酸性微環(huán)境對(duì)大腸癌細(xì)胞自噬及侵襲能力的影響

占義軍 許東強(qiáng) 李 明 譚詩(shī)云

大腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率高居全球惡性腫瘤的第3位。盡管近年來(lái)大腸癌診療水平顯著提高，但其病死率仍高居腫瘤相關(guān)死亡的第2位[1, 2]。侵襲轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致大腸癌患者臨床治療失敗和死亡的主因。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞所處的腫瘤微環(huán)境有著密切關(guān)系[3～5]。酸性微環(huán)境(acidic microenvironment)是腫瘤的普遍特征，其與腫瘤低糖條件下的生存、侵襲轉(zhuǎn)移等均有關(guān)系，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中均扮演重要角色[6, 7]。自噬可使細(xì)胞能夠適應(yīng)缺氧、饑餓等惡劣環(huán)境并應(yīng)對(duì)其他各種包括化療或放療造成的損傷刺激等，有助于細(xì)胞的存活。本研究擬在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入乳酸，調(diào)節(jié)pH值為6.8，模擬酸性環(huán)境，來(lái)探討酸性環(huán)境下對(duì)大腸癌LoVo細(xì)胞侵襲能力及自噬水平的影響。

材料與方法

1.材料：大腸癌細(xì)胞系LoVo細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；DMEM/F-12培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Transwell小室、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)皿及6孔培養(yǎng)板均購(gòu)自美國(guó)Corning公司；Matrigel膠購(gòu)自美國(guó)BD公司；EMT標(biāo)志物抗體(E-cadherin、Vimentin、Fibronectin)、自噬相關(guān)基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白、MMP-9及內(nèi)參β-actin抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。蛋白濃度測(cè)定試劑盒、HRP-羊抗兔、HRP-羊抗鼠及FITC-山羊抗兔熒光二抗均購(gòu)自中國(guó)杭州碧云天生物技術(shù)研究所。

2.方法：(1)細(xì)胞培養(yǎng)：大腸癌LoVo細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞選用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。(2)Transwell實(shí)驗(yàn)：該實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(pH值7.4)和乳酸組(20mmol/L, pH值6.8)兩組。選取Transwell小室，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的上述2組細(xì)胞用不含血清的培養(yǎng)基重懸計(jì)數(shù)，接種200μl于24孔板Transwell小室上室(細(xì)胞密度為2×105/ml)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔；將600μl含10%血清的培養(yǎng)基加入24孔板Transwell小室下室，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24h；小心取出小室，吸干小室內(nèi)培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，用PBS濕潤(rùn)的棉簽輕拭小室內(nèi)的細(xì)胞，倒置晾干，4%多聚甲醛室溫下放置固定30min，倒置晾干，0.1%結(jié)晶紫染液室溫下染色15min，顯微鏡下取5個(gè)隨機(jī)視野計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。(3)蛋白質(zhì)印跡：接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞(細(xì)胞濃度為2×105/ml)至6孔板內(nèi)，每孔2ml，放置培養(yǎng)箱中孵育至細(xì)胞貼壁后，加入含乳酸的完全培養(yǎng)基分別處理細(xì)胞0、12、24h后，從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)板，消化收集細(xì)胞，并用預(yù)冷的PBS洗滌后加入蛋白裂解液(含蛋白酶抑制劑)冰上裂解反應(yīng)30min，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，置于EP管中，冰上靜置5min，離心(離心機(jī)預(yù)冷4℃)12000r/min離心 10min(r=8cm)，取上清，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，每個(gè)樣品以相同的蛋白量(40μg)加入10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法將10%聚丙烯酰胺凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，經(jīng)5%脫脂奶粉室溫條件下封閉1h，4℃條件下過夜孵育一抗，次日TBST洗膜后，室溫調(diào)價(jià)小孵育二抗2h， TBST洗滌后ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影，定影，對(duì)膠片進(jìn)行拍照分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

結(jié) 果

1.酸性環(huán)境對(duì)大腸癌LoVo細(xì)胞侵襲能力的影響：如圖1所示，Tanswell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，酸性條件(pH值6.8)下處理24h后，穿過Transwell小室基膜的大腸癌細(xì)胞系LoVo細(xì)胞數(shù)為491.4±19.5個(gè)，顯著多于中性條件(pH值7.4)的353.8±24.6個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.59,P=0.002)。

圖1 酸性環(huán)境對(duì)大腸癌LoVo細(xì)胞侵襲能力的影響(#P<0.05)A.Tanswell小室檢測(cè)中性環(huán)境(pH值7.4)和酸性環(huán)境(pH值6.8)對(duì)LoVo細(xì)胞侵襲能力的影響(結(jié)晶紫，×100)；B.與中性環(huán)境(pH值7.4)穿過Transwell小室細(xì)胞數(shù)(353.8±24.6)比較，酸性環(huán)境(pH值6.8)下穿過Transwell小室人工基膜的LoVo細(xì)胞數(shù)(491.4±19.5)增加(t=7.59, P=0.002)

2.酸性環(huán)境對(duì)大腸癌LoVo細(xì)胞MMP-9表達(dá)的影響：如圖2所示，酸性條件分別處理LoVo細(xì)胞0、12、24h后，蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)結(jié)果顯示隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，MMP-9表達(dá)逐漸增加。

圖2 酸性環(huán)境對(duì)大腸癌LoVo細(xì)胞MMP-9蛋白表達(dá)的影響A.免疫印跡圖；B.MMP-9灰度值分析;與0h比較，*P <0.05

3.酸性環(huán)境對(duì)大腸癌LoVo細(xì)胞EMT標(biāo)志物蛋白表達(dá)的影響：本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了酸性條件下對(duì)大腸癌LoVo細(xì)胞EMT標(biāo)志物表達(dá)的影響，如圖3所示，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，上皮標(biāo)志物E-鈣黏素(E-cadherin)表達(dá)逐漸下調(diào)，且間葉標(biāo)志物波形蛋白(Vimentin)和纖維連接蛋白(Fibronectin)表達(dá)逐漸上調(diào)。

圖3 酸性環(huán)境對(duì)EMT標(biāo)志物表達(dá)的影響A.免疫印跡圖；B.EMT標(biāo)志物灰度值分析;與對(duì)應(yīng)蛋白0h比較，*P<0.05

4.酸性環(huán)境對(duì)大腸癌LoVo細(xì)胞自噬相關(guān)基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表達(dá)的影響：如圖4所示，酸性條件分別處理LoVo細(xì)胞0、12、24h后，蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)結(jié)果顯示隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，自噬相關(guān)基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表達(dá)逐漸上調(diào)。

圖4 酸性環(huán)境對(duì)LoVo細(xì)胞自噬相關(guān)基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表達(dá)的影響A.免疫印跡圖；B.自噬相關(guān)基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1標(biāo)志物灰度值分析;與對(duì)應(yīng)蛋白0h比較，*P<0.05

討 論

普遍認(rèn)為腫瘤酸性微環(huán)境產(chǎn)生的機(jī)制主要包括以下因素：細(xì)胞轉(zhuǎn)化和生長(zhǎng)失控導(dǎo)致的缺氧和代謝異常；腫瘤存在獨(dú)特的代謝型——瓦伯格效應(yīng)，即腫瘤細(xì)胞無(wú)論在有氧還是低氧環(huán)境下均進(jìn)行糖酵解，產(chǎn)生乳酸并排出細(xì)胞外，而腫瘤中紊亂的血管不能有效清除組織環(huán)境中的乳酸；特別地，在提高腫瘤組織的氧分壓和血流量情況下，腫瘤依然產(chǎn)生并維持著酸性微環(huán)境[8]。這種酸性環(huán)境可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲、化療耐藥、細(xì)胞免疫逃逸等[8,9]。本研究結(jié)果顯示，與中性條件下比較，酸性條件下，大腸癌LoVo細(xì)胞侵襲能力更強(qiáng)，且基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)表達(dá)上調(diào)，后者可降解細(xì)胞外基質(zhì)并破壞基膜，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶向周圍組織及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

上皮細(xì)胞間葉樣表型轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition,EMT), EMT是腫瘤原發(fā)性浸潤(rùn)和繼發(fā)性轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制，EMT是在胞外因素刺激下由上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)細(xì)胞表型的過程[10～12]。在EMT過程中，細(xì)胞極性、細(xì)胞間緊密連接和黏附連接逐漸喪失，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架發(fā)生重組，細(xì)胞-細(xì)胞間連接蛋白如E-cadherin、γ-catenin等表達(dá)減少，而間葉標(biāo)志物如N-cadherin、Vimentin、Fibronctin等表達(dá)明顯增加。同時(shí)，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteins,MMPs)如MMP-2、MMP-3及MMP-9等活性顯著增加。特別地，研究表明，EMT的激活能使非腫瘤干細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的特性如自我更新及腫瘤啟動(dòng)能力[13,14]。因此，EMT過程被認(rèn)為是絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的前提。本研究結(jié)果顯示，酸性條件處理后可使結(jié)腸癌細(xì)胞系LoVo細(xì)胞的侵襲能力增加，且腫瘤細(xì)胞上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)降低，且間葉標(biāo)志物Vimentin、Fibronctin表達(dá)上調(diào)，提示酸性條件下可促進(jìn)LoVo細(xì)胞EMT。

腫瘤細(xì)胞應(yīng)對(duì)酸性應(yīng)激的機(jī)制仍不明確。自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和高分子物質(zhì)的過程，是細(xì)胞應(yīng)對(duì)惡劣環(huán)境的生存機(jī)制，其在腫瘤發(fā)生、進(jìn)展中發(fā)揮著復(fù)雜的作用[15～18]。在腫瘤形成前，機(jī)體可通過自噬維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)阻止細(xì)胞惡變。但當(dāng)腫瘤形成后，自噬可幫助腫瘤細(xì)胞度過不利的微環(huán)境，對(duì)腫瘤細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用，并促進(jìn)細(xì)胞侵襲[19]。但即使腫瘤形成后，也有研究顯示自噬對(duì)腫瘤細(xì)胞可產(chǎn)生抑制作用[20]。自噬的這種雙重調(diào)節(jié)作用已經(jīng)在臨床研究中不斷被證實(shí)[21,22]。酸性微環(huán)境是腫瘤的普遍特征，研究發(fā)現(xiàn)酸性條件下，人類乳腺癌細(xì)胞內(nèi)Atg5和Bnip3表達(dá)水平升高，提示細(xì)胞暴露在低pH值可能利用自噬作為一種生存機(jī)制[23,24]。本研究也發(fā)現(xiàn)酸性條件下，LoVo細(xì)胞自噬相關(guān)基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表達(dá)上調(diào)，提示LoVo細(xì)胞自噬水平升高。推測(cè)腫瘤細(xì)胞可能通過調(diào)節(jié)自噬來(lái)耐受酸性微環(huán)境來(lái)繼續(xù)生存。

綜上所述，酸性條件下LoVo細(xì)胞侵襲能力顯著增加，腫瘤細(xì)胞上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)降低，且間葉標(biāo)志物Vimentin、Fibronctin表達(dá)上調(diào)。同時(shí)，酸性條件下也可誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞發(fā)生自噬。提示腫瘤酸性微環(huán)境對(duì)腫瘤細(xì)胞自噬狀態(tài)及間質(zhì)化特征有著重要作用，且提示細(xì)胞自噬與細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化之間存在相互影響的關(guān)系，下一步將深入探討酸性環(huán)境誘導(dǎo)的自噬在大腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制，并闡明酸性微環(huán)境誘導(dǎo)自噬的機(jī)制，為尋找新的抑制大腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移治療方案提供理論基礎(chǔ)。