下調(diào)CD36在心肌中的表達(dá)對肥胖小鼠心肌纖維化和凋亡的影響

陶 靜 錢潤芳 陳俊婷 周佳莉 夏 巍 張逸杰

肥胖是一種慢性代謝性疾病，主要表現(xiàn)為體脂含量的增加，其發(fā)生率在全球均呈上升趨勢。臨床上通常將體重指數(shù)>30kg/m2定義為肥胖。世界衛(wèi)生組織(WHO)的調(diào)查報告顯示，當(dāng)前全球約有5億肥胖癥患者[1]。該疾病已超越營養(yǎng)不良，成為全球成年人最大的慢性健康問題[2]。雖然我國肥胖的發(fā)生率低于美國、英國等發(fā)達(dá)國家，但由于人口基數(shù)大，患病人群的絕對數(shù)量僅次于美國，居世界第2位[3]。病理性肥胖是導(dǎo)致勞力喪失和死亡的主要原因之一，不僅影響到成人，而且影響到兒童和青少年[2]。

肥胖與心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)，是高血壓、冠心病、2型糖尿病等疾病的高風(fēng)險因素，其患病人群多合并高脂血癥、胰島素抵抗等代謝紊亂，可引起不同器官的病理改變[4～6]。即使排除其他心血管病危險因素，肥胖患者心肌也可出現(xiàn)廣泛病變而導(dǎo)致心臟重構(gòu)，表現(xiàn)為從舒張性心力衰竭(以下簡稱心衰)到收縮性心衰的演變[7]。

心肌細(xì)胞在生理狀態(tài)時主要通過脂肪酸(fatty acids, FA)的β氧化及葡萄糖的有氧氧化供能。肥胖或糖尿病時，機(jī)體發(fā)生胰島素抵抗，心肌細(xì)胞對葡萄糖的利用率降低，更加依賴FA的β氧化供能，對FA的轉(zhuǎn)運及利用效率均提升[8]。這種能量代謝譜的改變使得心肌內(nèi)有害脂質(zhì)蓄積、代謝副產(chǎn)物生成增多，通過脂毒性效應(yīng)及氧化應(yīng)激損傷，介導(dǎo)心肌纖維化、心肌細(xì)胞凋亡及鈣調(diào)控異常等一系列病理改變，最終導(dǎo)致肥胖性心肌病[9～11]。因此，改變肥胖狀態(tài)下心肌細(xì)胞FA的代謝率，可能成為治療肥胖性心肌病的一種策略。

脂肪酸轉(zhuǎn)位酶又稱為CD36，是FA分解代謝過程中的限速酶，分布于心肌細(xì)胞膜上及胞質(zhì)中。位于細(xì)胞膜上的CD36負(fù)責(zé)將FA轉(zhuǎn)運入胞參與β氧化。肥胖或糖尿病時，胞質(zhì)中的CD36可轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜，導(dǎo)致更多的FA攝取入胞參與氧化供能[12]。本研究假設(shè)下調(diào)肥胖小鼠心肌CD36的表達(dá)可降低FA代謝率，改善心肌能量代謝紊亂，進(jìn)而抑制心肌纖維化，降低心肌細(xì)胞凋亡率。為驗證該假設(shè)，筆者構(gòu)建了靶向小鼠CD36的重組慢病毒，通過RNA干擾下調(diào)其在心肌組織中的表達(dá)。

材料與方法

1.實驗動物及研究方案:本實驗與此前已發(fā)表的研究共用同一批實驗動物，詳見參考文獻(xiàn)[10]：4周齡的雄性SPF級C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為3組,即正常對照(N-mock)組、肥胖對照(O-mock)組和肥胖干預(yù)(O-CD36)組。研究方案見圖1。小鼠4周齡時，依據(jù)分組給予相應(yīng)的喂養(yǎng)方案；6周齡時，通過向小鼠心肌內(nèi)注射不同的慢病毒以下調(diào)目標(biāo)基因的表達(dá)；16周齡時，處死取材，獲取左心室組織用于心肌纖維化及凋亡相關(guān)指標(biāo)檢測。所有操作均遵循 “3R原則”。

圖1 研究方案小鼠自斷乳后給予正常飲食，4周齡起根據(jù)分組給予不同的飲食方案，6周齡時通過向心肌內(nèi)注射不同的慢病毒以下調(diào)目標(biāo)基因的表達(dá)，16周齡時處死取材完成心肌纖維化和凋亡相關(guān)指標(biāo)檢測

2.儀器與試劑:實驗用到的儀器包括病理切片機(jī)(RM 2016，德國Leica公司)、正置明場顯微鏡(Eclipse Ci-E，日本Nikon公司)、實時定量PCR儀(CFX96，美國Bio-Rad公司)等。主要試劑包括SYBR Green試劑盒(FP205，北京天根生化科技有限公司)、CD36一抗(sc-9154，美國Santa Cruz公司)、GAPDH一抗(CW0100A，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)、caspase-8一抗(66093-1-AP，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)、caspase-12一抗(Ab62484，英國Abcam公司)、CHOP一抗(2895，美國CST公司)、β-actin一抗(BM0627，武漢博士德生物工程有限公司)、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(11684817910，瑞士Roche Applied Science公司)。

3.慢病毒制備:分別構(gòu)建靶向小鼠CD36及綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的重組慢病毒用于心肌內(nèi)注射。其中，CD36為本研究中RNA干擾的目標(biāo)基因，GFP則作為對照，慢病毒靶點序列詳見參考文獻(xiàn)[10]。

4.心肌內(nèi)注射介導(dǎo)靶向心肌的RNA干擾：心肌內(nèi)注射的方法參照本課題組已建立的方法學(xué)，在不斷肋開胸的情況下，使用微量注射針向每只小鼠左心室肌內(nèi)注射10μl慢病毒[13]。

5.實時熒光定量RT-PCR：取小鼠左心室組織，提取總RNA后合成cDNA，再按照SYBR Green說明書進(jìn)行real-time RT-PCR。選取GAPDH作為內(nèi)參，引物序列如下：TGF-β1正向引物：5′-TTGCTTCAGCTCCACAGAGA-3′，反向引物：5′-TGGTTGTAGAGGGCAAGGAC-3′；TGF-β2正向引物：5′-TGAGTCACAACAGACCAACC-3′，反向引物：5′-TCAATGTAAAGTGGACGTAGGC-3′；CTGF正向引物：5′-GGAAGACACATTTGGCCCAG-3′，反向引物:5′-TAGGTGTCCGGATGCACTTT-3′；Col-Ⅰ正向引物:5′-GGCAAAGATGGAGAAGCTGG-3′，反向引物:5′-GGAAACCTCTCTCGCCTCTT-3′；Col-Ⅲ正向引物:5′-ACGTCCTGGTGAAGTTGGTC-3′，反向引物:5′-CAGGGAAGCCTCTTTCTCCT-3′；GAPDH正向引物:5′-CTCATGACCACAGTCCATGC-3′，反向引物:5′-GGATGACCTTGCCCACAGCC-3′。

6.Western blot法:取小鼠左心室組織，提取總蛋白并進(jìn)行蛋白定量，經(jīng)SDS-PAGE分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，再經(jīng)一抗、二抗孵育，顯影及定影，最終獲得凝膠圖像。實驗中的一抗?jié)舛确謩e為caspase-8 1∶2000，caspase-12 1∶1000，CHOP 1∶1000，β-actin 1∶200，采用Image J軟件分析凝膠圖像。

7.Masson染色檢測心肌纖維化:Masson染色心肌組織可使膠原纖維呈藍(lán)色，肌纖維呈紅色，常用于檢測心肌纖維化程度。取小鼠左心室前壁心肌組織固定后制作石蠟切片(4μm)，經(jīng)蘇木精、麗春紅、苯胺藍(lán)順序染色，明場下200倍隨機(jī)拍照，并用Image-Pro Plus 6.0分析膠原纖維的相對著色面積，以反映心肌中膠原含量。

8.TUNEL法分析心肌細(xì)胞凋亡率:細(xì)胞凋亡時，胞內(nèi)的DNA碎裂成片段，TUNEL法可有效探測DNA片段的產(chǎn)生，使凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)棕褐色。取小鼠左心室組織制作石蠟切片(4μm)，行TUNEL染色，明場下400倍隨機(jī)拍照，人工計數(shù)TUNEL陽性細(xì)胞的比例，以評估心肌細(xì)胞凋亡率。

結(jié) 果

1.高脂飲食成功誘導(dǎo)小鼠肥胖模型:經(jīng)過12周的高脂喂養(yǎng)，O-mock小鼠和O-CD36小鼠的體重較正常飲食的N-mock小鼠顯著增加，具體數(shù)據(jù)詳見本課題組前期論文[10]。

2.RNA干擾下調(diào)了CD36在肥胖小鼠心肌中的表達(dá):real-time RT-PCR和Western blot法的結(jié)果提示，高脂飲食對小鼠心肌組織中CD36的表達(dá)無明顯影響，RNA干擾顯著下調(diào)了CD36的mRNA和蛋白表達(dá)，詳見本課題組前期論文[10]。

3.下調(diào)CD36的表達(dá)改善了高脂飲食相關(guān)的心肌纖維化：心臟重構(gòu)是心衰的基本病理生理機(jī)制，而纖維化是心臟重構(gòu)的重要表現(xiàn)。經(jīng)12周的高脂飲食，肥胖小鼠心肌組織中膠原纖維的面積占比顯著增加(O-mock 6.36%±1.31% vs N-mock 2.88%±0.49%，P<0.01)，下調(diào)CD36的表達(dá)減少了心肌膠原纖維的含量(O-CD36 4.54%±0.41% vs O-mock 6.36%±1.31%，P<0.05)，但未降至正常水平(O-CD36 4.54%±0.41% vs N-mock 2.88%±0.49%，P<0.05；圖2中A、B)。RT-PCR的結(jié)果提示，高脂飲食引起小鼠心肌組織中纖維化相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平均顯著增加：TGF-β1(O-mock 1.44±0.18 vs N-mock 1.00±0.15，P<0.05)，TGF-β2(O-mock 3.59±0.25 vs N-mock 1.00±0.09，P<0.01)，CTGF(O-mock 2.96±0.27 vs N-mock 1.00±0.14，P<0.01)，Col-Ⅰ(O-mock 2.32±0.50 vs N-mock 1.00±0.33，P<0.05)，Col-Ⅲ(O-mock 1.88±0.25 vs N-mock 1.00±0.18，P<0.05)；下調(diào)CD36的表達(dá)減輕甚至逆轉(zhuǎn)了高脂飲食所引起的上述改變：TGF-β1(O-CD36 1.15±0.15 vs O-mock 1.44±0.18，P<0.05)，TGF-β2(O-CD36 1.54±0.21 vs O-mock 3.59±0.25，P<0.01)，CTGF(O-CD36 0.95±0.20 vs O-mock 2.96±0.27，P<0.01)，Col-Ⅰ(O-CD36 1.11±0.29 vs O-mock 2.32±0.50，P<0.05)，Col-Ⅲ(O-CD36 1.08±0.11 vs O-mock 1.88±0.25，P<0.05；圖2中C～G)。

圖2 心肌組織纖維化指標(biāo)檢測A.取小鼠左心室組織石蠟包埋后連續(xù)切片，分別行HE染色和Masson染色，同一視野下的代表性圖片(×200)，Masson染色使膠原纖維呈藍(lán)色，肌纖維呈紅色，標(biāo)尺=200μm；B.Masson染色下，膠原纖維占心室組織切片總面積的比值(每組n=4，每只小鼠分析4～5個視野)；C～G：使用RT-PCR檢測小鼠左心室組織中各種纖維化標(biāo)志物的mRNA表達(dá)水平(每組n=3)；*P<0.05，**P<0.01

4.下調(diào)CD36的表達(dá)減輕了肥胖導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡:心肌細(xì)胞是不可再生細(xì)胞，其凋亡使得參與做功的心肌細(xì)胞絕對數(shù)量減少，將促進(jìn)心臟重構(gòu)的發(fā)生、發(fā)展。TUNEL染色的結(jié)果提示，肥胖引起小鼠心肌細(xì)胞凋亡率增加(O-mock 3.76%±0.44% vs N-mock 0.54%±0.35%，P<0.01)，下調(diào)CD36的表達(dá)減輕了心肌細(xì)胞凋亡率(O-CD36 2.14%±0.40% vs O-mock 3.76%±0.44%，P<0.01)，但未完全降至正常水平(O-CD36 2.14%±0.40% vs N-mock 0.54%±0.35%，P<0.01；圖3中A、C)。Western blot法檢測結(jié)果提示，肥胖小鼠心肌組織內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)上調(diào)：caspase-8(O-mock 1.94±0.26 vs N-mock 1.00±0.21，P<0.05)，caspase-12(O-mock 1.74±0.18 vs N-mock 1.00±0.12，P<0.01)，CHOP(O-mock 3.14±0.48 vs N-mock 1.00±0.22，P<0.01)；下調(diào)肥胖小鼠心肌CD36的表達(dá)改善甚至逆轉(zhuǎn)了上述異常：caspase-8(O-CD36 1.21±0.25 vs O-mock 1.94±0.26，P<0.05)，caspase-12(O-CD36 0.99±0.20 vs O-mock 1.74±0.18，P<0.01)，CHOP(O-CD36 1.80±0.22 vs O-mock 3.14±0.48，P<0.01，圖3中B、D～F)。

圖3 心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)檢測A.小鼠TUNEL染色左心室組織切片(×400)，凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)棕褐色，標(biāo)尺=100μm；B.Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白，以β-actin作為內(nèi)參；C.TUNEL陽性細(xì)胞占心肌細(xì)胞總數(shù)的比率(每組n=4，每只小鼠分析4～5個視野)；D～F.Western blot法定量分析結(jié)果顯示各種凋亡相關(guān)基因的蛋白表達(dá)水平；*P<0.05，**P<0.01

討 論

包括本課題組前期研究在內(nèi)的大量資料表明，肥胖或糖尿病時，機(jī)體發(fā)生胰島素抵抗，心肌細(xì)胞對葡萄糖利用率降低，更加依賴FA氧化供能，這種能量代謝譜的轉(zhuǎn)變引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、鈣調(diào)控異常、線粒體超微結(jié)構(gòu)改變等一系列病理生理效應(yīng)，最終影響心肌的舒縮功能而導(dǎo)致心臟重構(gòu)[8～11,14,15]。肥胖性心肌病患者早期常表現(xiàn)為射血分?jǐn)?shù)保留型心衰(HFpEF)，又稱舒張功能不全，主要表現(xiàn)為左心室順應(yīng)性下降及僵硬度增加[4]。纖維化是HFpEF時常見的病理改變。然而，高脂飲食在誘導(dǎo)機(jī)體肥胖的同時是否促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)生尚不清楚；此外，心臟重構(gòu)往往涉及心肌細(xì)胞凋亡，因而本實驗將凋亡相關(guān)指標(biāo)也納為研究內(nèi)容。

本研究旨在通過下調(diào)肥胖小鼠CD36表達(dá)，減少其所介導(dǎo)的心肌FA高代謝率，并觀察此干預(yù)對纖維化及凋亡的影響。筆者的前期研究已經(jīng)證實，高脂飲食可成功誘導(dǎo)小鼠肥胖模型，而慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾可顯著下調(diào)肥胖小鼠心肌中CD36的表達(dá)[10]。

Masson染色證實，肥胖引起心肌組織膠原纖維的含量顯著增加；TGF-β1、CTGF、Col-Ⅰ等纖維化標(biāo)志物的mRNA表達(dá)上調(diào)也支持該結(jié)論。下調(diào)CD36的表達(dá)雖未完全逆轉(zhuǎn)，但顯著改善心肌纖維化程度；與之相印證，心肌纖維化標(biāo)志物的mRNA表達(dá)也相應(yīng)下調(diào)(圖2)。TUNEL染色的結(jié)果提示，高脂飲食導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡率增加，并引起caspase-8、caspase-12、CHOP等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)上調(diào)；干擾CD36在心肌中的表達(dá)減輕甚至逆轉(zhuǎn)了上述異常(圖3)。

現(xiàn)有研究表明，肥胖導(dǎo)致心肌纖維化可能有多種機(jī)制參與：(1)心肌細(xì)胞過度依賴FA氧化供能，代謝副產(chǎn)物活性氧簇生成增多，通過氧化應(yīng)激損傷肌質(zhì)網(wǎng)，后者攝取和釋放鈣離子的能力是引起心肌細(xì)胞舒張和收縮的關(guān)鍵因素，肌質(zhì)網(wǎng)鈣調(diào)控異常及胞質(zhì)內(nèi)鈣超載將損害左心室舒張和收縮功能，促進(jìn)心肌纖維化[16]。(2)肥胖導(dǎo)致機(jī)體血管床面積增大，交感神經(jīng)興奮并激活RAAS系統(tǒng)，引起水鈉潴留，左心室容量和壓力負(fù)荷均增加，介導(dǎo)心室重塑和心肌纖維化。(3)神經(jīng)體液因子激活，介導(dǎo)炎性反應(yīng)引起心肌損傷，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖加劇心肌纖維化[17]。(4)脂肪細(xì)胞相對缺氧，促進(jìn)免疫細(xì)胞的遷移和激活，促進(jìn)脂肪組織纖維化，后者與心肌纖維化密切相關(guān)[18]。(5)分子機(jī)制，包括GSK-3β的表達(dá)下調(diào)，TGF-β、內(nèi)皮素1、晚期糖基化終產(chǎn)物、基質(zhì)細(xì)胞蛋白上調(diào)也在纖維化的發(fā)生中起重要作用[11]。本課題組的前期研究證實，下調(diào)CD36的表達(dá)可顯著抑制肥胖小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧簇的生成，并改善心肌細(xì)胞鈣調(diào)控異常[10，14]。因此，干擾CD36的表達(dá)以改善肥胖所導(dǎo)致的心肌纖維化，有其理論基礎(chǔ)。

衰老是引起心肌纖維化的另一個重要因素，筆者的研究周期僅12周，雖然肥胖小鼠已表現(xiàn)出纖維化的趨勢，但整體程度并不強(qiáng)烈(纖維化面積占比6.36%)，如果延長飼養(yǎng)周期，心肌纖維化的程度可能更加明顯。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯合成以及鈣離子儲存的場所，對細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)起調(diào)節(jié)作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激實質(zhì)上是細(xì)胞對外界有害刺激的一種應(yīng)答，其最終結(jié)果是對刺激的適應(yīng)或凋亡[19]。當(dāng)有害刺激持續(xù)，超出細(xì)胞的調(diào)節(jié)能力時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激將經(jīng)由CHOP、caspase-12、JNK 3條途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20]。肥胖時心肌內(nèi)活性氧簇的過度生成可損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并介導(dǎo)凋亡。本研究結(jié)果亦證實，肥胖導(dǎo)致CHOP和caspase-12的表達(dá)上調(diào)，心肌細(xì)胞凋亡率增加，下調(diào)CD36的表達(dá)從起始環(huán)節(jié)抑制活性氧簇的生成，減少了心肌細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，CD36在肥胖所致的心臟重構(gòu)中起重要作用，下調(diào)CD36的表達(dá)可改善心肌纖維化，減少心肌細(xì)胞凋亡，是一種潛在的治療代謝性心臟重構(gòu)的有效手段。