青春期雙酚A暴露對雌鼠情緒和社會行為的影響

殷張昕， 高彤彤， 莊紫薇， 鐘曉宇， 李季穗，王文波， 姜科聲， 胡一中， 徐曉虹

(浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004)

0 引 言

BPA是酚類化合物中具有代表性的一類環(huán)境內分泌干擾物,因其可以改進塑料制品的可塑性和拉伸性而大量應用于生產碳酸聚酯、環(huán)氧樹脂類食品飲料包裝材料、醫(yī)療用品和日常用品,導致人們和野生動物的終生BPA暴露風險.2008年美國健康食品安全檢查報告調查2 517人中有92.6%的尿液檢出BPA,兒童和青少年體內BPA含量更高[1].BPA的化學結構類似己烯雌酚,可與ER結合而表現(xiàn)出弱雌激素活性，從而干擾內源性激素對機體生理活動的調節(jié),對人類和野生動物的生殖和發(fā)育產生危害[1-2].據(jù)此,歐美制定了人群BPA的最低容許攝入量為50 μg·kg-1·d-1.然而,近十多年的研究發(fā)現(xiàn),低劑量BPA(<50 μg·kg-1·d-1)可影響人和動物的腦和行為發(fā)育[3-5].出生早期BPA暴露可引起雌性大鼠青春期提前[6],妊娠期BPA暴露加重青春期仔鼠的焦慮和抑郁樣狀態(tài)[7],并消除焦慮和抑郁行為的性別差異[8-9],還可影響腦內神經元突觸發(fā)育[10].

青春期是腦發(fā)育和社會認知形成的關鍵時期,此時開始發(fā)育的性腺分泌性激素,對社會行為的神經環(huán)路成熟和功能起激活作用,對社會行為的形成及其性別分化非常重要[11].社會玩耍是最早發(fā)生于非母親指向的幼年至青春期同種個體間的社會行為,有利于個體社會技能和認知功能發(fā)育.早期社會隔離和玩耍剝奪會減少青少年社會動機,使成年后社會互作減少,攻擊行為增加,并影響性行為[12].社會行為異常還是早期精神發(fā)育障礙的主要癥狀,自閉癥和早發(fā)性精神分裂癥患者在兒童至青春期即表現(xiàn)出社會玩耍和社會互作減少[13].青春期性激素對社會行為神經環(huán)路成熟和功能激活的重要作用,使青春期的腦對環(huán)境內分泌干擾物非常敏感[14].流行病學研究發(fā)現(xiàn),出生前后BPA暴露導致兒童攻擊、注意缺陷、多動障礙、焦慮和抑郁等多種精神和情緒異常[15].因此,推測青春期暴露于BPA很有可能影響雌性動物的社會行為,但目前國內外還沒有相關報道.本文探討了青春期BPA暴露對雌鼠情緒和社會行為的影響,并分析是否與DA遞質系統(tǒng)活動的改變有關.

1 材料和方法

1.1 實驗動物、模型制備與分組

3周齡ICR雌性小鼠購于浙江省醫(yī)學科學院動物中心,常規(guī)飼養(yǎng)適應1周后,參考人群日常暴露水平,設3個BPA暴露組:0.04,0.40,4.00 mg·kg-1·d-1(根據(jù)體表面積藥理劑量換算相當于人體暴露水平:3.24,32.4,324 μg·kg-1·d-1)和溶媒對照組(油).每天灌胃染毒BPA連續(xù)3周,制備青春期BPA暴露模型.每組小鼠分2籠飼養(yǎng).在8周齡(青年期)時,每組隨機從各籠中取12只小鼠進行行為檢測(n=12),另取未進行行為測試的8只小鼠眼眶取血,酶聯(lián)免疫分析法檢測小鼠腦和血清雌二醇(estradiol,E2)水平(n=8),取6只小鼠提取腦紋狀體組織用于蛋白表達檢測(n=6),最后分離子宮稱重,計算子宮系數(shù)(子宮質量/體質量).

1.2 行為測試

行為測試按以下順序進行.整個過程用小動物行為分析系統(tǒng)(德國TSE 系統(tǒng)股份有限公司)記錄.每一行為結束后,隔天進行下一個行為檢測.每只小鼠測試后用75%乙醇擦拭模型,防止氣味影響下一個動物的行為.所有行為由小動物行為分析系統(tǒng)自動監(jiān)測記錄,并由經過訓練的人員采用雙盲法采集和分析數(shù)據(jù).

采用曠場行為[16]記錄小鼠5 min內的跑動穿越格數(shù)、中央區(qū)停留時間、站立和理毛次數(shù)(n=12).其中,跑動格數(shù)反映動物在新異環(huán)境中的自發(fā)活動性,站立次數(shù)反映動物的探究意愿,中央區(qū)停留時間反映焦慮狀態(tài).

采用社會玩耍行為[16]記錄15 min內2只相同年齡和處理的陌生小鼠互相爬跨、追逐、打斗、理毛和嗅探等玩耍指標,其中互相理毛和嗅探作為社會探索(n=12)[17].

采用三室模型[16]記錄5 min內待測小鼠分別在含陌生鼠圓筒或含空圓筒的隔間所停留時間，以及對陌生鼠或空圓筒的嗅探時間來檢測小鼠的社會交互能力(n=12).測試小鼠在含陌生鼠隔間停留或嗅探陌生鼠的時間越長,社會交互能力越強[18].

采用高架十字迷宮[16]記錄5 min內動物在開放臂的停留時間來評價焦慮情緒,中央區(qū)探頭次數(shù)反映動物的探究意愿(n=12).

采用強迫游泳模型[16]檢測動物的習得性無助而評價其抑郁狀態(tài)[19].記錄小鼠從游泳開始至出現(xiàn)第1次靜止不動的時間記為潛伏期;記錄6 min強迫游泳期的后4 min內小鼠靜止不動的總時間.靜止不動的潛伏期越短或靜止不動總時間越長表示抑郁越嚴重(n=12).

1.3 Western Blot檢測紋狀體組織ERβ，DAT和 DR1蛋白表達水平

小鼠(8周齡)斷頸處死后取腦,4 ℃分離雙側紋狀體組織,制備蛋白樣品分裝,-20 ℃保存?zhèn)溆?n=6).取10～20 μL蛋白樣品SDS-PAGE凝膠電泳,將蛋白濕轉至硝酸纖維素膜(NC)上,封閉,分別加相應一抗(β-actin(1∶1 000),ER-β(1∶400),DAT(1∶500),DR1(1∶600))孵育,漂洗,再將NC膜與辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗孵育,漂洗,用免疫化學發(fā)光試劑顯色,X片曝光后顯影、掃描,Quantity One軟件半定量分析蛋白條帶光密度.

1.4 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)用平均值±標準誤差(M±SE)表示,采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件通過單因素方差分析不同劑量BPA暴露的作用,進行Post-hoc 測試后LSD檢驗,P<0.05表示具有顯著性差異,P<0.01表示具有極顯著性差異.

2 結果與分析

2.1 青春期BPA暴露對雌鼠生長發(fā)育的影響

青春期0.04,0.40,4.00 mg·kg-1·d-1BPA暴露沒有明顯改變青年雌鼠體質量和子宮系數(shù),提示青春期低劑量BPA暴露對小鼠的生長和生殖器官發(fā)育沒有明顯影響(見表1).

表1 BPA對雌鼠體質量和子宮系數(shù)的影響

2.2 青春期BPA暴露對雌鼠曠場行為的影響

4.00 mg·kg-1·d-1BPA顯著減少小鼠在曠場中懸空站立次數(shù)(P<0.05),0.40,4.00 mg·kg-1·d-1BPA顯著減少小鼠在中央區(qū)的停留時間(P<0.05),提示青春期BPA暴露顯著降低小鼠的探究意愿,并提高其焦慮狀態(tài)(見表2).

表2 青年雌鼠的曠場行為(n=12)

注：與對照組相比,*表示具有顯著性差異(P<0.05).

2.3 青春期BPA暴露對雌鼠高架十字迷宮和強迫游泳行為的影響

高架十字迷宮行為測試結果顯示,青春期0.40和4.00 mg·kg-1·d-1BPA暴露顯著縮短小鼠在開放臂的停留時間(P<0.01,P<0.05),延長其在封閉臂的停留時間(P<0.05),0.04,0.40,4.00 mg·kg-1·d-1BPA顯著減少小鼠中央區(qū)探頭次數(shù)(均為P<0.05)(見表3).強迫游泳測試結果顯示,0.40和4.00 mg·kg-1·d-1BPA顯著了縮短小鼠強迫游泳時第1次靜止不動的潛伏期(P<0.05)和增加了靜止不動的總時間(P<0.05)(見圖1a～b),提示青春期BPA暴露加重雌鼠的焦慮和抑郁樣情緒,降低了其探究的意愿.

表3 青年雌鼠的高架十字迷宮行為(n=12)

注：與對照組相比,*表示具有顯著性差異(P<0.05);**表示具有極顯著性差異(P<0.01).

2.4 青春期BPA暴露對雌鼠社會玩耍和社會交互能力的影響

社會玩耍行為測試中,青春期0.40和4.00 mg·kg-1·d-1BPA暴露顯著減少小鼠的社會玩耍時間(P<0.05),0.04,0.40,4.00 mg·kg-1·d-1BPA顯著減少社會探索時間(P<0.05,P<0.01)和探索頻率(4.00 mg·kg-1·d-1BPA，P<0.01);三室模型檢測結果顯示,與對照組相比,BPA暴露雖然沒有明顯改變小鼠對陌生鼠或空圓筒的嗅探時間,但0.40和4.00 mg·kg-1·d-1BPA顯著降低了小鼠嗅探陌生鼠和嗅探空圓筒的時間比(P<0.05),提示青春期BPA暴露不僅顯著降低小鼠的社會玩耍能力,還減弱其社會探究意愿和社會交互能力(見表4).

表4 青年雌鼠的社會玩耍和社會交互能力(n=12)

注：與對照組相比,*表示具有顯著性差異(P<0.05);**表示具有極顯著性差異(P<0.01).

2.5 青春期BPA暴露對成年雌鼠紋狀體DAT和DR1表達的影響

鑒于紋狀體的DA遞質系統(tǒng)在情緒和社會行為中的關鍵作用,實驗進一步分析了紋狀體DA轉運體(DAT)和DA的D1受體(DR1)蛋白表達水平.研究結果顯示,0.40和4.00 mg·kg-1·d-1BPA顯著上調DA轉運體(DAT)的表達水平(P<0.05，P<0.01),0.04,0.40,4.00 mg·kg-1·d-1BPA顯著上調DR1的表達水平(P<0.05，P<0.01)(見圖2a～b).

與對照組相比,*表示具有顯著性差異(P<0.05);**表示具有極顯著性差異(P<0.01)

2.6 青春期BPA暴露對青年雌鼠腦和血清雌激素水平以及紋狀體ERβ表達的影響

由于雌激素通過腦內雌激素受體參與調節(jié)情緒和社會行為,而紋狀體又與情緒和社會行為密切相關,實驗檢測了腦和血清的雌二醇水平,并用Western Blot分析了紋狀體ERβ蛋白表達.研究結果顯示,青春期0.04,0.40,4.00 mg·kg-1·d-1BPA暴露沒有明顯改變青年雌鼠腦和血清雌二醇水平(見圖3a～b),但0.40和4.00 mg·kg-1·d-1BPA顯著下調紋狀體ERβ表達水平(P<0.01)(見圖3c).

與對照組相比,*表示具有顯著性差異(P<0.05);**表示具有極顯著性差異(P<0.01)

3 討 論

青春期作為兒童到成年的一個過渡期,性腺開始發(fā)育,此時分泌的性激素對腦和行為發(fā)育至關重要.有人認為在出生前后,腦內性激素主要調控行為相關神經環(huán)路的形成;而在青春期,性激素對這些環(huán)路的成熟和功能起激活作用,是腦和行為發(fā)育的第2個關鍵期[11].因此,青春期的腦對環(huán)境內分泌干擾物很敏感.在動物的一生中,最早非母親指向的社會行為發(fā)生在幼年至青春期個體間的玩耍.社會玩耍從社會探究開始,表現(xiàn)為2只陌生小鼠通過相互嗅探熟悉對方,進行追逐、打斗、理毛和爬跨等玩?；顒?是社會交互的一種形式,也是個體融入社會的開始[17-18],對動物的生存和成年后的繁殖至關重要.

近年來動物研究發(fā)現(xiàn),宮內暴露于BPA的青春期獼猴和小鼠與同性同伴的社會互動減少,該行為的性別差異被擾亂[20-21],圍生期BPA暴露減少青春期雌鼠的社會探究行為[22],但目前還不了解青春期BPA暴露對社會行為的影響,其機制更不清楚.實驗發(fā)現(xiàn),青春期BPA暴露顯著降低雌鼠的社會玩耍能力,并減少其相互嗅探和相互接觸等社會探索行為.同時在三室模型的陌生同伴和空圓筒的選擇中,一般動物更愿意與陌生同伴接觸,即具有一定的社會探究意愿.但青春期BPA暴露的雌鼠成年后接觸陌生鼠的時間有所縮短,而對空圓筒的接觸時間延長,明顯降低陌生鼠/空圓筒的嗅探時間比,表明青春期BPA暴露降低雌鼠成年后社會玩耍及社會探索意愿,減弱其社會互作能力.

情緒是影響動物社會行為的一個因素,焦慮和抑郁狀態(tài)的動物往往表現(xiàn)出較差的社會玩耍和社會交互能力.流行病學研究發(fā)現(xiàn),妊娠期母體尿液高BPA水平與3～12歲兒童表現(xiàn)出的高焦慮和抑郁情緒、及多動癥相關[23-24].出生前后BPA暴露的兒童還表現(xiàn)出攻擊行為、自閉癥等多種精神和情緒異?，F(xiàn)象[15].本研究結果顯示,0.40和4.00 mg·kg-1·d-1的BPA加重雌鼠在高架十字迷宮中的焦慮樣狀態(tài)和強迫游泳時的抑郁樣情緒,同時,這2個劑量的BPA降低小鼠的社會玩耍和社會交互能力,提示青春期BPA暴露導致的動物社會行為減弱可能與其加重的焦慮抑郁樣情緒有關.

作為一種高級動機行為,社會行為具有獎賞價值,動物在與同伴、后代或性伴侶的社會互作中得到獎賞[25].因此,社會動機和獎賞是社會行為的動力.研究發(fā)現(xiàn),與高級動機行為相關的中腦腹側背蓋區(qū)-紋狀體的DA獎賞通路對社會行為發(fā)育至關重要[11].大鼠中腦神經元DA合成限速酶、紋狀體DA受體密度均在青春期達到高峰后回落到成年水平,提示DA獎賞系統(tǒng)在青春期社會行為發(fā)育中的重要作用[4，11].Trezza等[25]發(fā)現(xiàn)社會玩耍伴隨著前腦和紋狀體DA水平升高,DA傳遞阻斷可減少社會玩耍,而Manduca等[26]發(fā)現(xiàn)注射DA再攝取抑制劑安非他命增加社會玩耍行為.筆者的實驗室發(fā)現(xiàn),0.40和4.00 mg·kg-1·d-1的BPA暴露上調紋狀體DAT表達水平.DAT是一種位于多巴胺能神經元突觸前膜上的多巴胺轉運蛋白,可將釋放至突觸間隙的多巴胺主動轉運再攝取回突觸前.BPA暴露導致DAT蛋白表達水平升高,加快對突觸間隙DA的移除而導致紋狀體突觸前DA能神經纖維末梢DA傳遞效應減弱.同時,實驗發(fā)現(xiàn)BPA還上調紋狀體DA受體DR1表達水平.腦內DR1被認為在社會行為中起重要作用,抑制紋狀體DR1可促進社會互作和社會探究等親社會行為[27].最近有報道表明，出生前后BPA暴露改變小鼠中腦DA系統(tǒng)和嗎啡獎賞活動[4],上調DA轉運體基因,上調邊緣前腦DR1而下調DR2[28],這與筆者的發(fā)現(xiàn)相一致.因此,青春期BPA暴露引起的紋狀體DA遞質系統(tǒng)功能改變可能是其影響雌性動物社會行為異常的一個原因.

內源性性激素對相關腦區(qū)的調節(jié)是青春期腦和行為發(fā)育性別差異的主要原因.給發(fā)育中的腦注射睪酮可使青春期雌鼠的玩耍行為雄性化,腦內ER敲除的小鼠社會探究、攻擊和性行為均減少[11].實驗發(fā)現(xiàn),低劑量BPA暴露沒有明顯改變腦和血清的雌二醇水平,但是下調了與社會行為密切相關的紋狀體腦區(qū)ERβ蛋白表達.雌激素調節(jié)腦和行為主要通過ER介導,其中腦功能和非生殖相關行為主要由ERβ介導.在以往的研究中實驗室曾發(fā)現(xiàn),長期暴露BPA下調雌鼠ERβ水平[29].因此,青春期BPA暴露可能通過下調腦內ERβ水平而抑制雌激素對社會行為的調節(jié).

4 結 論

綜上分析,青春期暴露于低劑量BPA可減少雌鼠社會玩耍,降低其社會探究意愿和社會互作能力.該作用可能與紋狀體腦區(qū)ERβ水平下調而干擾雌激素對相關腦區(qū)DA遞質系統(tǒng)活動的調節(jié)有關,最后導致社會行為改變.鑒于杏仁核和前額葉與焦慮抑郁情緒相關,今后將進一步探討其在BPA影響情緒中的作用.本研究發(fā)現(xiàn)BPA影響社會行為和情緒的有效劑量為0.40,4.00 mg·kg-1·d-1,根據(jù)體表面積換算成人的藥理劑量為0.032 4，0.324 0 mg·kg-1·d-1,該劑量遠低于現(xiàn)有BPA的無不良效應極限值(50 mg·kg-1·d-1).因此,BPA對神經行為發(fā)育的低劑量毒性作用應引起重視.