RNAi沉默Galectin-1基因?qū)ePG2肝癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響

張暉漢 張有成 王哲元

Galectin-1在許多腫瘤中的表達(dá)水平上調(diào)，如星形細(xì)胞瘤、黑色素瘤、前列腺癌、膀胱癌、甲狀腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌等，并與其侵襲能力及惡性程度密切相關(guān)[1，2]。因此，筆者推測(cè)，Galectin-1在原發(fā)性肝癌的發(fā)生和侵襲轉(zhuǎn)移的過程同樣起重要作用。本研究用siRNA技術(shù)沉默人肝癌細(xì)胞系HePG2細(xì)胞株中Galectin-1基因的表達(dá)，從而觀察Galectin-1在肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

材料與方法

1.主要材料與試劑:人肝癌細(xì)胞系HePG2細(xì)胞株購自四川醫(yī)學(xué)中心，BLOCK-iTTMAlexa Fluor Red Fluorescent Oligo，Lipofectamine RNAiMax，Opti-MEM Reduced Serum Medium購自美國Invitrogen公司，Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit購自立陶宛(MBI)Fermentas公司，PCR熒光定量試劑盒購自上海生工生物制品有限公司，Millicell小室購自美國Millipore公司。

2.siRNA的設(shè)計(jì)與合成：針對(duì)人Galectin-1 mRNA 的Stealth RNA由美國Invitrogen Inc設(shè)計(jì)并合成(編號(hào)為HSS106024、HSS106025、HSS106026)，并采用與Stealth RNA GC含量相當(dāng)?shù)闹蠫C含量的陰性對(duì)照以排除脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞的影響。3條短雙鏈siRNA核苷酸序列分別為：HSS106024：正義鏈5′-UUGCUGUUGCACACGAUGGUGUUGG-3′，反義鏈5′-CCAACACCAUCGUGUGCAACAGCAA-3′，HSS106025：正義鏈5′-UGAUGCACACCUCUGCAACACUUCC-3′，反義鏈5′-GGAAGUGUUGCAGAGGUGUGCAUCA-3′，HSS106026：正義鏈5′-CACUCUCCAGGUUUGAGAUUCAGGU-3′，反義鏈5′-ACCUGAAUCUCAAACCUGGAGAGUG-3′。上述核苷酸序列在BLAST中進(jìn)行對(duì)比確定只有Galectin-1 mRNA是其靶點(diǎn)。

3.細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染效率的確定：人肝癌細(xì)胞系HePG2在37℃，5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，采用含10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清，100μ/ml鏈霉素和青霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞融合度達(dá)到70%左右的對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)采用脂質(zhì)體lipofectamine RNAiMax轉(zhuǎn)染試劑盒將合成的Steslth RNA轉(zhuǎn)染至人肝癌細(xì)胞系HePG2，同時(shí)陰性對(duì)照用來避免非特異性寡核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)對(duì)細(xì)胞的影響。BLOCK-iTTMAlexa Fluor Red Fluorescent Oligo用來優(yōu)化最佳siRNA與lipofectamine RNAiMax濃度比例及單細(xì)胞懸液濃度。將Lipofectamine RNAiMax與BLOCK-iTTMAlexa Fluor Red Fluorescent Oligo以不同濃度比例在細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)混勻，室溫下孵育30min，加入用10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清無抗生素高糖DMEM培養(yǎng)基稀釋HePG2單細(xì)胞懸液，37℃，5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后觀察轉(zhuǎn)染效率。每孔加入的細(xì)胞數(shù)在培養(yǎng)24h后細(xì)胞融合度達(dá)到30%～50%為宜。

4.RT-PCR檢測(cè)干擾效率：在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中用反向轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染人HePG2細(xì)胞2.5×105/ml，48h和72h后用UNlQ-10 柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取細(xì)胞總RNA，取樣進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外觀測(cè)燈下觀察28S、18S、5S 3個(gè)條帶，以確定提取的RNA的完整性。第一鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄采用Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit，合成的cDNA在Roter Gene 6000熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，并分析結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)采用20μl反應(yīng)體系，其中包括Premix 10μl，上下游引物各0.6μl，cDNA 2μl，DEPC水 6.8μl。β-actin作為內(nèi)參照。PCR引物由上海生工合成，Galectin-1上游引物：5′- AACCTGGGCAAAGACAGCAACA-3′，下游引物：5′- GCGGTTGGGGAACTTGAATTCGTA -3′，β-actin上游引物：5′- GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA -3′，下游引物：5′- GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG -3′。最終擴(kuò)增條件為：95℃變性15min，95℃ 15s，57℃ 30s，72℃ 45s，共40次循環(huán)，然后進(jìn)行溶解曲線分析，以確定無非特異性擴(kuò)增。每組樣品△Ct值計(jì)算方法為ΔCt = CtGalectin-1-Ctβ-actin， ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt空白對(duì)照組。最終實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于空白對(duì)照組Galectin-1 mRNA表達(dá)水平為 2-ΔΔCt。

5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡：在50ml標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中轉(zhuǎn)染人HepG2細(xì)胞，48h后1000r/min離心5min收集上清液中懸浮細(xì)胞，預(yù)冷PBS沖洗兩次以除去殘留血清，0.25%胰酶消化貼壁細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)105個(gè)細(xì)胞，1000r/min離心5min，保留0.5ml液體，加入預(yù)冷75%乙醇以固定細(xì)胞，4℃過夜，進(jìn)行染色檢測(cè)。

6.MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率：在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中反向轉(zhuǎn)染Stealth RNA及陰性對(duì)照48h，每孔加入5mg/ml MTT 20μl，37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4h，棄去上清液，加入DMSO 150μl，充分振蕩至結(jié)晶完全溶解，在酶標(biāo)儀490nm波長處測(cè)吸光度值A(chǔ)490nm。每組平行設(shè)4個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞增殖率計(jì)算方法為：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)組平均A490nm/空白對(duì)照組平均A490nm×100%。

7.Millicell小室細(xì)胞遷移模型檢測(cè)腫瘤細(xì)胞遷移能力：Millicell小室上室加入300μl Opti-MEM無血清培養(yǎng)基室溫靜置30min，棄去上清以水化基質(zhì)膠。在50ml標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中反向轉(zhuǎn)染人HePG2細(xì)胞48h后，0.25%胰酶消化離心收集細(xì)胞，PBS清洗兩次以除去血清的影響，Opti-MEM無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整濃度為5×105/ml。Millicell小室上室加入400μl單細(xì)胞懸液，24孔板下室內(nèi)加入含15%新生牛血清高糖DMEM培養(yǎng)基500μl，37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)12h。棉簽擦去上室細(xì)胞，3%戊二醛固定，Giemsa染色，200倍倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)中間及周邊5個(gè)視野穿透細(xì)胞數(shù)。每組平行設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。遷移率=實(shí)驗(yàn)組平均每視野透膜細(xì)胞數(shù)/空白對(duì)照組平均每視野透膜細(xì)胞數(shù)×100%。

結(jié) 果

1.轉(zhuǎn)染效率及優(yōu)化條件：本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)采用BLOCK-iTTMAlexa Fluor Red Fluorescent Oligo用來優(yōu)化最佳SiRNA與Lipofectamine RNAiMax濃度比例及單細(xì)胞懸液濃度。HepG2細(xì)胞在反向轉(zhuǎn)染24h后在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)紅色熒光信號(hào)的細(xì)胞并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)Oligo終濃度為30nmol/L，單細(xì)胞懸液濃度為105/ml時(shí)，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到90%以上。因此，以后的實(shí)驗(yàn)采用30nmol/L的siRNA和105/ml HePG2單細(xì)胞懸液為轉(zhuǎn)染條件，雞尾酒組(cocktail group)3條siRNA終濃度均為15nmol/L[3](圖1)。

圖1 HePG2紅色熒光標(biāo)記寡核苷酸轉(zhuǎn)染效果圖A.普通光鏡視野下所見(×200);B.熒光顯微鏡同一視野下(×200)所見，可見90%以上細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染，且細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變

2.siRNA顯著下調(diào)Galectin-1基因在人HePG2細(xì)胞中的表達(dá)水平：采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)Stealth RNAi后人肝癌細(xì)胞系HePG2中Galectin-1 mRNA表達(dá)水平的變化。在β-actin mRNA表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定的條件下，RNA干擾后人HePG2細(xì)胞中Galectin-1 mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)。在3條不同序列Stealth RNA中，HSS106024對(duì)人HePG2細(xì)胞中Galectin-1 mRNA表達(dá)抑制作用明顯強(qiáng)于HSS106025、HSS106026，相比之下，雞尾酒組表現(xiàn)出最強(qiáng)抑制效果，同時(shí)陰性對(duì)照組未見明顯對(duì)Galectin-1 mRNA表達(dá)的抑制作用。數(shù)據(jù)分析顯示，HSS106024 轉(zhuǎn)染48h及72h后人HePG2細(xì)胞Galectin-1 mRNA表達(dá)水平分別為空白對(duì)照組的16.3%、12.8%，雞尾酒組轉(zhuǎn)染48h及72h后Galectin-1 mRNA表達(dá)水平分別為空白對(duì)照組的12.9%、10.3%，HSS106025及HSS106026轉(zhuǎn)染48h及72h后Galectin-1 mRNA表達(dá)水平分別為空白對(duì)照組的29.5%、21.6%和30.4%、37.4%?？瞻讓?duì)照組與RNA干擾各組之間Galectin-1 mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。干擾48h及72h對(duì)HepG2細(xì)胞Galectin-1 mRNA表達(dá)水平的抑制作用差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)組采用干擾48h及雞尾酒組和HSS106024組為實(shí)驗(yàn)條件(圖2)。

圖2 RNA干擾后各組Galectin-1 mRNA表達(dá)水平比較

3.siRNA抑制Galectin-1表達(dá)明顯誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞系HePG2凋亡：流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，采用RNA干擾技術(shù)抑制Galectin-1的表達(dá)可以明顯促進(jìn)人肝癌細(xì)胞系HePG2的凋亡。其中雞尾酒組表現(xiàn)出最強(qiáng)的誘導(dǎo)HePG2細(xì)胞凋亡作用，細(xì)胞凋亡率達(dá)到31.4%，編號(hào)HSS106024 siRNA干擾組細(xì)胞凋亡率為22.5%，陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為1.6%，空白對(duì)照組未見明顯細(xì)胞凋亡(圖3)。

4.RNAi抑制Galectin-1表達(dá)可抑制人肝癌細(xì)胞系HePG2增殖：MTT法結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組490nm波長處吸光度值A(chǔ)490nm明顯小于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.01)，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，HSS106024和雞尾酒組細(xì)胞增殖率分別為54.6%和54.0%(表1)。

5.RNAi抑制Galectin-1表達(dá)降低人肝癌細(xì)胞系HePG2遷移能力：Millicelll小室細(xì)胞遷移模型結(jié)果顯示，RNAi抑制Galectin-1在人肝癌細(xì)胞系HePG2中的表達(dá)可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞的遷移能力，空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組平均每高倍視野下透膜細(xì)胞數(shù)124.27±12.05，117.80±10.60明顯高于HSS106024和雞尾酒組65.00±5.53，63.33±5.72，實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

討 論

隨著對(duì)半乳糖凝集素家族成員研究的廣泛展開，其生物學(xué)活性，尤其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的重要作用日益受到研究人員的重視[4]。Galctin-1作為半乳糖凝集素家族中的成員之一，廣泛存在于多種腫瘤組織和細(xì)胞中，并呈高表達(dá)狀態(tài)，通過細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑參于腫瘤細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展的各個(gè)過程，如腫瘤細(xì)胞的黏附、增殖、遷移、侵襲、凋亡等過程[2，5～9]。

圖3 RNA干擾48h后各組細(xì)胞凋亡率各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，經(jīng)PI(碘化丙啶)染色后流式細(xì)胞儀法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，試劑盒采用Annexin V加PI的雙重染試劑盒

表1 RNA干擾48h后HePG2細(xì)胞增殖能力的比較

表2 RNA干擾48h后對(duì)HePG2細(xì)胞遷移能力的影響

兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，與空白對(duì)照組比較，P<0.05

已有研究表明，Galectin-1在肝癌原發(fā)灶組織中表達(dá)水平明顯增高[10]。然而，Galectin-1在肝癌細(xì)胞中表達(dá)水平升高是否與肝癌的生物學(xué)行為有關(guān)尚不清楚。筆者推測(cè)Galectin-1可能參與了肝細(xì)胞癌的凋亡或侵襲過程。本研究設(shè)計(jì)了針對(duì)Galectin-1基因的siRNA，并將后者用于肝細(xì)胞癌HePG2的Galectin-1的沉默，結(jié)果表明，用siRNA轉(zhuǎn)染并沉默Galectin-1基因的表達(dá)(89.7%)是完全可行的。說明通過RNA干擾技術(shù)可以探索Galectin-1在肝癌發(fā)生、發(fā)展中所發(fā)揮的作用。

根據(jù)本研究結(jié)果，人肝癌細(xì)胞系HePG2在轉(zhuǎn)染了針對(duì)Galectin-1 mRNA 的短雙鏈siRNA后，其細(xì)胞內(nèi)Galectin-1 mRNA表達(dá)明顯受到抑制，且HePG2細(xì)胞的凋亡明顯增加。Galectin-1能夠激活Ras，是Ras信號(hào)途徑的一個(gè)調(diào)節(jié)因子，而Ras的激活可以導(dǎo)致細(xì)胞增殖、衰老和死亡等不同的生物學(xué)效應(yīng)。另外，關(guān)于肝細(xì)胞性肝癌細(xì)胞系(HePG2)的體外研究證實(shí)，Galectin-1有助于促進(jìn)肝細(xì)胞性肝癌中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程，TCF4/LEF1轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)被認(rèn)為可能與這一作用有關(guān)[11]。因此，Galectin-1對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡可能存在雙向調(diào)節(jié)作用，其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

筆者還觀察到，RNA干擾技術(shù)抑制人肝癌細(xì)胞系HePG2細(xì)胞中Galectin-1 mRNA表達(dá)后，其增殖和遷移能力同時(shí)受到抑制。在宮頸癌中，Kim等研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用反義mRNA或siRNA抑制Galectin-1的活性可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。Toussaint等[12]關(guān)于Galectin-1的體外實(shí)驗(yàn)表明，它可以增強(qiáng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的遷移和侵襲能力，而患者Galectin-1高表達(dá)者也更易浸潤、預(yù)后更差。因此，推測(cè)內(nèi)源性Galectin-1可能具有促進(jìn)細(xì)胞增殖活性的作用。研究表明，在腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤微環(huán)境中，Galectin-1可以促進(jìn)髓系來源抑制細(xì)胞的蓄積以及促血管生成環(huán)境的形成[13]。研究還表明，Galectin-1可能參與腫瘤轉(zhuǎn)移的細(xì)胞黏附、聚集、新生血管形成等多個(gè)過程。半乳糖凝集素家族可以和細(xì)胞膜表面參與信號(hào)識(shí)別的半乳糖苷結(jié)合，它們可能通過此途徑調(diào)節(jié)相鄰腫瘤細(xì)胞間或腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的黏附能力；Galectin-1可以增加前列腺癌和卵巢癌細(xì)胞系與細(xì)胞外基質(zhì)間的黏附能力[14，15]。Jouve等[16]研究表明，Galectin-1可以介導(dǎo)胃癌內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。Laderach等[15]的體外實(shí)驗(yàn)證明Galectin-1在與腫瘤相關(guān)的微血管中上調(diào)，并且可以調(diào)節(jié)腫瘤與與血管內(nèi)皮細(xì)胞間的相互作用。另外，有研究表明，抗血管內(nèi)皮生長因子可以用于治療腫瘤，主要是是通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分泌Galectin-1，炎性因子及低氧環(huán)境可促進(jìn)這一過程的發(fā)生。因此可以認(rèn)為，Galectin-1可能是參與腫瘤新生血管形成的一個(gè)重要因素。

綜上所述，利用RNA干擾技術(shù)抑制人肝癌細(xì)胞系HePG2Galectin-1 基因的表達(dá)，可以顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，同時(shí)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力。鑒于Galectin-1在多種腫瘤組織或細(xì)胞中高表達(dá)，并且在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，使其可能成為多種腫瘤分子靶向治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。