GGTA1/β4GalNT2雙基因敲除的巴馬小型豬PFFs細(xì)胞系的建立

厲小雪，李楚，任雪洋，王盈，楊海元，戴一凡（南京醫(yī)科大學(xué)江蘇省異種移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211166）

器官移植是治療終末期器官衰竭患者的重要途徑，但是受到供體器官嚴(yán)重不足的制約［1］。異種器官移植為解決同種供體器官短缺的問(wèn)題提供了新思路。豬與人類在解剖、代謝、生理學(xué)器官大小、基因組和細(xì)胞周期特征等方面具有極高的相似性，所以豬被視為理想的人類器官供體來(lái)源［2-3］。目前，豬全基因測(cè)序已經(jīng)完成，且體細(xì)胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）已經(jīng)廣泛應(yīng)用，致使豬成為生物醫(yī)學(xué)中最受關(guān)注的大動(dòng)物模型之一。廣西巴馬小型豬具有遺傳穩(wěn)定、產(chǎn)仔多、體型小等特征，在異種移植研究中受到越來(lái)越多的重視［4-5］。

然而，將豬器官應(yīng)用到臨床面臨著免疫排斥的難題。α-1，3- 半乳糖（α-1，3-galactose，α-Gal）是一種存在于豬細(xì)胞表面的抗原，由α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因（α-1，3-galactosyltransferase，GGTA1）編碼。GGTA1基因在人體內(nèi)失活，人體內(nèi)存在大量的能夠識(shí)別α-Gal的抗體。將豬器官或者組織移植給人時(shí)，會(huì)導(dǎo)致急性排斥反應(yīng)（hyper acuterejection，HAR）［6-7］。將豬體內(nèi)的 GGTA1 基因敲除，克服了異種移植中的超急性排斥反應(yīng)［8-11］。然而，近期的研究發(fā)現(xiàn)，將敲除豬的器官進(jìn)行移植后仍然會(huì)出現(xiàn)抗體沉積、補(bǔ)體激活和血栓形成的問(wèn)題［12］，表明豬細(xì)胞表面仍然存在著多種非Gal抗原［13-14］。Byrne等［12-16］研究發(fā)現(xiàn)豬體內(nèi)還存在著一種由β-1，4 N-乙酸氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶（β-1，4 N-acetylgalactosaminyltransferase 2，β4GalNT2）催化合成SD（a）抗原。當(dāng)豬的器官移植到靈長(zhǎng)類動(dòng)物后，SD（a）能被免疫球蛋白結(jié)合而引起免疫排斥反應(yīng)。因此，將巴馬小型豬的GGTA1和β4GalNT2基因敲除，可以極大降低其器官/組織的免疫原性。

本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)制備GGTA1/β4GalNT2雙基因敲除的巴馬豬胚胎成纖維細(xì)胞（porcine fetal fibroblasts，PFFs）細(xì)胞系，以期能為異種器官移植的研究提供更好的研究材料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料：待孕母豬為長(zhǎng)白豬。妊娠37 d野生型原代巴馬小型豬胚胎成纖維細(xì)胞由南京醫(yī)科大學(xué)江蘇省異種移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；pX330質(zhì)粒（Addgene plasmid 423230）；細(xì)胞轉(zhuǎn)染儀（Lonza，德國(guó)）；G418（Gibco，美國(guó)）；FBS（Pansera ES，America）；DMEM（Gibco，美國(guó)）；DPBS（Gibco，美國(guó)）；pMD18-T載體（TaKaRa，日本）；感受態(tài)DH5α（天根，北京）；膠回收試劑盒（QIAGEN，德國(guó)）；DMSO（Gibco，美國(guó)）；引物序列和磷酸化的寡糖核苷酸序列 （北京擎科新業(yè)生物技術(shù)，北京）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 構(gòu)建質(zhì)粒：根據(jù)Genbank公布的豬GGTA1、β4GalNT2基因序列，并在http://crispr.mit.edu上設(shè)計(jì)靶向GGTA1、β4GalNT2的單導(dǎo)向RNA （single guide RNA，sgRNA）序列，合成序列。Oligo序列退火后，與pX330載體連接，轉(zhuǎn)化、涂板、挑取單克隆菌后測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果正確的單克隆菌擴(kuò)大，提取GGTA1-sgRNA、β4GalNT2-sgRNA打靶質(zhì)粒。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)：復(fù)蘇野生型妊娠37 d巴馬小型豬胚胎成纖維細(xì)胞，用16% FBS的完全培養(yǎng)基于10 cm皿中，38℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。取培養(yǎng)48 h的37 d巴馬豬胚胎成纖維細(xì)胞，DPBS洗3遍，取0.025%胰酶消化1.5 min，加入2 ml完全培養(yǎng)基終止消化，收集到15 ml離心管中1500轉(zhuǎn)離心5 min得到細(xì)胞。按照Lonza成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒的說(shuō)明書配制核轉(zhuǎn)液，向配制好的核轉(zhuǎn)液中加入 GGTA1-sgRNA，2.5 μg；β4GalNT2-sgRNA，2.5 μg；TD tomato，1.0 μg，用配制的核轉(zhuǎn)液重懸細(xì)胞，緩慢加入核轉(zhuǎn)杯中，將核轉(zhuǎn)杯放在核轉(zhuǎn)儀上用V-013程序轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染結(jié)束后用2 ml 20% FBS培養(yǎng)基重懸，鋪板，10 cm的培養(yǎng)皿中每個(gè)視野下的細(xì)胞數(shù)為30～50個(gè)細(xì)胞（本實(shí)驗(yàn)鋪20個(gè)10 cm皿），將鋪完細(xì)胞的10 cm放在5%CO2，38℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 克隆細(xì)胞篩選與鑒定：篩選單克隆細(xì)胞，加G418篩選細(xì)胞，加藥后的第十天左右會(huì)出現(xiàn)單克隆，在4倍鏡下觀察單克隆的生長(zhǎng)情況，將狀態(tài)好的單細(xì)胞克隆用記號(hào)筆在皿底標(biāo)注單克隆的具體位置。將相應(yīng)的10 cm皿中的培養(yǎng)基去除，再用DPBS洗兩遍，選取合適的克隆環(huán)放在標(biāo)記好的克隆位置上，加入0.025%胰酶（胰酶剛剛鋪滿整個(gè)克隆環(huán)底部），計(jì)時(shí)器計(jì)時(shí)，消化2～3 min，加入20% FBS培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打，將消化下來(lái)的克隆細(xì)胞吸入48孔板中，在48孔板中標(biāo)記挑取克隆的日期，待48孔板中的克隆長(zhǎng)滿時(shí)，胰酶消化傳代到12孔板中，并留取1/5以備鑒定使用。4倍鏡下觀察，待12孔板中的克隆入長(zhǎng)滿時(shí)胰酶消化下來(lái)，加入細(xì)胞凍存液，將凍存盒放于-80℃冰箱中凍存，液氮中長(zhǎng)期保存。

單克隆的鑒定：將留下的1/5細(xì)胞從48孔板中消化下來(lái)，8000轉(zhuǎn)離心3 min加入20～30 μl NP40細(xì)胞裂解液，按照55℃ 1 h，95℃ 10 min的程序裂解得到單細(xì)胞克隆的基因組。再用得到的基因組進(jìn)行PCR，PCR體系（2×Taq Master Mix，25 μl；DNA，2 μl；前引物，2 μl；后引物，2 μl；ddH2O，19 μl），按照（GGTA1：95℃預(yù)變性，5 min；95℃變性，30 s；64℃退火，30 s；72℃延伸，30 s；β4GalNT2：95℃預(yù)變性，5 min；95℃變性，30 s；62℃退火，30 s；72℃延伸，30 s）的程序進(jìn)行PCR（引物序列如表1）。濃度為1%的瓊脂糖凝膠跑瓊脂糖凝膠電泳，DL2000作為為標(biāo)記物（Maker），膠回收試劑盒做切膠，得到膠回收產(chǎn)物，測(cè)濃度，然后與pMD18-T載體連接（體系 ：Solition Ι，5 μl；pMD18-T，1 μl；目的片段，1.5 μl；ddH2O ，2.5 μl），程序：16℃，70 min。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)（DH5α）中，涂布到氨芐抗性的平板上，37℃恒溫箱過(guò)夜，挑取單菌落送公司測(cè)序。與WT的序列比對(duì)得到敲除的基因型。

表1 GGTA1/β4GalNT2基因組靶序列引物

1.2.4 T7EN1酶切檢測(cè)突變效率：轉(zhuǎn)染后剩余的細(xì)胞放入10 cm皿中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿皿后，消化提取基因組，擴(kuò)增目的片段，反應(yīng)條件：GGTA1：98℃預(yù)變性，30 s；98℃變性，10 s；64℃退火，15 s；72℃延伸，30 s，35 個(gè)循環(huán)；β4GalNT2：98℃預(yù)變性，30 s；98℃變性，10 s；64℃退火，15 s；72℃延伸，30 s，35個(gè)循環(huán)。對(duì)以上PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，30 μl去離子水洗脫。

T7EN1酶切實(shí)驗(yàn)體系：純化產(chǎn)物，5 μl；10×NEB Buffer 2，2 μl ；去離子水，12 μl，每個(gè) PCR管中19 μl體系在PCR儀中退火，退火結(jié)束后各取9.5 μl產(chǎn)物，加入 0.5 μl T7EN1 酶，剩下的 9.5 μl不加酶作為對(duì)照，37℃孵育15 min，每管加入0.5 μl Proteinase K使T7EN1酶失活，1%瓊脂糖凝膠，100V，電泳50 min后分析結(jié)果。

1.2.5 體細(xì)胞克隆：從鑒定為GGTA1/β4GalNT2雙敲的巴馬細(xì)胞中選取狀態(tài)良好的單細(xì)胞克隆進(jìn)行SCNT。SCNT是將卵母細(xì)胞的核用盲吸法除去，然后再使用電融的方法使胚胎重構(gòu)，并使它激活，將重新構(gòu)建的胚胎培養(yǎng)10～24 h，選取形態(tài)和發(fā)育較好的胚胎移植到待孕的母豬子宮內(nèi)。

1.2.6 獲得雙基因雙敲的巴馬小型豬：胚胎移植手術(shù)完畢后，護(hù)理受體豬，1個(gè)月后，B超儀檢查受孕母豬是否懷孕。

1.2.7 取高壓滅菌的手術(shù)器械，從懷孕母豬子宮中取出妊娠37 d的豬胚胎，分別置于10 cm皿中，并將取出的胚胎放在38℃的培養(yǎng)箱中（勿要將胎膜剪破，否則容易造成污染）。將取得小豬胚胎在75%酒精中快速潤(rùn)洗一遍，再用PBS洗兩遍，在第二遍的DPBS中將胎膜剪破取出胚胎，再置于DPBS中潤(rùn)洗第三遍。用眼科剪和眼科鑷取豬胚胎的體表皮膚置于無(wú)菌的6 cm皿中，盡可能剪碎。向皿中加入4～5 ml的膠原酶38℃消化30 min左右，鏡下觀察，當(dāng)組織塊變得疏松即可，終止消化，1 ml槍輕輕吹打，把消化好的組織加入到15 ml離心管中，1 500轉(zhuǎn)離心5 min。去上清，再加入完全培養(yǎng)基重懸清洗一次，離心1 500轉(zhuǎn)離心5 min，去上清，1 ml完全培養(yǎng)基重懸。每個(gè)胚胎的細(xì)胞分到3～5個(gè)10 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，48 h后觀察，待細(xì)胞長(zhǎng)滿皿底，消化下來(lái)凍存，做好標(biāo)記，在液氮中保存，以備后用。

2 結(jié) 果

2.1 GGTA1/β4GalNT2基因 CRISPR/Cas9靶向載體的構(gòu)建：本研究根據(jù)Genbank公布的豬GGTA1和β4GalNT2基因序列，于GGTA1 的3號(hào)外顯子和β4GalNT2的 8號(hào)外顯子分別設(shè)計(jì)1條sgRNA（圖1），退火后與線性化的pX330連接。重構(gòu)后的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果（圖2）顯示sgRNA均已成功連接進(jìn)入pX330，成功構(gòu)建GGTA1-sgRNA、β4GalNT2-sgRNA打靶質(zhì)粒。

圖1 GGTA1和β4GalNT2基因的sgRNA靶點(diǎn)設(shè)計(jì)

圖2 基因重組載體的測(cè)序圖

2.2 T7EN1酶酶切實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證sgRNAs敲除效率：PCR產(chǎn)物退火后經(jīng)T7EN1酶酶切電泳結(jié)果可以看到GGTA1和β4GalNT2各被剪切成兩段。本實(shí)驗(yàn)在GGTA1的3號(hào)外顯子上設(shè)計(jì)1個(gè)sgRNA，且在β4GalNT2的8號(hào)外顯子設(shè)計(jì)1個(gè)sgRNA。實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)灰度掃描用公式計(jì)算轉(zhuǎn)染敲除效率：GGTA1-sgRNA 13.9%；β4GalNT2-sgRNA 3.3% （圖3）。

2.3 單細(xì)胞克隆的獲得和鑒定：復(fù)蘇后的野生巴馬胚胎成纖維細(xì)胞，共轉(zhuǎn)染GGTA1-sgRNA和β4GalNT2-sgRNA質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)G418篩選，共挑取70個(gè)單細(xì)胞克隆，選取其中31個(gè)狀態(tài)很好的單細(xì)胞克隆進(jìn)行凍存，經(jīng)過(guò)基因型鑒定，其中有5個(gè)單細(xì)胞克隆發(fā)生堿基刪除或增加（圖4）（-3，+3，-6bp的細(xì)胞除外），GGTA1/β4GalNT2，雙基因敲除的突變率為16.1%。

圖3 sgRNA敲除效率驗(yàn)證

3 討 論

巴馬小型豬的體型較小、性成熟早、遺傳穩(wěn)定，作為異種移植供體，具有多種優(yōu)勢(shì)：易飼養(yǎng)、繁殖、器官大小和生理結(jié)果與人類較為匹配，巴馬豬作為供體，在倫理方面也比較容易接受。豬胰島移植、豬角膜移植、豬皮膚移植、甚至豬紅細(xì)胞到人類輸血都是很有前景的研究。但是豬的器官應(yīng)用于臨床前，還面臨很多問(wèn)題，首先異種器官間的免疫排斥反應(yīng)需解決。

GGTAI基因敲除的豬的問(wèn)世雖然能夠有效地抑制超急性排斥反應(yīng)，但是在異種移植的過(guò)程中由抗體介導(dǎo)的免疫排斥反應(yīng)仍然存在，因?yàn)樵谪i的體內(nèi)仍然含有多種非Gal糖類抗原［17］。而最近的研究發(fā)現(xiàn)豬體內(nèi)的β4GalNT2基因產(chǎn)物是一種非Gal抗原。Estrada等首次制備并獲得了β4GalNT2基因敲除豬，發(fā)現(xiàn)與未敲除β4GalNT2基因的豬比較，β4GalNT2 基因敲除后，豬的PBMC與人IgM 和IgG 的結(jié)合顯著減少?？梢奊GTA1/β4GalNT2雙基因敲除巴馬小型豬在異種移植中的重要性。

以CRISPR/Cas9為代表的基因編輯技術(shù)結(jié)合體細(xì)胞克隆為構(gòu)建基因敲除動(dòng)物模型創(chuàng)造了前所未有的發(fā)展機(jī)遇。在創(chuàng)建動(dòng)物模型領(lǐng)域，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的應(yīng)用突破了一些制約體細(xì)胞克隆發(fā)展的關(guān)鍵技術(shù)瓶頸，如某些動(dòng)物ES細(xì)胞限制、傳統(tǒng)基因打靶技術(shù)和體外基因定點(diǎn)整合效率低等問(wèn)題。如今，CRISPR/Cas9系統(tǒng)結(jié)合現(xiàn)已成熟的體細(xì)胞核移植技術(shù)極大地推動(dòng)了基因敲除或敲入動(dòng)物模型的創(chuàng)建和該產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。袁益琳［18］利用CRISPR/Cas9構(gòu)建ApoE基因敲除巴馬豬，成功獲得動(dòng)脈粥樣硬化的豬模型。張緯［19］利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建C3基因敲除豬模型，成功獲得免疫缺陷豬模型。

圖4 GGTA1和β4GalNT2單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果

近期，有通過(guò)其他方法得到基因敲除的豬，如胚胎注射一步法［20］、體細(xì)胞 LOH 突變法等［21-22］。有研究得到了GGTA1/β4GalNT2雙基因敲除巴馬小型豬，但是，其研究得到的GGTA1/β4GalNT2雙基因敲除巴馬小型豬是利用CRISPR/Cas9技術(shù)，在GGTA1基因敲除豬基礎(chǔ)上再一次克隆敲除β4GalNT2基因［23］。這些方法使用單細(xì)胞培養(yǎng)的方法得到單細(xì)胞克隆效率低、周期長(zhǎng)。本研究是利用CRISPR/Cas9技術(shù)同時(shí)將GGTA1/β4GalNT2兩個(gè)基因從細(xì)胞水平敲除得到的，大大提高了雙基因敲除的效率，節(jié)省了時(shí)間，而且，篩選單克隆細(xì)胞的方法也有所不同，本研究的步驟簡(jiǎn)化，技術(shù)也更加成熟。測(cè)序的結(jié)果顯示，在設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)位置會(huì)出現(xiàn)不同形式堿基缺失和插入的突變，雙基因敲率為16%，說(shuō)明CRISPR/Cas9技術(shù)在雙基因編輯中的高效性。在后期的實(shí)驗(yàn)中我們會(huì)繼續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和操作以期得到更高的敲除效率。

本實(shí)驗(yàn)得到大量GGTA1/β4GalNT2雙基因敲除巴馬小型豬胚胎成纖維細(xì)胞為后續(xù)大批量獲得雙敲的巴馬豬打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)，成功獲得了GGTA1/β4GalNT2雙基因同時(shí)敲除的PFFs細(xì)胞系，經(jīng)SCNT獲得雙敲的巴馬小型豬豬胚胎，為異種移植提供研究材料。