附子水溶性生物堿含量測定與道地性相關(guān)分析

羅春梅，夏燕莉，黃志芳，湯依娜，劉云華，劉玉紅，陳 燕，易進(jìn)海*

1四川省中醫(yī)藥科學(xué)院 中藥材品質(zhì)及創(chuàng)新中藥研究四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041；2成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，成都 610106

附子為毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliiDebx.的子根的加工品[1]，為臨床常用有毒中藥，具有回陽救逆、補(bǔ)火助陽、散寒止痛等功效，被歷代醫(yī)家稱為“最難用亦最有用的藥材”[2,3]。附子主要種植在我國西南地區(qū)，主產(chǎn)區(qū)分布在四川江油、四川布拖、陜西漢中及云南等地，其中江油為公認(rèn)的附子傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)，質(zhì)量上乘，有長達(dá)1 300余年栽培歷史，具有成熟而獨(dú)特的栽培和加工技術(shù)[4]。為了滿足市場需求，其他非道地產(chǎn)區(qū)附子運(yùn)往江油加工后作為江油附片混淆銷售，使江油附子的道地品牌和品質(zhì)受到嚴(yán)重影響。目前，附子道地性的形成機(jī)制尚不清楚，市場上附片品種較多，質(zhì)量參差不齊。因此，尋找區(qū)分道地產(chǎn)區(qū)附子與非道地產(chǎn)區(qū)附子的特征性差異成分，對附子及附片的質(zhì)量進(jìn)行有效控制成為亟待解決的問題。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，水溶性生物堿為附子的重要活性成分，具有強(qiáng)心[5-8]、抗心律失常、抗炎鎮(zhèn)痛、降壓等作用[9-12]。絕大部分水溶性生物堿不含紫外吸收基團(tuán)，不能采用常規(guī)的HPLC-UV法進(jìn)行檢測[13]。張定堃等[14]采用UPLC-Q-TOF-MS法分析出尼奧靈、宋果靈等7種可能為區(qū)分不同產(chǎn)地附子的差異成分，林俊芝等[15]也采用UPLC-Q-TOF/MS法證實(shí)尼奧林、附子靈等在江油附子中含量較高。本課題組預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，江油附子中尼奧靈含量的確明顯高于其他產(chǎn)區(qū)，故收集江油、陜西、布拖、云南四個(gè)產(chǎn)區(qū)42批泥附子，以及9批由江油附子炮制加工的生附片、蒸附片、炒附片，采用HPLC-ELSD法測定尼奧靈、附子靈及宋果靈3種主要水溶性生物堿的含量，進(jìn)行水溶性生物堿含量與道地性的相關(guān)分析，為附子的道地性鑒別及附片的質(zhì)量控制提供新方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀，Agilent 1260 Infinity 蒸發(fā)光散射檢測器(美國Agilent公司)，MS205DU型十萬分之一分析天平(瑞士梅特勒-托利多有限公司)，Milli-Q Integral 3型超純水機(jī)(美國Millipore公司)，KQ-300超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)，冷凍干燥機(jī)，ST16R型臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Thermo Scientific公司)。

1.2 材料

附子靈(批號MUST-16032804)、尼奧靈(批號MUST-16052503)、宋果靈(批號MUST-16032515)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%(成都曼思特生物科技有限公司)，色譜純乙腈、甲醇(美國Fisher公司)，色譜純?nèi)野?成都市科龍化工試劑廠)，其余試劑均為分析純。42批鮮附子采自四川江油、陜西漢中、四川布拖、云南，編號分別為JY 1～JY 10，SX 1～SX 8，BT 1～BT 13，YN 1～YN 11，江油附子炮制加工的生附片、蒸附片、炒附片購于四川江油中壩附子科技發(fā)展有限公司，編號分別為SFP 1～SFP 3，ZFP 1～ZFP 3，CFP 1～CFP3，由成都大學(xué)夏燕莉教授鑒定為毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliiDebx.的子根，樣品信息來源見表1，不同產(chǎn)區(qū)附子圖片見圖1。

圖1 江油(A)、陜西(B)、布拖(C)、云南(D)產(chǎn)區(qū)泥附子外觀性狀Fig.1 Appearance of crude Fuzi from Jiangyou (A),Shaanxi (B),Butuo (C) and Yunnan (D)

表1 不同產(chǎn)區(qū)附子及附片信息

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對照品儲(chǔ)備液的制備

取各對照品適量，精密稱定，加50%甲醇溶液制成每1 mL含附子靈0.3 mg，尼奧靈0.35 mg，宋果靈0.15 mg的混合對照品儲(chǔ)備溶液。

2.2 供試品溶液的制備

42批鮮附子洗凈泥沙，晾干后切成薄片冷凍干燥，粉碎(過60目篩)備用。各批次附片粉碎，過60目篩備用。取上述附子和附片粉末約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入0.05 mol/L鹽酸溶液25 mL，搖勻，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，搖勻，于8 000 rpm離心6 min，取上清液，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.3 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)

色譜柱：Agilent Extend C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%(體積分?jǐn)?shù))三乙胺(B)，梯度洗脫(0～8 min，10%～20% A；8～15 min，20%～25% A；15～25 min，25%～25% A；25～30 min，25%～28% A；30～31 min，28%～50% A；31～38 min，50%～55% A；38～48 min，55%～90% A)；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測器：蒸發(fā)光散射檢測器，以氮?dú)鉃檩d氣，蒸發(fā)溫度50 ℃，載氣流速1.2 L/min，增益為1；進(jìn)樣量40～80 μL。在上述色譜條件下，混合對照品、附子及附片樣品的HPLC圖見圖2。

圖2 對照品(A)、江油附子(B)、陜西附子(C)、布拖附子(D)、云南附子(E)、生附片(F)、炒附片(G)及蒸附片(H)的HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of reference substances(A),crude Fuzi of Jiangyou(B),Shaanxi (C),Butuo(D) and Yunnan(E),Sheng Fupian(F),Chao Fupian(G) and Zheng Fupian(H)注：1.附子靈；2.尼奧靈；3.宋果靈。Note:1.fuziline;2.neoline;3.songorine.

2.4 線性與范圍、檢測限與定量限

分別精密吸取“2.1”項(xiàng)下混合對照品儲(chǔ)備液0.5、1、3、6、8、10 mL，分別置10 mL量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列混合對照品溶液。吸取上述混合對照品溶液20 μL，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測定色譜峰面積。以峰面積的對數(shù)值為縱坐標(biāo)(Y)，對照品進(jìn)樣量的對數(shù)值為橫坐標(biāo)(X)，進(jìn)行線性回歸分析，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)；將混合對照品溶液逐級稀釋后進(jìn)樣測定，以色譜圖中信噪比S/N為3∶1和S/N為10∶1確定檢測限和定量限，結(jié)果見表2。

表2 3種生物堿的線性與范圍、檢測限與定量限

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液(ZFP1)80 μL，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計(jì)算峰面積的RSD。結(jié)果顯示，附子靈、尼奧靈、宋果靈的RSD分別為2.47%、2.84%、1.22%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液(ZFP1)，室溫下放置，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣80 μL，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件分析，附子靈、尼奧靈、宋果靈峰面積的RSD分別為2.11%、3.56%、3.85%，表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品(ZFP1)，精密稱取6份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件分析，進(jìn)樣80 μL，測得附子靈、尼奧靈、宋果靈含量的平均值(n=6)分別為0.308 6、0.832 5、0.252 9 mg/g，RSD分別為0.71%、2.54%、1.24%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的同一批樣品(ZFP1)6份，每份約0.5 g，精密加入混合對照品溶液適量，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣80 μL，照“2.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行含量測定，計(jì)算3種生物堿的平均回收率及RSD，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果( n = 6)

2.9 樣品含量測定

各產(chǎn)區(qū)附子及附片按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行2份，照“2.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算3種水溶性生物堿的含量，結(jié)果見表4～8。四個(gè)產(chǎn)區(qū)附子及附片中3種生物堿的均值分布見圖3。從3種生物堿的總體分布趨勢來看(圖3A)，江油與陜西產(chǎn)區(qū)分布類似，而布拖則與云南產(chǎn)區(qū)相似。表4～7顯示四個(gè)產(chǎn)區(qū)附子中3種生物堿的分布明顯不同，其中附子靈、尼奧靈的含量差異較大，含量分別在230.2～2 407.2 μg/g，0～1 834.5 μg/g之間，尼奧靈在江油產(chǎn)區(qū)中含量最高，均值為1 352.6 μg/g，約為云南、布拖產(chǎn)區(qū)均值的3.5倍，明顯高于其他產(chǎn)區(qū)；而附子靈在云南產(chǎn)區(qū)中含量最高，均值為1 317.0 μg/g，約為江油、陜西產(chǎn)區(qū)均值的3.0倍。由此可見，尼奧靈可能為區(qū)分江油附子與其他非道地產(chǎn)區(qū)附子的特征性差異成分，其含量均大于880 μg/g。

生附片和炒附片中尼奧靈含量均大于1 500 μg/g，與江油泥附子中尼奧靈的含量相當(dāng)，而蒸附片中尼奧靈含量約為生附片的一半，可能是由于附片蒸制過程中，尼奧靈隨水蒸汽冷凝而丟失。上述結(jié)果證明，江油附子炮制加工成附片，尼奧靈也是3種水溶性生物堿中含量最高的成分，其整體概貌與江油附子相似(圖3B)，且3種附片炮制品內(nèi)部尼奧靈含量差異不大，質(zhì)量穩(wěn)定可控。因此，尼奧靈可作為區(qū)分江油生附片、炒附片、蒸附片與其他非道地產(chǎn)區(qū)附片的質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)。

表4 江油附子中3種生物堿的含量 (μg/g,n=2)

表5 陜西附子中3種生物堿的含量 (μg/g,n=2)

表6 布拖附子中3種生物堿的含量 (μg/g,n=2)

表7 云南附子中3種生物堿的含量 (μg/g,n=2)

表8 9批附片中3種生物堿的含量 (μg/g,n=2)

圖3 四個(gè)產(chǎn)區(qū)附子(A)和江油附片(B)中3種生物堿的均值分布Fig.3 The average content of three alkaloids from four regions (A) and Fupian of Jiangyou (B)

2.10 正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)

為找出區(qū)分江油附子與其他非道地產(chǎn)區(qū)附子的關(guān)鍵成分，將色譜分析數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 11.0 軟件，以色譜峰的保留時(shí)間為變量ID，以樣品編號(江油附子設(shè)為一組，編號為JY，將其他3個(gè)產(chǎn)區(qū)附子設(shè)為一組，編號為QT)為觀察ID，構(gòu)建OPLS-DA模型，OPLS-DA得分圖見圖4A，該模型的R2X=0.575，R2Y=0.902，Q2=0.646，表明該模型預(yù)測能力強(qiáng)。采用CV-ANOVA驗(yàn)證模型的可靠性，P值等于1.064×10-5，表明模型穩(wěn)定可靠。從圖4A可以看出，江油附子與其他產(chǎn)區(qū)附子分布區(qū)域明顯不同。各變量VIP值圖見圖4B，其中，26.686(尼奧靈)，25.324 min的峰對分類具有顯著影響(VIP值大于2.0)，表明尼奧靈為區(qū)分江油附子與其他產(chǎn)區(qū)附子的差異成分，這也印證了含量測定的分析結(jié)果，即江油附子中尼奧靈的含量顯著高于其他產(chǎn)區(qū)附子。

圖4 江油附子與其他產(chǎn)區(qū)附子的OPLS-DA得分圖(A)和VIP值圖(B)Fig.4 OPLS-DA score plot(A) and VIP plot(B) from the Fuzi of Jiangyou and other regions

3 結(jié)論

文獻(xiàn)報(bào)道附子雙酯型生物堿與其道地性相關(guān)[14-16]，但附子加工炮制后，雙酯型生物堿轉(zhuǎn)化為單酯型生物堿和原堿，使得不同產(chǎn)區(qū)附子中特征性差異成分雙酯型生物堿發(fā)生轉(zhuǎn)化，且附片成品中雙酯型生物堿含量很低。而水溶性生物堿尼奧靈、附子靈、宋果靈為附子的固有成分，不會(huì)因加工炮制由酯型生物堿轉(zhuǎn)化而來[17]，故本文考察附子水溶性生物堿與其道地性的相關(guān)性。

四個(gè)產(chǎn)區(qū)附子生長環(huán)境差異較大，江油海拔較低，氣候濕潤，降雨量充足，該地區(qū)附子中尼奧靈含量顯著高于其他產(chǎn)區(qū)(> 880 μg/g)，均值約為云南、布拖產(chǎn)區(qū)的3.5倍，而云南與布拖產(chǎn)區(qū)海拔較高，晝夜溫差大，光照充足，該地區(qū)附子中附子靈含量明顯高于其他產(chǎn)區(qū)，均值約為陜西、江油產(chǎn)區(qū)的3倍，提示生態(tài)環(huán)境與生物堿的累積密切相關(guān)。江油附子栽培技術(shù)規(guī)范，精細(xì)化種植需修根、打尖、摘芽，附子個(gè)頭較大，而陜西、云南附子種植方式粗獷，附子個(gè)頭較小。布拖附子分布區(qū)域廣，部分附子栽培較為規(guī)范，與江油附子種植方法相似，該部分附子個(gè)頭、外觀與江油附子相當(dāng)，但尼奧靈含量(<700 μg/g)明顯低于江油附子，顯著不同。故推測尼奧靈含量的累積可能與江油獨(dú)特的地理環(huán)境密切相關(guān)，影響附子道地性的主要因素可能為地理環(huán)境。此外，陜西產(chǎn)區(qū)3種水溶性生物堿的分布規(guī)律與江油類似，但尼奧靈含量也明顯低于江油附子，約為江油附子的一半，且含量測定與OPLS-DA結(jié)果均證明尼奧靈為江油附子的差異性成分。因此，作者認(rèn)為尼奧靈與附子道地性有相關(guān)性。

本文測定了江油附子炮制加工的蒸附片、炒附片以及生附片中3種水溶性生物堿的含量，結(jié)果同樣證明，附片中尼奧靈含量最高。由此可見，尼奧靈作附片質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分，能夠?qū)崿F(xiàn)將道地附片與非道地附片區(qū)分開來，破解非道地產(chǎn)區(qū)附子加工成附片，混淆江油附片銷售的難題。但是對于傳統(tǒng)炮制工藝加工的黑順片、白附片等，經(jīng)過膽巴水浸泡、漂洗、蒸煮等處理，水溶性生物堿幾乎損失殆盡[17]，本文建立的測定方法還不能檢出其水溶性生物堿的含量，其測定方法有待進(jìn)一步研究。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，尼奧靈具有強(qiáng)心、抗炎鎮(zhèn)痛等藥理活性[8,9,11]。因此，尼奧靈作為附子及附片質(zhì)量控制的一個(gè)評價(jià)指標(biāo)能夠彰顯和弘揚(yáng)江油附子的品牌、品質(zhì)的優(yōu)勢特色，為建立科學(xué)合理的附子道地性品質(zhì)評價(jià)方法和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。