氨基硅膠固定脂肪酶的制備及其酶學性質研究

徐 然，韓生華，王利剛，李春成，劉之博

(1.山西大同大學化學與環(huán)境工程學院，山西大同037009;2.南京信息工程大學，江蘇南京210044)

脂肪酶(Lipase)是一類羧基酯水解酶，可催化酯類物質的解酯、酯交換以及酯合成等反應[1]。與普通化學催化劑相比，脂肪酶具有高催化活性、高特異性以及綠色環(huán)保性等優(yōu)點[2]，已逐步應用于日化、能源、醫(yī)藥以及食品等領域[3-4]。然而，游離狀態(tài)的脂肪酶穩(wěn)定性差、成本高、無法回收利用，使得脂肪酶難以進一步被工業(yè)化應用[5]。脂肪酶固定化技術的出現(xiàn)及發(fā)展逐步解決了游離脂肪酶的這些缺點[6]。脂肪酶固定化技術是指通過某些化學或者物理的方法將脂肪酶限制在特定的空間范圍內發(fā)生酶促反應的技術[7-8]。常用的脂肪酶固定化技術包括吸附法、交聯(lián)法、包埋法以及共價結合法[9-10]，其中，共價結合法制備的固定化脂肪酶具有穩(wěn)定性高、不易失活等優(yōu)點更受到廣泛研究。

我們采用共價結合法制備固定化脂肪酶，并對固定條件進行了優(yōu)化，對固定后脂肪酶的酶學性質進行了研究，以期為其今后工業(yè)化應用提供參考。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器與試劑

DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器、HH-S2兩孔水浴鍋、SHZ-D循環(huán)水式真空泵，購自鞏義市予華儀器有限責任公司；MA200電子天平，購自上海良平儀器儀表有限公司；101AB-1 電熱鼓風干燥箱，購自菏澤市石油化工學校儀器設備廠；KDM 電熱套，購自山東省鄄城大華儀器廠；SB—5200DTDN超聲波清洗機，購自寧波新芝生物科技股份有限公司。

脂肪酶，實驗室自制（酶活力：6.08×104μmol/g)；戊二醛50%，天津市河東區(qū)紅巖試劑廠；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、無水乙醇、聚乙烯醇均為分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司；橄欖油，成都科龍化工試劑廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 醛基硅膠的制備

取實驗室自制氨基硅膠（氨基鍵含量為1.019 1 mmol/g）于錐形瓶中，加入適量一定濃度的戊二醛溶液，在室溫下攪拌反應。將反應之后的溶液抽真空過濾，用去離子水將多余的戊二醛沖洗干凈，于室溫下干燥后對固體進行收集。

1.2.2 脂肪酶的固定化

取0.5 g 上述醛基硅膠，加入5 mL 1 mg/mL 的脂肪酶液和5 mL pH為7.5的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液，在室溫下磁力攪拌6 h。將反應后的溶液進行抽真空過濾，分別對濾液及固定酶進行收集，固定酶于室溫下干燥備用。

分別對加入反應的游離酶、反應后的濾液以及固定酶進行酶活的測定，以下列公式進行酶活回收率的計算：

1.2.3 脂肪酶活力測定

采用橄欖油乳化法對酶活進行測定。

將5.0 mL 乳化劑和4.0 mL 0.1 mol/L pH 為8.0的磷酸緩沖液分別加入到空白a、樣品b和樣品c錐形瓶中，于40 ℃恒溫水浴鍋里保溫5.0 min，樣品b、c 加入1.0 mL 待測酶液反應10.0 min 后，分別向3 個瓶子中加入20.0 mL 無水乙醇同時終止反應。加入酚酞作指示劑，用NaOH 溶液滴定反應出來的脂肪酸，當溶液變微紅時記錄滴定過程所用NaOH的體積量。

式中：a—空白 a 消耗的 NaOH 溶液的體積，b、c—樣品b、c消耗的NaOH 溶液的體積，N—NaOH的濃度，F(xiàn)—稀釋倍數(shù)，T—反應所需時間（min）

2 結果與討論

2.1 脂肪酶固定化條件的優(yōu)化

2.1.1 戊二醛濃度對酶固定化的影響

分別采用0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的戊二醛進行優(yōu)化，戊二醛濃度對酶固定化的影響見圖1。隨著戊二醛濃度的增大，酶活回收率呈先上升后下降趨勢，在戊二醛濃度為1.5%時，酶活回收率最大。這是因為在戊二醛濃度較低時，可與酶結合的醛基數(shù)量較少。當戊二醛濃度提高時，有更多的醛基與氨基硅膠中氨基發(fā)生結合，相應的固定化酶的數(shù)量也有所提高，故酶的固定率提高。但戊二醛濃度過大時，與醛基發(fā)生鍵合的酶量增加，這使得酶催化反應的空間位阻也增加，從而導致酶活回收率下降。

圖1 戊二醛濃度對酶活回收率的影響

2.1.2 給酶量對酶固定化的影響

分別采用0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/ mL 的脂肪酶溶液進行優(yōu)化，給酶量對酶固定化的影響結果如圖2。在酶的濃度低于0.5 mg/mL 時，其酶活回收率隨濃度的提高而提高。在酶濃度為0.5 mg/ mL時，酶活回收率最大。繼續(xù)增大酶濃度，其酶活回收率反而降低。

圖2 酶液濃度對酶活回收率的影響

當脂肪酶濃度較低時，脂肪酶可以充分與醛基硅膠結合，固定化脂肪酶的酶活回收率取決于加入的脂肪酶的濃度，當脂肪酶濃度升高時，相應的固定酶的酶活回收率也增加。當脂肪酶濃度持續(xù)增大時，脂肪酶分子間會競爭結合醛基硅膠增加空間位阻，反而造成酶活回收率降低。

2.1.3 pH對酶固定化的影響

分別采用pH 為5.5、6.5、7.5、8.5、9.0 進行優(yōu)化，酸堿度對酶固定化的影響如圖3。在pH 低于7.5時，酶活回收率隨pH 的升高而提高；在pH 為7.5時，酶活回收率最大。此后繼續(xù)增大pH，酶活回收率呈下降趨勢。

pH 的大小會影響脂肪酶的帶電荷量、空間構象以及酶活性基團的解離狀態(tài)。pH 會改變酶的微觀結構，從而改變酶的催化能力。過酸或過堿的環(huán)境都會引起酶的空間結構發(fā)生變化而失去活力。

圖3 pH對酶活回收率的影響

2.1.4 固定時間對酶固定化的影響

分別采用3、6、12、15、18 h 固定時間進行優(yōu)化。固定時間對酶固定化的影響如圖4。在固定時間少于6 h 時，酶活回收率隨著固定時間的增加而顯著提高；在固定時間為6 h 時，酶活回收率達到最大。繼續(xù)增加反應時長，所測得的酶活回收率略微下降。

圖4 固定時間對酶活回收率的影響

圖中出現(xiàn)這樣的趨勢是因為酶活性高低不僅僅取決于其與醛基鍵合的時間，同時也受到戊二醛變性作用的影響。隨著反應時間的延長，二者之間的鍵合反應進行的越完全，酶的固定量也高，但過度的鍵合反應會引起蛋白質的變性，同時固定后的酶也會隨時間而出現(xiàn)一定程度的失活。

2.1.5 溫度對酶固定化的影響

分別采用0、20、30、40、50 ℃ 進行優(yōu)化。溫度對脂肪酶固定化的影響如圖5。酶活回收率隨著溫度的升高呈先增加后下降的趨勢，在固定溫度為30 ℃時，酶活回收率最大為49.6%。

圖5 溫度對酶活回收率的影響

溫度對脂肪酶的影響很大，在一定范圍內，升溫能使酶的固定速度增加。但溫度過高會導致酶蛋白的化學結構發(fā)生變形，從而使酶蛋白變性，所以超出一定的溫度范圍會使脂肪酶失活而影響酶活回收率。

2.2 游離脂肪酶和固定化脂肪酶酶學性質的比較

2.2.1 最適反應溫度的比較

將游離脂肪酶和固定化脂肪酶分別放入10、20、30、35、40 及50 ℃ 的催化溫度下測定酶活，結果如圖6。游離酶經(jīng)固定化后其酶學性質中的最適反應溫度由40 ℃降低到35 ℃，這是因為酶的剛性結構發(fā)生了變化。但隨著溫度的升高，兩種脂肪酶的酶活都會大幅度下降，是因為過高的溫度會導致酶蛋白的空間結構發(fā)生改變而失活。

圖6 游離脂肪酶和固定化脂肪酶的反應溫度曲線

2.2.2 最適反應pH的比較

將游離脂肪酶和固定化脂肪酶在其各自最適溫度下分別放入pH 為5.5、6.5、7.5、8.0、8.5、9.0 的催化環(huán)境中測定酶活。結果如圖7，游離酶和固定酶的最適反應pH均為8。在其他條件相同的情況下，pH不僅可以影響酶的活性，同樣會影響反應底物的解離狀態(tài)。過高或過低的pH都不利于酶的催化。

圖7 游離脂肪酶和固定化脂肪酶的反應pH曲線

2.2.3 熱穩(wěn)定性分析

將游離脂肪酶和固定化脂肪酶分別放置在30、40、50、60、70 ℃的環(huán)境中1 h后再測定其脂肪酶活力，以各自酶活損失百分比（損失酶活占初始酶活的百分數(shù)）為縱坐標，溫度為橫坐標作圖8。

圖8 脂肪酶的酶活損失百分比圖

在不同的溫度下放置1 h 后，可以看出，在任何溫度下，游離脂肪酶比固定化脂肪酶的酶活損失都要高。酶分子的伸展變形以及分子的自我變形可能是酶失活的主要原因，而固定化酶中載體的存在增加了酶分子的剛性阻止了它的變形。但隨著溫度逐漸升高，酶活損失量不斷增加，這是因為增加的剛性是有一定限度的。

2.2.4 有機溶劑穩(wěn)定性分析

將游離酶和固定酶分別放置于10 mL 的甲醇、丙酮、石油醚、環(huán)己烷溶液中1 h 后測定其脂肪酶活力。酶在有機相中的穩(wěn)定性是影響其能否長時間且有效進行催化反應的重要因素。以酶活損失百分比為縱坐標，各種有機溶劑為橫坐標作圖9?？梢钥闯鲈诜菢O性有機溶劑環(huán)己烷中兩種酶酶活損失較少，而在極性溶劑如丙酮、甲醇中酶活損失較多。但總體上固定酶在有機溶劑中損失酶活量較少，比游離酶在有機相中更穩(wěn)定。

2 種酶在有機溶劑中的酶活都降低了，且酶在非極性有機溶劑的耐受性要高于在極性有機溶劑，如在環(huán)己烷中的酶活始終高于在甲醇中的酶活，這可能是由于非極性溶劑不易奪取酶構象中的必需水，而極性溶劑恰恰相反，從而導致酶活性中心結構發(fā)生變化而使酶失去活性。所以，脂肪酶在有非極性有機溶劑中難失活的性能有助于推動有機相催化反應的發(fā)展。

2.2.5 重復使用性分析

對游離脂肪酶和固定化脂肪酶分別進行重復使用性分析，結果如圖10。游離脂肪酶無法進行回收再利用，沒有重復利用性。固定化脂肪酶經(jīng)過6次重復使用之后，仍有38.24 %的初始固定酶活。重復使用性是固定化脂肪酶的一大特點，將有助于降低使用成本、實現(xiàn)工業(yè)化應用。

圖10 固定化酶的重復利用性曲線

2.2.6 儲存穩(wěn)定性

將游離脂肪酶和固定化脂肪酶分別放置于室溫環(huán)境下，并在每天固定時間點測定酶活力。酶的活性會隨著儲存時間的延長而逐漸下降，擁有好的穩(wěn)定性會使其更適合在工業(yè)等方面的應用。以相對酶活率為縱坐標，時間為橫坐標作圖11?？梢钥闯觯潭ɑ久傅姆€(wěn)定性比游離脂肪酶更好，在放置5 d后仍有34.12%的初始固定酶活。

圖11 酶的儲存穩(wěn)定性曲線

3 結論

采用共價結合法將游離脂肪酶固定于自制氨基硅膠上，通過優(yōu)化固定條件可使其酶活回收率達到49.6%。并進一步對比了游離脂肪酶與固定化脂肪酶的酶學性質，表明脂肪酶經(jīng)固定后，不僅獲得了重復使用性，且其熱穩(wěn)定性、有機溶劑穩(wěn)定性及儲存穩(wěn)定性都得到增強。固定化脂肪酶將極大降低游離脂肪酶的使用成本，為其今后工業(yè)化應用提供參考。