器官移植生物樣本庫建設實踐指南（全文）

全國生物樣本標準化技術委員會，中華醫(yī)學會器官移植學分會，醫(yī)藥生物技術協(xié)會組織生物樣本庫分會，中國生物樣本庫聯(lián)盟，全國生物樣本標準化技術委員會器官移植工作組，中國醫(yī)藥生物技術協(xié)會組織生物樣本庫分會器官移植學組

器官移植經(jīng)過半個多世紀的不斷發(fā)展，已經(jīng)成為治療各種終末期疾病最為有效的手段［1］。我國器官移植總量位于世界第二，國內(nèi)已批準開展器官移植手術的醫(yī)院有173家，涉及的移植器官包括肝臟、腎臟、心臟、肺臟、小腸、胰腺、胰島細胞等［2］。器官移植領域中存在的眾多科學問題需要借助豐富和高質(zhì)量的生物樣本進行研究，建設規(guī)范化生物樣本庫有助于保障生物樣本質(zhì)量，發(fā)揮樣本資源價值［3］。我國生物樣本庫在《中國醫(yī)藥生物技術協(xié)會生物樣本庫標準（試行）》《ISBER生物樣本庫最佳實踐2012》等標準的指導下健康發(fā)展［4］，眾多具有專業(yè)特色的生物樣本庫應運而生［5］。目前，國內(nèi)眾多從事器官移植醫(yī)院相繼開展了生物樣本資源保存工作，但是國內(nèi)外尚無針對器官移植生物樣本庫建設的指導性文件，不利于器官移植生物樣本庫的規(guī)范化建設。為此，由“中華醫(yī)學會器官移植學分會”“中國醫(yī)藥生物技術協(xié)會組織生物樣本庫分會器官移植學組”、“中國生物樣本庫聯(lián)盟”和“全國生物樣本標準化技術委員會器官移植工作組”共同起草了《器官移植生物樣木庫建設實踐指南》（以下簡稱“指南”）以指導規(guī)范化建設器官移植生物樣本庫。

本《指南》依照《ISBER生物樣本庫最佳實踐2018》中國醫(yī)藥生物技術協(xié)會生物樣本庫標準（試行）《Canadian Tissue Repository Network.2012》《中國生物樣本庫——理論與實踐》等指南、專著和數(shù)十篇國內(nèi)外參考文獻，采用美國肝病研究學會（AASLD）推薦的醫(yī)學證據(jù)等級評價標準（表1）［6］，對器官移植樣本庫的建設、樣本采集、保存、倫理等問題提出指導意見。

表1 循證醫(yī)學證據(jù)推薦分級系統(tǒng)

1 建設規(guī)劃

1.1 場地和設備：器官移植生物樣本庫的建設應規(guī)劃足夠的空間以滿足不斷增加的樣本資源儲存需求，樣本保存預估總量可參考（每例樣本分裝份數(shù)×每年樣本例數(shù)×5年×120%）分別計算出室溫、普通低溫、超低溫、液氮等保存環(huán)境的樣本量，以預估總量/保存容器容量計算出保存容器數(shù)量和所需空間。器官移植生物樣本庫應規(guī)劃獨立的樣本采集室、處理室、儲存室（有/無熱源）、信息管理室和質(zhì)控室等，涉及組織樣本采集的樣本庫，為縮短樣本離體后處理時間應在手術室附近區(qū)域規(guī)劃樣本采集室［6］。生物樣本庫建設的場地應按照有效運行的宗旨設計，保障樣本及相關信息的采集、接收等一系列工作正常實施，并且最大程度降低工作人員職業(yè)性疾病風險；設備應從成本、使用效率、常規(guī)和特殊管理、軟硬件維護等方面提供指導性條例。具體要求應參照《中國醫(yī)藥生物技術協(xié)會生物樣本庫標準（試行）》執(zhí)行。采集和保存具有傳染性樣本（如含乙肝病毒、丙肝病毒、HIV病毒、蒼白螺旋體等）時應參照《病原微生物實驗室生物安全管理條例》和《生物安全實驗室建筑技術規(guī)范》［7-8］等要求進行建設和管理。

推薦意見1：器官移植樣本庫應依照《中國醫(yī)藥生物技術協(xié)會生物樣本庫標準（試行）》和《病原微生物實驗室生物安全管理條例》等相關標準規(guī)范化建設，組織樣本采集室應與手術室相鄰。（ⅠC）

1.2 人員要求：器官移植生物樣本庫應指派專職人員負責全面管理，生物樣本的處理、保存、信息及質(zhì)量控制應指定專職人員負責。組織樣本采集人員應為病理診斷專業(yè)或經(jīng)過系統(tǒng)化的病理專業(yè)培訓［9］，倫理、財務及樣本質(zhì)量檢測（病理形態(tài)及生物大分子等）可由相關科室人員兼職負責，工作人員數(shù)量應根據(jù)預估樣本量合理規(guī)劃。生物樣本庫工作崗位為專業(yè)技術崗，工作人員應取得相關專業(yè)技術資格認定和中國醫(yī)藥生物技術協(xié)會組織生物樣本庫分會頒發(fā)的《崗前培訓證書》［10］。

推薦意見2：器官移植樣本庫工作人員應取得相關專業(yè)和行業(yè)技術資格認定，設立專職技術人員負責樣本采集、處理、保存、質(zhì)控及信息化管理等。（ⅠC）

2 組織機構建設

構建完善的器官移植生物樣本庫組織機構是保障其科學、規(guī)范運行的必要條件，依照現(xiàn)行生物樣本庫組織機構建設要求應成立“科學技術委員會”“倫理委員會”和“管理和執(zhí)行機構”［4］。其中，生物樣本庫所在單位已有“科學技術委員會”和“倫理委員會”的，可由其行使生物樣本庫相關職能，且必須分別將生物樣本庫相關工作納入其正常的工作職責范圍?！翱茖W技術委員會”的主要職能是對生物樣本采集和使用相關工作的科學審查，并對生物樣本采集、處理、保存、質(zhì)量控制、信息化管理等相關技術，給予指導和規(guī)范，其中器官移植專業(yè)人員占比不少于60%；“倫理委員會”的主要職能是對生物樣本采集入庫保存、出庫使用、以及樣本轉(zhuǎn)移和銷毀等全程工作進行監(jiān)督，并提供相關法律和倫理支持，確保樣本捐贈者、樣本管理者、樣本使用者的權益均在國家相關法律下受到保護，樣本相關工作合乎國際倫理規(guī)范［4］。其應由醫(yī)學、倫理、法律相關專業(yè)人員和代表社會群體利益的非專業(yè)人員構成［11］。“管理和執(zhí)行機構”的成員應包含從事器官移植的臨床及科研人員和樣本庫技術操作人員，職責包括：① 規(guī)劃樣本庫的整體發(fā)展方向；② 制定生物樣本庫的制度；③ 制定樣本采集的標準操作規(guī)程 （SOP）；④ 負責樣本的采集、處理、儲存、出庫、運輸、質(zhì)量檢測等日常工作。

推薦意見3：器官移植生物樣本庫應組建“科學技術委員會”“倫理委員會”和“管理和執(zhí)行機構”以監(jiān)督、指導日常工作。（ⅠC）

3 倫理規(guī)范和知情同意

器官移植生物樣本資源的采集和應用須通過“倫理委員會”的審查［11］。倫理委員應根據(jù)原“國家衛(wèi)生和計劃生育委員會”《涉及人的生物醫(yī)學研究倫理審查辦法》和《赫爾辛基宣言》《紐倫堡法典》以及聯(lián)合國教科文組織頒布的《世界人類基因組與人權宣言》等規(guī)范，對保障捐贈者的知情同意權利、捐贈者隱私保護、合理使用樣本等情況進行全面、客觀的審查［1］。

知情同意是對從事人體取樣調(diào)查的倫理要求，是生命倫理學最基本的體現(xiàn)［12］。器官移植樣本的采集涉及“供者”和“受者”兩個群體，并且存在多類型樣本（組織、血液、尿液等）和多次采集的情況，因此，樣本采集知情同意書應包括采集對象、樣本類型、采集次數(shù)、應用方向及捐贈者權益等重要信息。樣本采集應在捐贈者（供者、受者）簽署“樣本采集和保存知情同意書”（簡稱“知情同意書”）后進行，因器官移植樣本的特殊性，在樣本入庫前可根據(jù)實際情況決定所需簽署的知情同意文件。生物樣本庫工作人員有義務對捐贈者簽署的知情同意書進行解釋。

推薦意見4：器官移植涉及的生物樣本采集和應用均需獲得“倫理委員會”批準。（ⅠA）

推薦意見5：生物樣本的采集應在捐贈者簽署“樣本采集和保存知情同意書”后進行。（ⅠA）

4 生物樣本的應用審核

鑒于器官移植樣本整體數(shù)量較少，需謹慎審核樣本使用，有助于發(fā)揮其最大科研和臨床價值。申請生物樣本應用人員必須如實填寫并遞交生物樣本使用申請及研究方案，向“科學技術管理委員會”和“倫理委員會”提交紙質(zhì)申請。對已立項的研究項目，使用樣本時根據(jù)科研項目的立項級別，研究者只需提供項目立項的批復文件、立項時“科學技術管理委員會”和“倫理委員會”的相關審查文件即可。生物樣本庫應將現(xiàn)存樣本分為“常見樣本”和“稀有樣本”兩類，常見樣本：① 易于獲取（如全器官樣本，手術切除樣本、血液樣本等）和/或② 獲取例數(shù)不少于30例/年和/或③ 庫存份數(shù)不少于3份。稀有樣本：① 不易獲?。ㄈ绻w樣本活檢、穿刺樣本等）和/或 ② 獲取少于30例/年和/或 ③ 庫存份數(shù)少于3份。樣本應用審核要求：① 樣本出庫審定時應根據(jù)現(xiàn)存樣本類型、數(shù)量及是否符合研究所需等多方面綜合考慮；② 評審委員人數(shù)不少于5名且為奇數(shù)；③ 評審委員對與自身利益相關項目應采取回避機制?！俺Ｒ姌颖尽焙汀跋∮袠颖尽毙璺謩e不少于60%和80%的評審委員同意方可出庫。生物樣本庫應在收到紙質(zhì)審批同意后48 h內(nèi)完成樣本出庫并詳細填寫紙質(zhì)出庫記錄［13］。

推薦意見6：器官移植生物樣本庫應依照樣本獲取難易程度、類型及數(shù)量等將現(xiàn)有樣本進行分類管理，依據(jù)樣本稀有程度制定出庫審定標準。（ⅠC）

推薦意見7：已獲批的省部級以上的科研項目，由于已經(jīng)通過各項審核，因此，項目中涉及的生物樣本使用時“科學技術管理委員會”和“倫理委員會無需再次審核。（ⅠB）

5 信息化管理

信息化管理與信息應用是醫(yī)學研究和器官移植生物樣本庫管理必不可少的重要組成部分。其中全面和專業(yè)的管理軟件是構建信息化管理的基礎［14］。選擇信息化管理軟件首先要與自身樣本庫的設計和運作需要的工作流程相符合，應結合各單位自身的網(wǎng)絡構架和工作特點，挑選成熟的商業(yè)化軟件，管理軟件應能適應三種數(shù)據(jù)收集方法，包括手工、文本導入和/或從所在醫(yī)院的HIS或LIS系統(tǒng)實時或定時獲取需要的數(shù)據(jù)集［15］。

臨床和樣本采集、處理和儲存過程中獲取的信息是體現(xiàn)生物樣本價值的重要保障，也是樣本庫實行信息化管理以及信息應用的基本因素［16］，與捐贈者和生物樣本相關的臨床信息應該以表達捐贈者和生物樣本的生物特征為主的數(shù)據(jù)集形式進行規(guī)劃，可以“必須的”（Mandatory）和“選擇性的”（Optional）兩種方式?jīng)Q定構成數(shù)據(jù)集的多個數(shù)據(jù)元素，用以表達捐贈者和相應生物樣本的特征。上述的臨床信息至少應包含捐贈者“必須的”數(shù)據(jù)集：

第一個數(shù)據(jù)集“身份信息”，該數(shù)據(jù)集應該包含以下幾個數(shù)據(jù)元素：① 捐贈者在樣本庫的編碼（如果有其他來源的編碼，將其他編碼一律設置為“別名”（Alias）；② 姓名；③ 住址；④ 通訊方式；⑤ 住院/門診號。其中上述的② ～④ 三條數(shù)據(jù)元素，因為涉及隱私和數(shù)據(jù)安全信息，將以保密方式管理。具體方法為：這3個數(shù)據(jù)元素構成一個編碼，該編碼分別以keyId1、keyId2和keyId3分別指定到其相應的姓名、住址和通訊方式，編碼作為一個新的數(shù)據(jù)元素替代原來的3個元素。將此數(shù)據(jù)元素和其相應內(nèi)容特別另外保存，只有有權限的人可以提取應用，儲存方式可以類似Microsoft excel worksheet或Microsoft access數(shù)據(jù)庫方式儲存和管理。

第二個數(shù)據(jù)集“家族史”主要是家族中主要成員的疾病史，根據(jù)該樣本資源的特別情況設置必要的數(shù)據(jù)元素，如父母、祖父母、直系兄弟姐妹的相關疾病，比如糖尿病、高血壓、心臟病、腎臟病、神經(jīng)/精神疾病、乳腺腫瘤/婦科腫瘤、出血性疾病及其他腫瘤等。

第三個數(shù)據(jù)集“遺傳史”主要是捐贈者的遺傳病史，根據(jù)該樣本資源的特別情況設置必要的數(shù)據(jù)元素，如父母、祖父母、直系兄弟姐妹的相關疾病，比如多囊腎、遺傳性腎炎、肝豆狀核變性、α1-抗胰蛋白酶缺陷癥、 Wilson病等遺傳性疾病。

其余相關信息（如治療史、手術史及預后等）同樣以數(shù)據(jù)集的方式?jīng)Q定其中所有的數(shù)據(jù)元素，并可將其中的數(shù)據(jù)元素根據(jù)實際可以獲取的情況分為必須的”和“選擇性的”。所有數(shù)據(jù)集和其中相應的數(shù)據(jù)元素以表格形式描述。另外，與生物樣本相關的數(shù)據(jù)集的“基本屬性”可有三個最基本數(shù)據(jù)元素樣本類型、器官/組織部位、添加劑（比如抗凝劑）；捐贈者為供者時除提供上述數(shù)據(jù)集外還應提供死亡時間、死亡原因和供體器官冷/熱缺血時間等數(shù)據(jù)元素。上述信息建議由醫(yī)院網(wǎng)絡內(nèi)直接獲取，供/受者間的信息應建立關聯(lián)性，有助于資料的完整性。樣本信息應包括采集、處理、儲存、質(zhì)控和應用等方面信息［16］，每份樣本應完整錄入來源、類型、體積、處理方式、編碼、采集時間、冷/熱缺血時間、儲存位置存儲溫度及凍融次數(shù)等；質(zhì)控信息應包括溫度監(jiān)控記錄、質(zhì)控時間、方法和結果等［17］；應用信息應包括樣本類型、數(shù)量及項目名稱和取得成果等。信息錄入應以詞條形式錄入并設置警示功能，避免重要信息遺漏，同時應該有輸入信息的合理性驗證功能［18］。

推薦意見8：器官移植樣本庫需建立完善和安全的信息化管理平臺，以數(shù)據(jù)集的形式對捐贈者及生物樣本的相關信息進行規(guī)劃管理。（ⅠA）

推薦意見9：數(shù)據(jù)集需包括“身份信息”“家族史”“遺傳史”和生物樣本“基本屬性”等數(shù)據(jù)元素供/受者數(shù)據(jù)元素應建立關聯(lián)性。（Ⅱa B）

6 質(zhì)量管理體系建設

完善的質(zhì)量管理體系（Quality Management System，QMS）和運營質(zhì)量管理是建設規(guī)范化生物樣本庫的關鍵，可有效保障生物樣本和實驗結果的質(zhì)量［19］。前期策劃、文件制定、試運行和體系審核是建立QMS的4個步驟，其中質(zhì)量管理體系文件包括管理職責、質(zhì)量手冊、程序文件、標準操作規(guī)程（SOP）和記錄表單等，應覆蓋生物樣本庫運營全過程。質(zhì)量保證（QA）和質(zhì)量控制（QC）是QMS中重要的兩個組成部分，QA是完整的管理運作系統(tǒng)，包含規(guī)劃、實施、建檔、記錄、評估和改進幾個方面。QC是一個設定標準、測量結果、判定是否達到預期要求、對質(zhì)量問題采取措施進行補救并防止再發(fā)的過程，包括室內(nèi)質(zhì)量控制（IQC）、室間質(zhì)量評價（EQA）以及樣本質(zhì)量評估［20］。

IQC的主要控制點包括樣本接收前變量、樣本處理過程控制和方法學驗證，應注重對采集流程的控制，各種操作應嚴格依照SOP標準執(zhí)行，包括樣本采集部位的準確性、樣本離體后時間、處理及保存過程等。EQA是由權威外部機構組織實施的質(zhì)量評價，國內(nèi)可申請“中國醫(yī)藥生物技術協(xié)會組織生物樣本庫分會（BBCMBA）”組織的“生物樣本庫質(zhì)量達標檢查”，國際可申請“生物與環(huán)境樣本庫學會（ ISBER）”委托盧森堡聯(lián)合生物樣本庫（IBBL）組織的“生物樣本庫樣本質(zhì)量控制檢測能力測試”。

推薦意見10：根據(jù)生物樣本的應用要求制定完善的質(zhì)量管理體系對器官移植生物樣本庫運行過程進行質(zhì)量管控。（ⅠB）

推薦意見11：器官移植生物樣本庫應經(jīng)過外部評審機構的評定。（Ⅱa B）

7 樣本的質(zhì)量評估

質(zhì)量評估包括對組織、體液細胞和核酸樣本的評估，生物樣本在采集、處理及儲存的過程中常存在諸多不可控因素［21］，因此，在制定樣本的質(zhì)量標準時應以滿足預期實驗需求為宜。評估方法包括“定期隨機抽樣”和“針對性”評估兩種方法，前者是定期按一定比例隨機抽取生物樣本進行質(zhì)量檢測，是目前常用的方法，但會消耗現(xiàn)存樣本且提高質(zhì)量評估成本，后者是針對未能滿足QMS標準的樣本進行檢測，可減少質(zhì)量評估樣本用量和成本，但需有完整QMS體系監(jiān)管。

組織樣本評估需要從病理形態(tài)、分子水平和特定指標等幾個方面對樣本進行評價［22］。庫存組織樣本均應有對應組織切片用于病理學評估并長期保存，病理學評估是評價組織壞死程度、腫瘤成分比例、采集準確性和完整性的金標準［23］，腫瘤成分比例不少于75%為質(zhì)量良好，可用于大多數(shù)研究，腫瘤或壞死成分比例少于65%原則上可不予保存。接受移植的腫瘤患者（如肝臟移植）術前使用各種抗腫瘤治療可導致腫瘤存在不同程度的壞死，可借助顯微切割技術獲取腫瘤組織保存。組織樣本可采用RT-PCR技術、凝膠電泳、質(zhì)譜分析等方法對其核酸（DNA、RNA）和蛋白的質(zhì)量進行檢測［24］。

體液樣本（如全血、血清、血漿、尿液、膽汁等）質(zhì)量評估可因采集、處理和儲存方法的不同對其物質(zhì)含量、分子功能產(chǎn)生不同程度的影響，可以在保存前用特定的分子標志物評估其完整性能否滿足科研設計要求。細胞樣本的質(zhì)量評估指標包括細胞數(shù)量活性和污染（細菌、病原體和病毒）程度等幾個方面?？刹捎眉毎嫈?shù)板/儀測定細胞數(shù)量，臺盼藍染色法或熒光染料標記法檢測細胞活性，細菌培養(yǎng)等檢測污染情況［25-26］。

生物樣本內(nèi)或提取后的核酸評估包括測定其完整性（分子量、RIN值）、濃度和純度［27］。DNA樣本可通過瓊脂糖凝膠電泳法檢測其片段大小和完整性，通過紫外分光光度計檢測其濃度（OD 260 nm值）和純度（OD 260 nm/280 nm值）。RNA樣本的完整性目前推薦檢測其RN值判定（RIN值接近10完整性最好、RIN值不小于7為合格）或通過28 S/18 S比值判定，可通過紫外分光光度計檢測RNA的濃度和純度。為保證樣本質(zhì)量檢測結果的客觀性，可將樣本送至第三方檢測機構進行相關檢測［28］。

推薦意見12：根據(jù)樣本類型及應用方向采用“針對性”評估方法有選擇性地進行形態(tài)學、核酸質(zhì)量、細胞活性等質(zhì)量評價。（ⅠB）

8 生物樣本的采集和處理

8.1 組織樣本

8.1.1 切除器官樣本：不同類型切除器官的組織樣本采集方案（部位、順序、大小及數(shù)量）和操作流程應根據(jù)器官類型、采集地點及預期應用方向并與臨床和病理醫(yī)師商討后制定［29］。生物樣本具有潛在生物危害性，嚴禁樣本采集人員在無防護措施下進行樣本采集。具有傳染性的樣本應根據(jù)其危害程度，依照相關規(guī)定采取人員和環(huán)境防護［30］。樣本采集人員應在采集前詳細了解病變部位、范圍、性質(zhì)以及有無傳染性疾病等基本情況，采集占位病變樣本時還應了解占位大小、數(shù)量和治療史等。切除器官樣本采集過程繁瑣，不可控因素較多，應詳細記錄采集過程，以備預期研究提供基線資料［31］。

器官移植手術復雜導致樣本離體時間不定，為保障樣本中生物大分子的穩(wěn)定性和活性，要求采集人員與手術人員建立良好的溝通機制。組織樣本采集至少需要兩名工作人員協(xié)同完成，一名負責樣本的采集及分裝，另一名負責采集過程中的輔助工作全器官樣本離體后應放置于裝有冷藏介質(zhì)（2～8℃）的無菌容器中即刻轉(zhuǎn)運至采集室，并于離體后30 min內(nèi)完成采集、分裝及低溫保存，分裝后的樣本應放置在低于保存溫度的容器中進行轉(zhuǎn)運［32］。離體時間超過30 min的樣本也應進行采集，隨后對樣本進行質(zhì)量評估，滿足要求的樣本可進行長期保存。

樣本采集區(qū)域、采集器械和物品應保持清潔無菌，盡量使用一次性器材，避免交叉和二次污染。組織樣本的切割和分裝應在低溫（2～8℃）環(huán)境中進行并置于浸濕的無菌紗布上操作，用于RNA研究樣本的采集器械應進行RNA酶滅活處理，并將樣本放置于RNA保護劑中長期儲存［33］。采集前應測量器官的大小、重量和體積（排水法）并對表面和病變部位進行拍照存檔。采集順序應依照非病變區(qū)病變旁區(qū)、病變區(qū)以及無菌區(qū)、有菌區(qū)原則依次進行。在不影響病理診斷的前提下，每病變區(qū)域分裝份數(shù)不少于10份，每份樣本體積不大于0.5 cm3，多個占位病變應分別采集保存，以便于開展多項臨床和科學實驗，樣本采集應盡量避免出血、壞死區(qū)。占位性病變直徑在0.5～1.0 cm時，沿病變最大徑剖開，2/3用于病理診斷，1/3放置于RNA保護劑中保存，直徑小于0.5 cm的病變不進行樣本采集和保存［12］。附帶其他臟器或組織時，應依照《臨床技術操作規(guī)范（病理學分冊，ISBN7801941950）》進行采集，根據(jù)科研及臨床需要保存組織樣本［34］。樣本采集過程應盡量避免破壞器官整體形態(tài)，剩余樣本應放置于標本缸內(nèi)用中性福爾馬林溶液浸泡并編號后長期保存，可用于今后的形態(tài)學、蛋白及部分核酸相關研究［32］。

8.1.2 活檢組織樣本：活檢組織樣本（供/受者）的臨床和研究價值巨大，主要用于供體器官的質(zhì)量評估和術后并發(fā)癥的病理診斷，活檢方式包括手術切取活檢、穿刺活檢內(nèi)鏡導管活檢等［35］，涉及的移植器官包括肝臟、腎臟、心臟、肺、小腸等?；顧z組織樣本獲取過程為有創(chuàng)性操作且獲取量少，因此，應在符合倫理且對捐贈者充分告知并獲得允許的情況下自愿留??；活檢組織樣本應在滿足病理診斷的前提下，依據(jù)預期研究目的制定科學的采集方案并選擇最優(yōu)的保存方法。

活檢組織樣本應在臨床專家的指導下獲取，且不會對捐贈者造成危害的情況下優(yōu)先選擇楔形切除樣本，獲取的組織樣本體積約2～3 mm3且應即刻放置凍存管內(nèi)編碼、保存，根據(jù)采集份數(shù)依次放入RNA保護劑、氣相液氮中保存［17］。生物樣本庫不再留取活檢組織的病理質(zhì)控樣本，可借助臨床病理診斷結果作為質(zhì)控依據(jù)。每例保存的活檢組織樣本建議保存同期血液和/或尿液樣本并記錄相關臨床信息［36］。

推薦意見13：針對器官類型制定合理的組織樣本采集方案和流程，確保樣本采集不影響病理診斷的準確性。（ⅠB）

推薦意見14：切除器官離體后應在潔凈無菌區(qū)域內(nèi)盡快完成組織樣本采集并完整記錄采集過程，每例樣本應多份保存。（ⅠA）

推薦意見15：活檢組織樣本在符合倫理且對捐贈者充分告知并獲得允許的前提下自愿留取。（ⅢB）

推薦意見16：活檢組織樣本應在RNA保護劑氣相液氮中保存。（ⅠA）

8.2 體液樣本：器官移植涉及的體液樣本種類包括血液、尿液胸/腹水、膽汁等，供/受者應于器官移植前24 h內(nèi)采集血液和/或尿液樣本一份，受者在移植后依據(jù)預期研究方向制定體液樣本的采集類型、間隔周期和數(shù)量，推薦在移植后7 d、14 d和出院前采集，所有有創(chuàng)性的體液樣本的采集應與臨床檢查同時進行［26］

8.2.1 血液樣本：采集和保存前應依據(jù)預期實驗所需用量制定采集和處理方案。血液樣本采集后應置于2～8℃環(huán)境中暫存并盡快（＜24 h）完成處理和保存。全血分離后的血清或血漿分裝至若干 （約5管） 凍存管內(nèi)（250 μl/管）于-80℃以下保存，棕黃層加入冷凍保護劑后-140℃以下保存［37］。抗凝血可提取血漿、血沉棕黃層（含白細胞）、紅細胞，可供核酸檢測和活細胞提取，不同類型的抗凝劑對后續(xù)研究也有影響，常用EDTA抗凝管采血。非抗凝血可獲取血清和血凝塊，可供DNA基因分型和其他代謝產(chǎn)物研究［38］。

8.2.2 尿液樣本：采集方法取決于所要分析的類型，采集前需要清洗外陰并采集排尿后的清潔中段尿液，其細胞和微生物污染率較低。晨尿（高濃度）有利于檢測白細胞、紅細胞和激素等，隨機采集適合于常規(guī)篩查和細胞學研究，分段采集用于比較尿液和血液中分析物的濃度，定時采集可以用來比較某些生物分子的排泄模式，采集時間是12 h和24 h［37］。采集容器應為防漏的無菌干燥廣口容器，容量為50～3 000 ml，根據(jù)分析物檢測的要求可添加乙二胺四乙酸（EDTA）、酸化劑或焦亞硫酸鈉等防腐劑，尿液收集后冷藏并保存。尿液樣本要離心去除細胞及碎片，脫細胞的尿液和分離的細胞分裝后放置于-80℃以下環(huán)境保存。尿液膜常溫保存可用于尿中蛋白、 microRNA及代謝產(chǎn)物的保存，有利于降低保存成本，節(jié)省儲存空間［39］。

8.2.3 胸水、腹水、膽汁等：采集和保存過程中應遵循無菌操作原則，樣本獲取后應置于2～8℃環(huán)境中靜置暫存并盡快 （＜24 h）完成處理和保存。胸、腹水處理同尿液樣本，-80℃以下保存。膽汁樣本可供科學研究項目尚不清楚，建議不經(jīng)過離心直接分裝（0.5 ml/管），置于液氮環(huán)境中保存。

推薦意見17：依據(jù)器官移植類型和預期應用方向制定體液樣本采集種類、數(shù)量及時間點。（ⅠC）

推薦意見18：體液樣本應依據(jù)樣本類型，進行成分提取后保存。（ⅠA）

8.3 活性組織/細胞樣本：隨著移植領域研究的不斷發(fā)展，要求保存具有生物活性樣本以供腫瘤耐藥檢測、人源腫瘤異物移植（PDX模型建立、原代細胞培養(yǎng)、干細胞分離及移植免疫學研究使用［40］。樣本離體后采集處理時間、無菌采集技術、梯度降溫及復溫程序是影響生物活性的重要因素［41］。樣本處理的SOP文件應在實踐中不斷改進和完善中建立。

簡要采集和處理流程：在無菌環(huán)境下快速獲取具有生物活性的樣本并于超凈工作臺內(nèi)進行樣本分離、分裝。用于PDX模型建立的樣本可即刻接種于裸鼠體內(nèi)或放入特殊保存液中置于2～8℃環(huán)境中保存48 h，但隨保存時間的延長，組織活性逐漸降低［42］。用于原代細胞培養(yǎng)的組織樣本應于超凈工作臺內(nèi)剪碎組織后根據(jù)組織類型選擇適宜濃度的消化酶和時間對組織進行細胞化處理，商品化的組織處理儀和試劑可降低對組織活性的影響［26］。處理后的活性細胞溶液可進行細胞培養(yǎng)或低溫凍存。細胞凍存前應測定細胞濃度和活細胞比例，將細胞放入無菌凍存管內(nèi)加入自配的冷凍保護劑或其他商品化保護劑，混勻后進行程控降溫并于液氮中保存，嚴禁反復凍融，細胞復溫應在37℃恒溫水浴箱中快速完成［43］。

推薦意見19：活性組織/細胞樣本的采集和處理應在樣本離體后即刻進行，采集和處理應執(zhí)行無菌操作規(guī)程。（ⅠA）。

推薦意見20：器官移植生物樣本庫應開展血液中白細胞的活性保存，有利于移植免疫學研究。（ⅠC）

9 生物樣本的保存

科學合理的生物樣本保存方法和溫度可保證樣本預期應用質(zhì)量，節(jié)省空間，降低成本，提高存取便捷性，是建設生物樣本庫的關鍵。器官移植生物樣本庫應根據(jù)樣本類型、預期儲存時間和應用方向選擇適宜的保存方法和溫度。

生物樣本保存方法包括處理后保存、整體保存和分裝保存。處理后保存是獲取樣本后即刻提取其預期研究所需的生物大分子（DNA、RNA、蛋白等）進行保存，可避免生物大分子降解，但其處理成本高，應用方向單一，主要用于研究目的明確的小規(guī)模樣本保存［44］。整體保存適用體積小或前處理對質(zhì)量影響較大的樣本，如活檢樣本等。分裝保存是將樣本根據(jù)預期研究要求，等體積分裝若干凍存管內(nèi)進行保存，可提高樣本的多方向應用價值，避免反復凍融對質(zhì)量的影響，但會增加樣本庫的工作量和保存成本，不規(guī)范的分裝操作可導致樣本質(zhì)量不一，應用自動化分裝平臺可降低對樣本質(zhì)量的影響［45］。

生物樣本的保存溫度包括：室溫（4～25℃）、低溫（-60～4℃）、深低溫（-80～-60℃）和超低溫（-196～-80℃）。室溫用于福爾馬林固定的樣本、組織蠟塊、切片的保存，其對生物大分子的保存效果不佳，并應控制保存區(qū)域的濕度和避免樣本蟲蛀。冷凍干燥保存、干化學基質(zhì)保存和穩(wěn)定劑保存是新興的常溫保存技術，也是未來樣本保存發(fā)展方向，但上述方法保存樣本時限短，成本高，不推薦大規(guī)模樣本保存使用［46］。低溫環(huán)境中0～4℃用于樣本處理前的短期（組織樣本＜4 h、體液樣本＜12 h） 保存，此溫度下樣本中各種生物大分子降解顯著，應縮短樣本在低溫下的保存時間［25］。-20～0℃可短期保持純化生物大分子的穩(wěn)定性，但會損傷組織和細胞的微觀結構和細胞活性，用于樣本提取后生物大分子和血液的短期（＜90 d）保存。-60～-20℃可中長期保持純化生物大分子的穩(wěn)定性，但不能長期保存未經(jīng)過處理的組織及體液樣本。深低溫（-80℃）環(huán)境中多數(shù)生物大分子活性不會破壞，生化反應顯著降低，可長期（≤5年）保存生物樣本中DNA和加入穩(wěn)定劑的RNA以及提取后的DNA和RNA。未加穩(wěn)定劑的樣本中RNA和部分蛋白、脂類及細胞活性可短期（時間不定，質(zhì)量逐漸下降）保存。深低溫環(huán)境中-140℃（氣相液氮）可使生物樣本內(nèi)生化反應基本停止，維持RNA及其他生物大分子的完整性及功能長達50個月以上，已廣泛應用于國內(nèi)外大型生物樣本庫。-196℃（液相液氮）是長期保存細胞及微生物活性的理想溫度，保存時應加入低溫保護劑（二甲基亞砜、甘油、丙二醇、乙二醇等），防止低溫對細胞活性造成損傷［47］。

推薦意見21：器官移植生物樣本應根據(jù)樣本類型、數(shù)量、預期存儲時間和應用方向選擇科學、合理的保存方法和溫度。（ⅠA）

推薦意見22：氣相液氮有利于長期保存生物樣本的生物大分子完整性，器官移植生物樣本應液氮化長期保存。（ⅠB）

推薦意見23：所有樣本應分裝保存，避免反復凍融導致樣本質(zhì)量降低。（ⅠA）

推薦意見24：對于預期研究目的明確且質(zhì)量要求較高的樣本，可先提取、純化相關生物大分子后進行長期保存。（ⅠB）

10 資源利用與共享

將生物樣本資源優(yōu)勢轉(zhuǎn)化為臨床及科學優(yōu)勢是生物樣本庫建設的終極目標［48］。器官移植領域研究內(nèi)容眾多，對高質(zhì)量生物樣本資源的需求巨大，鑒于器官移植樣本總量較少且樣本獲取過程繁雜，凸顯優(yōu)質(zhì)生物樣本的珍貴性和稀有性。器官移植樣本的利用應在符合倫理的前提下，申請者提供完善的應用計劃和預期成果，經(jīng)科學的論證后方可被用于相關研究。應用過程應全程監(jiān)控，若出現(xiàn)生物樣本不能滿足預期時應即刻終止，避免資源浪費［49］。

器官移植中心應開展生物樣本資源共享，聯(lián)合多中心進行大樣本研究，有助于產(chǎn)出高水平科研成果，是未來科學研究發(fā)展趨勢。規(guī)范和統(tǒng)一的SOP、QMS和信息管理系統(tǒng)是資源共享的基礎，開放樣本資源數(shù)據(jù)，搭建共享網(wǎng)絡平臺是資源共享的有效方式［50］。器官移植生物樣本資源的共享平臺應根據(jù)以下基本原則建立和共享資源信息：基本原則是對參與共享平臺建設的機構定期公開生物樣本相關信息；共享模式為協(xié)商共享方針。建立網(wǎng)絡共享平臺，展示共享機構基本信息和捐獻者及相應生物樣本信息；建立基本檢索功能，可通過網(wǎng)絡共享平臺詢問了解和提交意向。

推薦意見25：各器官移植中心應加強合作，建立公平、合理的共享機制及樣本資源共享平臺，利用器官移植樣本進行大樣本多中心研究。（ⅠC）

學術顧問：

沈中陽（天津市第一中心醫(yī)院）；郜恒駿（上海分子醫(yī)學工程技術研究中心）；石炳毅（解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學中心全軍器官移植研究所）；劉永鋒（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院）

執(zhí)筆人：

王政祿（天津市第一中心醫(yī)院）；鄭虹（天津市器官移植臨床醫(yī)學研究中心）

編寫專家（按姓氏筆畫排序）：

于立新（南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院）；門同義（山東千佛山醫(yī)院）；王偉業(yè)（上海交通大學附屬新華醫(yī)院）；王玲（河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院）；王政祿（天津市第一中心醫(yī)院）；王樹森（衛(wèi)生部危重病急救醫(yī)學重點實驗室）；王鋼（吉林大學附屬第一醫(yī)院）；王雪琦（海軍軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院）；孔曉妮（上海交通大學附屬仁濟醫(yī)院）；孔祥榮（天津市第一中心醫(yī)院）；石炳毅（解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學中心全軍器官移植研究所）；史嘉瑋（華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院）；付迎欣（天津市第一中心醫(yī)院）；畢博文（天津市第一中心醫(yī)院）；朱繼業(yè)（北京大學附屬人民醫(yī)院）；任長發(fā)（廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院）；任智慧（新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院）；劉永鋒（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院）；劉妍（解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心）；劉盛（北京阜外心血管病醫(yī)院）；劉蕾（天津市器官移植重點實驗室）；孫孟紅（上海復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院）；嚴?。ㄌm州大學第一醫(yī)院）；杜莉利（上海超生物科技有限公司）；李立（昆明醫(yī)科大附屬第一醫(yī)院）；李寧（首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院）；李靈溪（金西盟低溫生物技術研究院）；李妍（天津市第一中心醫(yī)院）；楊迷玲（鄭州人民醫(yī)院）；肖亞（陸軍軍醫(yī)大學附屬新橋醫(yī)院）；肖建生（南昌大學附屬第一醫(yī)院）；肖漓（解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學中心）；邱濤（武漢大學附屬人民醫(yī)院）；沈中陽（天津市第一中心醫(yī)院）；張慶（解放軍總醫(yī)院第三醫(yī)學中心）；張小燕（上海分子醫(yī)學工程技術研究中心）；張水軍（鄭州大學第一附屬醫(yī)院）；張可浩（上海芯超生物科技有限公司）；張瑋曄（天津市第一中心醫(yī)院）；陳靜瑜（無錫市人民醫(yī)院）；林?。ū本┯颜x醫(yī)院）；周華（山西省第人民醫(yī)院）；周學迅（上海萬格生物科技有限公司）；鄭虹（天津市第一中心醫(yī)院）；鄭瑾（西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院）；趙強（中山大學附屬第醫(yī)院）；郜恒駿（上海分子醫(yī)學工程技術研究中心）夏永祥（江蘇省人民醫(yī)院）；高曉剛（海軍軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院）；郭暉（華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院）；黃菊芳（中南大學基礎醫(yī)學院）；黃鋒（廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院）；梁昭（天津市第一中心醫(yī)院）；彭志海（上海市第一人民醫(yī)院）；蔣文濤（天津市第一中心醫(yī)院）；程穎（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院）；傅志仁（海軍軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院）；曾強（河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院）；謝進（鄭州大學第一附屬醫(yī)院）；謝巖（寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院）；謝海洋（浙江大學附屬第一醫(yī)院）；竇科峰（空軍軍醫(yī)大學附屬西京醫(yī)院）；臧運金（首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院）；譚建明（解放軍聯(lián)勤保障部隊第九○○醫(yī)院）；潘澄（天津市第一中心醫(yī)院）；魏永剛（四川大學華西醫(yī)院）