室，下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，PBS輕輕洗滌2次，拭去上室細胞，甲醇固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗滌3次后在顯微鏡下隨機選取5個視野觀察計數(shù)穿膜細胞數(shù)。實驗重復3次并取平均值，以侵襲細胞數(shù)量表示細胞侵襲能力。用相同方法檢測細胞遷移能力，Transwell小室不以Matrigel膠包被，其余步驟與侵襲實驗相同。

1.8 統(tǒng)計學處理分析

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后各組SGC-7901細胞中TUBB3 mRNA和蛋白表達水平

轉(zhuǎn)染后48 h，采用qRT-PCR和Western blot檢測各組SGC-7901細胞中TUBB3 mRNA和蛋白的表達水平，Control組與NC組細胞中TUBB3 mRNA和蛋白表達水平相比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與NC組比較，TUBB3 siRNA組細胞中TUBB3 mRNA和蛋白的表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染TUBB3 siRNA能夠抑制SGC-7901細胞中TUBB3的表達。見圖1、表2。

圖1 各組SGC-7901細胞中TUBB3蛋白的表達水平表2 各組SGC-7901細胞中TUBB3 mRNA和 蛋白的表達水平()

組別TUBB3 mRNATUBB3蛋白Control組1.000.35±0.04NC組1.02±0.1a0.31±0.03aTUBB3 siRNA組0.34±0.04b0.12±0.01bF值116.17252.269P值0.0000.000

注：與Control組相比，aP>0.05；與NC組相比，bP<0.05

2.2 抑制SGC-7901細胞中TUBB3的表達對細胞增殖的影響

CCK-8試劑盒檢測各組SGC-7901細胞在轉(zhuǎn)染24、48、72 h的A值。TUBB3 siRNA組細胞的A值在轉(zhuǎn)染后48、72 h均低于NC組，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。Control組與NC組細胞在各時間點的A值相比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。結(jié)果提示下調(diào)SGC-7901細胞中TUBB3的表達能抑制細胞增殖。見表3。

表3 抑制TUBB3表達對SGC-7901細胞增殖的影響()

注：與Control組相比，aP>0.05；與NC組相比，bP<0.05

2.3 抑制SGC-7901細胞中TUBB3的表達對細胞凋亡的影響

細胞轉(zhuǎn)染后48 h，流式細胞儀檢測各組SGC-7901細胞凋亡率，Transwell實驗檢測各組SGC-7901細胞的侵襲和遷移能力。 Control組與NC組的細胞凋亡率、侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)相比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。與NC組比較，TUBB3 siRNA組的細胞凋亡率顯著升高，侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)顯著減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。結(jié)果提示抑制SGC-7901細胞中TUBB3的表達能促進細胞凋亡，抑制細胞的侵襲和遷移能力。見圖2～4、表4。

圖2 流式細胞儀檢測各組SGC-7901細胞的凋亡率 A Control組 B NC組 C TUBB3 siRNA組

圖3 Transwell實驗檢測各組SGC-7901細胞的侵襲能力 A Control組 B NC組 C TUBB3 siRNA組

圖4 Transwell實驗檢測各組SGC-7901細胞的遷移能力 A Control組 B NC組 C TUBB3 siRNA組

2.4 抑制TUBB3的表達對PCNA、Cleaved Caspase-3和MMP-2蛋白表達的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，Control組與NC組細胞中PCNA、Cleaved Caspase-3和MMP-2蛋白表達水平相比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；與NC組比較，TUBB3 siRNA組細胞中PCNA和MMP-2蛋白表達水平顯著降低，Cleaved Caspase-3蛋白表達水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。結(jié)果提示抑制SGC-7901細胞中TUBB3表達能誘導細胞中Caspase-3蛋白活化，抑制PCNA和MMP-2蛋白表達。見圖5、表5。

表4 各組SGC-7901細胞的凋亡率、侵襲和遷移能力比較()

注：與Control組相比，aP>0.05；與NC組相比，bP<0.05

圖5 Western blot檢測各組SGC-7901細胞中PCNA、 Cleaved Caspase-3和MMP-2蛋白表達水平表5 各組SGC-7901細胞中PCNA、Cleaved Caspase-3 和MMP-2蛋白的表達水平比較()

組別PCNACleaved Caspase-3MMP-2Control組0.48±0.080.05±0.010.39±0.04NC組0.51±0.05a0.08±0.02a0.41±0.04aTUBB3 siRNA組0.17±0.02b0.42±0.05b0.13±0.01bF值34.290126.70066.546P值0.0010.0000.000

注：與Control組相比，aP>0.05；與NC組相比，bP<0.05

3 討論

在中國胃癌具有發(fā)病率高、病死率高等特點，多數(shù)患者就診時已處于進展期，雖然目前胃癌的治療模式有一定的療效，但總體治療水平有待提高，探索有效治療胃癌的方法具有重要意義[10]。胃癌的發(fā)生、發(fā)展是由多基因調(diào)控的過程[11]，從胃癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)基因入手，抑制胃癌細胞增殖、侵襲和遷移等惡性生物學行為是治療胃癌亟需解決的問題[12]。TUBB3基因編碼的蛋白屬于微管類蛋白，目前研究顯示TUBB3基因?qū)儆谖赴┗颊呖刮⒐芑瘜W治療藥物耐藥性相關(guān)基因，用TUBB3基因表達水平反映抗微管化學治療藥物的療效[13-14]。TUBB3基因與胃癌病情相關(guān)的研究較少，近年來研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中TUBB3基因的表達水平與抗侵襲基因的表達水平呈負相關(guān)，與促侵襲基因表達水平呈正相關(guān)，且TUBB3基因過表達能誘導胃癌細胞的侵襲活性[9,15]。抑制PTEN/Akt信號通路能降低TUBB3和TOP2A的表達水平，隨后通過ATP和Caspase-3信號通路抑制人乳腺癌MCF-7細胞的增殖和誘導細胞凋亡[16]。TUBB3基因可作為預測食管癌預后的獨立標志物，可能是食管腺癌患者診治中常規(guī)應用的有價值的生物標志物，特別是用于新輔助治療和手術(shù)后個體輔助治療[17]。本研究中通過轉(zhuǎn)染抑制人胃癌SGC-7901細胞中TUBB3的表達，采用CCK-8檢測抑制TUBB3表達對細胞增殖的影響，結(jié)果顯示可抑制細胞增殖能力。采用流式細胞儀檢測SGC-7901細胞凋亡率，采用Transwell實驗檢測細胞侵襲和遷移能力，結(jié)果顯示TUBB3表達下調(diào)的SGC-7901細胞的凋亡率升高，侵襲和遷移能力均被抑制，提示抑制TUBB3基因表達能抑制SGC-7901細胞的增殖、侵襲和遷移，誘導細胞凋亡，表現(xiàn)出一定的抑癌作用。

此外，本實驗采用Western blot檢測SGC-7901細胞中PCNA、Cleaved Caspase-3和MMP-2蛋白的表達水平，發(fā)現(xiàn)抑制TUBB3表達的SGC-7901細胞中PCNA和MMP-2蛋白水平顯著降低，Cleaved Caspase-3水平顯著升高。PCNA目前作為評價細胞增殖狀態(tài)的指標，其陽性表達提示細胞處于增殖狀態(tài)，目前已在胃癌、肝癌等多種腫瘤中應用[18-19]。Caspase-3是Caspase家族的重要成員，該蛋白激活(Cleaved Caspase-3)能促使細胞發(fā)生凋亡[20]。MMP-2是MMP家族成員，與細胞外基質(zhì)的重塑和降解有關(guān)，研究顯示MMP-2與腫瘤的浸潤及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[21]，目前已將其作為腫瘤細胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的指標。本研究結(jié)果說明抑制人胃癌SGC-7901細胞中TUBB3基因的表達能通過下調(diào)PCNA表達來抑制細胞增殖，活化Caspase-3以促進細胞凋亡，抑制MMP-2的表達以阻遏細胞的侵襲和遷移。

本實驗的不足之處在于，僅采用單一細胞株進行研究，且缺乏體內(nèi)試驗驗證，后續(xù)相關(guān)研究將在不同細胞株中進行，并將結(jié)合小鼠模型實驗進一步驗證。

綜上所述，本研究采用RNA干擾技術(shù)抑制人胃癌SGC-7901細胞中TUBB3基因的表達，可抑制細胞增殖、侵襲和遷移，誘導細胞凋亡，其作用機制可能與調(diào)控細胞中PCNA、Cleaved Caspase-3和MMP-2蛋白表達水平有關(guān)。本研究證實了抑制TUBB3基因?qū)θ宋赴㏒GC-7901細胞生物學特性的影響，但TUBB3基因在其他胃癌細胞系中是否有相同的作用，今后將繼續(xù)進行探討。對TUBB3基因功能的研究提示以TUBB3基因為治療靶點具有一定的開發(fā)前景。