柴胡白芍提取液對小鼠抑郁樣行為的影響

張 蕾 牟翔宇 孫 鵬 于 洋 郜彥鑫 郭英慧

柴胡的基本功效是疏肝解郁，升舉陽氣，透表泄熱，在眾多抗抑郁復方中，柴胡類方占有重要地位，約占總數(shù)的1/3[1]。眾多實驗表明，逍遙散、四逆散、柴胡疏肝散、安神解郁湯等在調(diào)節(jié)抑郁樣情緒方面有顯著效果，歸納看來，此類方劑均以柴胡為君藥，疏肝解郁，和解表里，以白芍為臣藥，養(yǎng)血柔肝，斂陰收汗，二者配伍使用一散一收，相互展其長而避其短[2,3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，這些方劑中主要起效物質(zhì)為柴胡皂苷和芍藥苷[4]。柴胡皂苷是柴胡中最主要的活性成分，具有抗肝纖維化、抗病毒、保護肝細胞、抗腫瘤、抗炎、免疫的作用[5]。芍藥的主要活性成分為芍藥苷，芍藥苷對抗傷害性疼痛、免疫、抵抗炎癥等方面具有積極的作用[6]。雖然柴胡與白芍常配對出現(xiàn)在抗抑郁的處方中，但鮮有關(guān)于二者有效成分單獨配伍使用，對小鼠抑郁樣行為影響的報道，故本研究將就此進行探討。

材料與方法

1.實驗材料：SPF級C57BL/6雄性小鼠，體質(zhì)量18～22g，150只，日齡21～27天。由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0006。采用按體重勻齊分組的方法將150只C57BL/6雄性小鼠分為3個組，即曠場實驗、懸尾實驗和強迫游泳實驗組，再將3個實驗組分別分為5組，即空白對照(control)組、氟西汀組、柴芍高劑量組、柴芍中劑量組和柴芍低劑量組，每組10只，5只一籠分籠飼養(yǎng)。小鼠于實驗室進行適應性飼養(yǎng)1周，保持12h/12h明暗周期，晝夜顛倒，常規(guī)喂食喂水。所有動物實驗操作遵從于美國NIH頒布《實驗動物護理和使用指南》。適應性飼養(yǎng)結(jié)束后，小鼠按照藥量體質(zhì)量比0.1ml/10g標準開始灌胃給藥，陽性對照組灌胃氟西汀藥液。柴胡白芍(以下簡稱柴芍)高、中、低劑量組，空白對照組給予同等量的載體溶劑。

2.試劑與儀器：柴胡提取液、白芍提取液均由山東中醫(yī)藥大學實驗中心藥劑實驗室提供。柴胡、白芍按12∶10的生藥用量配伍(出自柴胡疏肝散)再通過人和小鼠的體表面積換算，計算出柴芍提取液低劑量組的濃度，依次進行兩倍的換算推出高、中兩個劑量，最后得出柴胡、白芍按1.00g/kg∶0.80g/kg、0.50g/kg∶0.40g/kg、0.25g/kg∶0.20g/kg 3個高、中、低比例配伍，再分別回流提取2次10倍量的70%乙醇，每次提取1.5h，合并2次提取液，過濾除去藥渣，濾液減壓回收乙醇，并將提取液放于4℃冰箱保存[7，8]。氟西汀分散片購自禮來蘇州制藥有限公司，批號:L01810，給藥時濃度為2mg/kg；Smart 3.0.0.5動物行為學分析系統(tǒng)、XR-SuperMaze動物行為分析系統(tǒng)、XR-XZ301曠場實驗系統(tǒng)、小鼠懸尾實驗箱體、小鼠強迫游泳裝置等均購自上海欣軟信息科技有限公司。

3.小鼠曠場實驗：小鼠曠場實驗在灌胃第8天進行測試。測試當天，各組小鼠均在用藥后0.5h進行實驗，輕抓握小鼠頸背部皮膚，放置于曠場箱的中央?yún)^(qū)域，待手完全不在視頻范圍中時，操作軟件開始記錄分析，每只小鼠采集時間為6min，由計算機記錄小鼠的運動軌跡，并分析中央?yún)^(qū)滯留時間(s)。

4.小鼠懸尾實驗：小鼠懸尾實驗在灌胃第8天進行測試。通過固定小鼠的尾部，使小鼠頭部向下，記錄處于該絕望狀態(tài)中小鼠產(chǎn)生的一系列不動參數(shù)。測試當天，各組小鼠均在用藥后0.5h進行實驗，小鼠尾端(在距尾尖2cm處)用膠帶固定在懸尾箱的中間橫桿上，使其呈倒懸狀態(tài)，頭部離懸尾箱底部約15cm。適應2min后，利用軟件分析記錄4min之內(nèi)，累計不動時間(s)。

5.小鼠強迫游泳實驗：小鼠強迫游泳實驗在灌胃第8天進行測試。測試前1天小鼠放入高20cm、直徑10cm的圓柱型小鼠強迫游泳桶中適應性游泳5min，測試當天，給藥0.5h后將小鼠放入游泳桶中，每桶1只，水深10cm，水溫25±2℃，利用軟件分析記錄小鼠6min內(nèi)的懸浮不動時間、懸浮不動潛伏期及懸浮不動次數(shù)。

結(jié) 果

1.柴芍提取液對小鼠曠場中央?yún)^(qū)停留時間的影響：柴芍高劑量組和柴芍低劑量組相比空白對照組，差異無統(tǒng)計學意義，而柴芍中劑量組和氟西汀組可明顯增加小鼠在中央?yún)^(qū)停留時間(P<0.05)，改善其抑郁樣行為。中劑量組柴胡白芍提取液可以明顯改善小鼠抑郁樣行為，增加OFT實驗中小鼠的中央?yún)^(qū)停留時間，詳見表1。

表1 柴胡白芍提取液對小鼠中央?yún)^(qū)停留時間的影響(C57BL/6小鼠)

與空白對照組比較，*P<0.05

2.柴胡白芍提取液對小鼠懸尾的影響：柴芍高、中、低劑量組和氟西汀組對比空白組可縮短小鼠懸尾不動時間(P<0.05)，上述劑量柴胡白芍提取液可顯著改善C57BL/6小鼠的抑郁樣行為，其中以氟西汀組和柴芍高劑量組效果更好，從而說明柴胡白芍提取液有改善小鼠抑郁樣行為的作用，詳見表2。

表2 柴胡白芍提取液對小鼠懸尾不動時間的影響(C57BL/6小鼠)

與空白對照組比較，*P<0.05,**P<0.01

3.柴胡白芍提取液對小鼠強迫游泳不動時間的影響：柴芍高、中、低劑量組和氟西汀組對比空白對照組，可明顯縮短小鼠強迫游泳不動時間(P<0.05)，上述劑量柴胡白芍提取液可顯著改善C57BL/6小鼠的抑郁樣行為，其中以氟西汀組和柴芍低劑量組效果更好，從而說明柴胡白芍提取液有改善小鼠抑郁樣行為的作用，詳見表3。

表3 柴胡白芍提取液對小鼠強迫游泳不動時間的影響(C57BL/6小鼠)

與空白對照組比較，*P<0.05,**P<0.01

討 論

楊潔等[9]通過對比柴胡加龍骨牡蠣湯組、單味柴胡組、小柴胡類方組(去柴胡)、非小柴胡組(桂枝、茯苓、大黃、龍骨、牡蠣)發(fā)現(xiàn)，雖柴胡組、非小柴胡組都能明顯縮短小鼠懸尾不動時間，增加5-HT誘導小鼠甩頭次數(shù)，但仍以全方柴胡加龍骨牡蠣湯的抗抑郁作用更好。于春泉等[8]通過對比柴芍高、中、低劑量組，白芍高、中、低劑量組，柴胡高、中、低劑量組，空白對照組以及氟西汀組，發(fā)現(xiàn)在強迫游泳實驗和懸尾實驗中各給藥組均能明顯減少小鼠的不動時間，但柴芍高劑量組對小鼠不動時間的影響更為顯著。綜上所述，柴胡、白芍配伍使用對比柴胡、白芍單用時抗抑郁效果更明顯，且柴胡、白芍配伍使用不僅具有協(xié)同作用，還可以減少白芍單煎時有害物質(zhì)苯甲酸的量、在大鼠的腸道中柴胡皂苷可促進芍藥苷的吸收、促進白芍中芍藥苷溶出量等積極作用[11～13]。本研究中的柴胡白芍配伍比例出自明代張介賓《景岳全書》中的柴胡疏肝散，為疏肝解郁的良方，在臨床抗抑郁方面，取得了確切療效[13]。

腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)的代謝失常是抑郁癥發(fā)病機制的經(jīng)典學說[14]。目前，國際上抗抑郁的一線藥物氟西汀、地西帕就分別是5-HT和NE的再攝取抑制劑[15]。柴胡提取液和白芍提取液中發(fā)揮主要藥理作用的物質(zhì)分別為柴胡皂苷和芍藥苷[16]。戈宏焱等[16]用柴芍皂苷對抑郁大鼠進行干預后，發(fā)現(xiàn)大鼠腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的表達和腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)、高香草酸(HVA)的含量在原來下調(diào)的基礎上均有明顯的改善。此外，王靜霞等[17]通過白芍提取液干預抑郁大鼠發(fā)現(xiàn)，給藥后抑郁大鼠的行為變化顯著改善，大鼠腦內(nèi)5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素(NE)含量增加。

OFT、TST和FST是評價抗抑郁藥作用常用的3種動物模型[19，20]。OFT是一項探究小鼠自發(fā)活動和探索運動的經(jīng)典行為學實驗，常用來檢測抗抑郁和焦慮藥物。其原理是利用嚙齒類動物處于抑郁狀態(tài)時，其活動范圍會選擇相對安全的曠場箱體四周，避開相對空曠的曠場中央，當嚙齒類動物只要進入空曠的中央?yún)^(qū)域，抑郁樣情緒改變的動物，會對向箱體四周活動產(chǎn)生遲疑，進而增加了中央?yún)^(qū)域停留時間。嚙齒類動物被放置在特定的環(huán)境中由于無法逃脫，呈現(xiàn)出行為上的絕望，是懸尾和強迫游泳的實驗原理。因此該實驗選用這3種方法評價柴胡白芍提取液的對抑郁樣行為的影響，更具有科學性。

本研究通過小鼠行為絕望抑郁模型，發(fā)現(xiàn)柴芍中劑量組與氟西汀組可顯著增加小鼠在中央?yún)^(qū)域停留時間，同時柴芍各給藥組，因為劑量的差異可以不同程度的影響小鼠強迫游泳和懸尾不動時間，且各組對比空白對照組差異均有統(tǒng)計學意義，這提示柴芍提取液具有較好的抗抑郁效果。柴芍高、中、低劑量組與氟西汀組比較差異無統(tǒng)計學意義，表明利用中藥調(diào)節(jié)抑郁樣情緒與西藥有著相似的效果，利用柴胡和白芍配伍的中藥制劑治療與抑郁樣情緒相關(guān)的疾病發(fā)展前景相對良好。本研究發(fā)現(xiàn)柴芍提取液對小鼠的抑郁樣行為具有明顯的改善作用，為繼續(xù)深入研究柴芍提取液的抗抑郁作用提供了有力的支持。也為將柴胡配伍白芍發(fā)展成療效明確，質(zhì)量可控，作用機制確切的抗抑郁新藥奠定了良好的基礎。