USP14在結直腸癌中的表達及臨床意義

韓秋月 章 霞 章文龍 張堅剛 周文君 林愛芬

結直腸癌是常見惡性腫瘤之一，男性發(fā)生率居第三位，女性發(fā)生率居第二位[1]。近年來，結直腸癌治療已經(jīng)取得重大進展，但治愈率和長期生存率幾乎沒有變化，仍存在諸多問題，如早期診斷缺乏特異性標志物、轉移風險高、缺乏有效治療的特異性靶點等[2]。泛素特異性蛋白酶14(ubiquitin-specific protease 14，USP14)由494個氨基酸組成，相對分子質量約為56 kDa，主要分布于細胞質和細胞膜[3]。USP14含有一個N端UBL結構域，與USP14和蛋白酶體之間的結合有關[4]。本研究利用免疫組化法檢測結直腸癌組織中USP14表達情況及分析其與臨床病理參數(shù)的相關性，進一步分析USP14與結直腸癌患者預后關系，探討USP14在結直腸癌中的作用。

材料與方法

1.標本收集：選取2005年9月～2011年8月浙江省臺州醫(yī)院確診并行結直腸癌根治術患者腫瘤組織樣本225例及對應的正常組織225例，經(jīng)石蠟包埋后儲存于浙江省臺州醫(yī)院生物資源中心。其中，男性122例，女性103例，患者年齡28～90歲，平均年齡63歲。病理分期按AJCC第7版制定的TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期126例，Ⅲ～Ⅳ期99例。所有患者術前均未進行放化療、藥物等治療。所有標本均已取得患者知情同意，并通過浙江省臺州醫(yī)院倫理學委員會審核。

2.主要試劑和方法：兔抗人多克隆抗體USP14購于美國Sigma公司，采用免疫組化法檢測結直腸癌組織及對應遠端正常組織中USP14表達情況。切片后，60℃烘烤過夜，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化。3%過氧化氫孵育15min，0.01mol/L枸櫞酸鹽(pH值6.0)高壓熱修復。1%BSA封閉非特異性抗原，USP14抗體4℃孵育過夜，過氧化物酶標記的抗兔第二抗體37℃孵育30min。DAB顯色，蘇木精復染。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，閱片。其中，肺癌組織作為陽性對照，TBS溶液替代USP14抗體作為實驗陰性對照。

3.判斷標準：免疫組化結果分別由兩名病理科醫(yī)生進行閱片。以淡黃色至棕黃色染色為陽性，結果按照陽性細胞百分比進行評分。隨機選擇10個高倍鏡視野，計算陽性細胞百分數(shù)。陽性細胞數(shù)<5%為陰性，陽性細胞數(shù)≥5%為陽性。

4.統(tǒng)計學方法：采用SPSS 23.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用χ2檢驗分析USP14表達和臨床病理參數(shù)相關性，Kaplan-Meier法用于生存分析，COX回歸模型用于多因素分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1. 結直腸癌組織中USP14的表達情況：USP14表達于細胞質內(圖1)。結直腸癌組織中USP14表達率為67.6%(152/225)，正常組織中表達率為42.2%(95/225)。結直腸癌組織中USP14表達顯著高于正常組織(χ2=11.62，P<0.05)。

圖1 結直腸癌組織USP14表達結果(免疫組化，×400)A.結直腸癌組織陽性表達；B.結直腸癌組織陰性表達；C.正常組織陽性表達；D.正常組織陰性表達

2.USP14表達和臨床病理參數(shù)相關性：USP14表達與臨床病理參數(shù)分析表明，其與性別(χ2=0.205，P=0.651)、年齡(χ2=1.274，P=0.259)、遠處轉移(χ2=0.739，P=0.390)、TNM分期(χ2=3.082，P=0.079)均無顯著相關性(表1)。

表1 USP14表達與臨床病理參數(shù)相關性

3.USP14表達與結直腸癌患者預后的關系：225例結直腸癌患者進行生存分析表明，USP14表達陽性患者的平均生存時間63.78個月(95% CI：57.37～70.19個月)，USP14表達陰性的患者平均生存時間83.09個月(95% CI：75.40～90.78個月)。USP14陽性患者生存時間明顯短于陰性患者，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=8.664，P=0.003，圖2)。

圖2 結直腸癌患者USP14表達Kaplan-Meier生存分析

為進一步分析USP14表達與患者預后關系，采用COX比例風險模型分析。單變量分析結果表明USP14表達(陽性vs陰性，HR=2.310，P=0.001)和TNM分期(Ⅲ～Ⅳ期 vs Ⅰ～Ⅱ期，HR=3.377，P=0.000)與患者不良預后顯著相關。多變量分析結果顯示USP14表達(HR=2.213，P=0.002)和TNM分期(HR=3.237，P=0.000)可作為結直腸癌患者的獨立預后因子(表2)。

討 論

蛋白質穩(wěn)態(tài)是調控多種細胞功能的關鍵。細胞中有兩大系統(tǒng)負責調控蛋白質降解，即泛素蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)和溶酶體系統(tǒng)。泛素蛋白酶體系統(tǒng)包含泛素活化酶(ubiquitin-activating enzyme，E1)、泛素結合酶(ubiquitin-conjugating enzyme，E2)、泛素連接酶(ubiquitin-protein ligating enzyme，E3)及26S蛋白酶體。泛素連接酶將泛素單體與其靶蛋白的賴氨酸殘基通過共價鍵連接，也可通過將泛素單體逐一連接到前一個泛素分子的7個內部賴氨酸殘基(K6/K11/K27/K29/K33/K48/K63)上，將單泛素鏈轉化為多聚泛素鏈。而去泛素化酶可以從目標蛋白上分解這些單肽和多肽鏈[5]。研究表明，去泛素化酶通過穩(wěn)定關鍵蛋白，在惡性細胞的增殖、運動和耐藥中發(fā)揮重要作用[6]。哺乳動物蛋白酶體與3個重要的去泛素化酶相關：RPN11、UCH37、USP14[7]。RPN11是19S調控元件亞基，UCH37和USP14可與19S蛋白酶體可逆結合[8]。

USP14屬于泛素特異性蛋白酶家族，其編碼基因位于第18號染色體短臂18p11.32區(qū)，是靠近端粒處的功能基因，對機體生命過程具有重要作用。在真核細胞中，26S蛋白酶體是蛋白質降解的主要位點。哺乳動物細胞26S蛋白酶體中，USP14約占10%～20%。雖然只有一小部分的19S顆粒含有USP14，但細胞中絕大多數(shù)USP14都與蛋白酶體結合[9]。USP14參與體內蛋白質降解的調控，參與惡性腫瘤進展，但其具體作用機制還未完全闡明。

USP14是哺乳動物中高度保守的去泛素化酶，因其在多種腫瘤中的高表達和重要作用而受到越來越多的關注。Tian等[8]研究發(fā)現(xiàn)USP14在多發(fā)性骨髓瘤細胞中高表達，b-AP15處理多發(fā)性骨髓瘤細胞可有效抑制USP14，阻斷細胞周期進程，誘導多發(fā)性骨髓瘤細胞凋亡。USP14在上皮性卵巢癌組織中USP14表達水平明顯升高，與腫瘤分級、腫瘤階段、淋巴結轉移相關，與Ki-67表達呈正相關，USP14沉默可抑制上皮性卵巢癌細胞增殖并誘導細胞凋亡[10]。研究發(fā)現(xiàn)USP14在乳腺癌組織中高表達，其主要分布于乳腺癌細胞的細胞質中，與組織學分級、淋巴結轉移相關[11]。USP14在非小細胞肺癌細胞中表達上調，尤其是在腺癌細胞中[12]。與鄰近非腫瘤組織比較，食管鱗癌組織在RNA水平和蛋白水平上均出現(xiàn)USP14過表達，USP14表達與遠處轉移相關[13]。肝癌組織中USP14表達水平顯著高于正常肝組織中USP14表達水平，其過表達可促進肝癌細胞增殖，抑制細胞凋亡，進而促進肝癌進展[14]。Ishiwata等[15]在結腸癌組織中發(fā)現(xiàn)USP14表達水平高于正常組織。

本研究采用免疫組化分析USP14在結直腸癌中的表達情況，研究顯示結直腸癌腫瘤組織中USP14表達顯著高于正常組織，USP14表達與性別、年齡、遠處轉移、TNM分期無顯著相關，生存分析發(fā)現(xiàn)USP14表達陽性患者預后較差，可作為結直腸癌預后的獨立危險因素。而Shinji等[16]研究表明結直腸癌患者USP14表達水平并不高，18.2%(18/99)患者為高表達，81.8%(81/99)為低表達，USP14表達與淋巴結轉移情況、肝轉移情況、TNM分期相關。這可能是由于本研究將結直腸癌組織USP14表達情況分為陰性和陽性兩組。判斷標準為陽性細胞數(shù)< 5%為“-”，陽性細胞數(shù)≥5%為陽性。而Shinji等[16]研究中“-”為未檢測到USP14表達；“±”為弱于或與正常組織上皮細胞顯色強度相當；“+”為顯色強度強于正常組織上皮細胞。統(tǒng)計分析時將“-”組和“±”組歸為低表達組，“+”歸為高表達組。這可能是導致本研究與該文章統(tǒng)計結果差異的原因。

以往研究表明，USP14表達與患者生存率密切相關，USP14表達陽性患者預后較差[10～14]。Wang等[10]研究發(fā)現(xiàn)上皮性卵巢癌患者中USP14高表達與生存時間短顯著相關，提示USP14可作為卵巢癌患者預后指標。Zhu等[11]研究表明，USP14高表達的乳腺癌患者生存期明顯縮短，USP14表達沉默可以抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移，誘導細胞凋亡，淋巴結轉移、USP14表達、Ki-67表達是患者整體生存的獨立預后指標。Wu等[12]研究發(fā)現(xiàn)USP14沉默可抑制細胞生長和細胞周期，并伴隨著β-catenin蛋白質水平大幅下降，肺腺癌患者USP14表達與生存期相關。Zhang等[13]研究發(fā)現(xiàn)USP14過表達與食管鱗癌患者整體生存率降低有關，表明USP14是總體生存的獨立危險因素。Ying等[17]研究發(fā)現(xiàn)USP14高表達與胃癌患者不良預后相關，USP14表達水平是胃癌患者獨立預后因子。此外，USP14沉默促進p-ERK和p-Akt蛋白酶體降解，從而阻斷Akt和ERK信號通路，增加胃癌細胞對順鉑敏感度。與上述研究一致，本研究生存分析結果表明，相比于USP14陰性患者，USP14陽性患者的總體生存時間明顯縮短。進一步COX比例風險回歸分析發(fā)現(xiàn)，USP14表達和TNM分期可作為結直腸癌患者的獨立預后因素。

綜上所述，本研究USP14在結直腸癌中的表達和臨床意義，研究表明USP14表達在結直腸癌發(fā)展中發(fā)揮重要作用，且USP14表達與預后相關，是結直腸癌患者獨立預后指標，對結直腸癌預后判斷具有重要價值。