地黃配方顆粒HPLC特征圖譜研究及其毛蕊花糖苷含量測定

鐘建榮 方小聰 馮旭俊 楊善巖 陳穩(wěn)竹 劉麗云

摘要[目的]建立地黃配方顆粒的HPLC特征圖譜，并測定其毛蕊花糖苷的含量。[方法]以流動相乙腈-0.1%冰醋酸水溶液，梯度洗脫，柱溫25 ℃;體積流量1.0 mL/min;檢測波長334 nm;進樣量10 μL。[結果]建立了地黃配方顆粒的HPLC特征圖譜，確定8個特征峰;毛蕊花糖苷在4.89～195.68 μg/mL（R2=0.999 6）與色譜峰面積呈良好的線性關系;其平均加樣回收率為101.57%，RSD為1.29%。[結論]該方法簡單、準確、重復性好，為地黃配方顆粒的工藝研究及質(zhì)量控制提供了參考依據(jù)。

關鍵詞地黃配方顆粒;毛蕊花糖苷;含量測定;HPLC特征圖譜;質(zhì)量控制

中圖分類號R?286文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）18-0187-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.18.051

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on HPLC Specific Chromatogram of Rehmannia Formula Granule and Determination of Acteoside Content

ZHONG Jian-rong1， FANG Xiao-cong2， FENG Xu-jun1 et al

（1. Hangzhou Minsheng Healthcare Co.， Ltd.， Hangzhou， Zhejiang 311100;2. Eye Health （Hangzhou） Pharmaceutical Co.， Ltd.， Hangzhou，Zhejiang 310018）

Abstract[Objective]The research aimed to establish the HPLC specific chromatogram of rehmannia formula granule and to determine acteoside content. [Method]For characteristic chromatograms，chromatographic experiments were performed with the mobile phase of 0.1% acetic acid-acetonitril in gradient elutione and the column temperature was set at 25 ℃. The detection wave length was 334 nm and the flow rate was 1.0 mL/min.[Result]The HPLC specific chromatogram of rehmannia formula granule showed 8 characteristic peaks，and the linear range of acteoside was 4.89-195.68 μg/mL（R2=0.999 6）， with average recovery at 101.57% （RSD=1.29%）. [Conclusion]This method is simple， accurate and good reproducibility， and can provide a reference for the technical study and quality control of rehmannia formula granule.

Key wordsRehmannia formula granule;Acteoside;Content determination;HPLC specific chromatogram;Quality control

地黃為玄參科植物地黃（Rehmannia glutinasa Lbosch.）的新鮮或干燥塊根，收載于《中國藥典》（2015年版）一部，具有清熱涼血、養(yǎng)陰生津等作用[1]。地黃為常用中藥材，道地產(chǎn)區(qū)為河南省的武陟、溫縣和孟縣等，后引種到山西省南部的臨紛、侯馬等地[2]。該研究是在中醫(yī)藥理論的指導下，依據(jù)《中藥配方顆粒管理暫行規(guī)定》和《中藥飲片質(zhì)量標準通則（試行）》的要求，根據(jù)現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)地黃中主要有效成分具有一定的水溶性[3-5]，故采取水煎對地黃中有效成分進行提取后，按一定的工藝制成地黃配方顆粒[6-7]。地黃中主要含有環(huán)烯醚萜類、紫羅蘭酮類、苯乙醇苷類、糖類等化合物[8-11]，由于環(huán)烯醚萜類化合物存在不穩(wěn)定性[12-13]，為此該研究建立以毛蕊花糖苷為代表化合物的苯乙醇類化合物的特征圖譜，，并測定其毛蕊花糖苷的含量，為地黃配方顆粒質(zhì)量標準的制定提供理論依據(jù)，以保證配方顆粒工藝的穩(wěn)?定性。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象。干燥地黃樣品于2015—2016年分別在河南、山西、陜西采集，經(jīng)鑒定為玄參科植物地黃（Rehmannia glutinasa Lbosch.）的干燥塊莖，按《中國藥典》中的炮制規(guī)范將藥材炮制成飲片。

1.1.2

主要儀器。高效液相色譜儀Agilent 1200，紫外檢測器。色譜柱：Welch Xtimate C?18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;Diamonsil C?18（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

1.1.3主要試劑。毛蕊花糖苷對照品，批號111530—201310，中國食品藥品檢定研究院;甲醇、乙腈、乙酸均為色譜純;超純水自制。

1.2方法

1.2.1

色譜條件。以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（柱長為25 cm，內(nèi)徑為4.6 mm，粒徑為5 μm，Welch Xtimate C?18柱）;以乙腈為流動相A，以0.1%乙酸溶液為流動相B，梯度洗脫程序：0～32 min，15%～18% A;32～50 min，19% A;柱溫為25 ℃;流速為1.0 mL/min;檢測波長334 nm。

1.2.2

配方顆粒的制備。參照《中藥配方顆粒管理暫行規(guī)定》，制備15批地黃配方顆粒，即取一定量的地黃飲片，浸泡30 min，煎煮2次，每次1.5 h，濾過，濾液減壓濃縮至相對密度為1.20（55 ℃），減壓干燥，粉碎，加糊精適量，制粒，即得地黃配方顆粒。其中，小試地黃飲片用量為1 kg/批，制成量?0.264 kg（得率26.40%）;中試地黃飲片用量為20 kg/批，制成量5.336 kg（得率26.63%）;大生產(chǎn)地黃飲片用量為?200 kg/批，制成量53.428 kg（得率26.71%）。

1.2.3供試品和參照物溶液的制備。

1.2.3.1

對照品溶液的制備。精密稱取，毛蕊花糖苷?10.86 mg，用流動相溶解并定容至100 mL容量瓶中，混勻，即得母液，從母液中移取1 mL溶液于10 mL容量瓶中，流動相定容至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

1.2.3.2

供試品溶液的制備。取本品，研細，取約10.0 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，置具塞試管中，精密加入甲醇?250 mL，稱定重量，加熱回流1.5 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失重量，搖勻，濾過，精密量取濾液50 mL濃縮至近干，殘渣用流動相溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，并用流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液20 mL，減壓回收溶劑至近干，殘渣用流動相溶解，并轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

1.2.3.3

空白對照溶液的制備。依照配方顆粒有關標準，由相關輔料制得地黃配方顆粒的空白對照品，按照“?1.2.3.2”方法制得空白對照溶液。

1.2.4毛蕊花糖苷含量測定的方法學考察。

1.2.4.1

線性關系考察。精密稱取毛蕊花糖苷對照品?24.45 mg，用流動相定容于50 mL容量瓶中，搖勻，得到濃度為?0.489 mg/mL的對照品母液。分別精密吸取0.5、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0 mL母液，置50 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，各精密進樣10 μL，測定峰面積，以毛蕊花糖苷峰面積（Y）為縱坐標、對照品濃度（X）為橫坐標繪制標準曲線，建立線性回歸方程。

1.2.4.2精密度試驗。精密吸取毛蕊花糖苷對照品溶液?10 μL，連續(xù)進樣5次，按“1.2.1”色譜條件測定峰面積，并計算RSD。

1.2.4.3穩(wěn)定性試驗。按照“1.2.3.2”方法制備供試品溶液，分別于制備后0、4、8、12、24、36 h注入液相色譜儀，記錄毛蕊花糖苷峰面積，計算峰面積的RSD。

1.2.4.4重復性試驗。按照“1.2.3.2”方法制備6份供試品溶液，進樣分析，計算峰面積的RSD。

1.2.4.5

回收率試驗。取已知含量的同一批樣品6份，每份取約1.0 g，精密稱定，按照“1.2.3.2”方法制備供試品溶液，精密加入毛蕊花糖苷對照品溶液，進樣測定，計算回收率?及RSD。

1.2.4.6樣品的測定。取不同批次的地黃配方顆粒樣品，按照?“1.2.3.2”方法制備供試品溶液，按照“1.2.1”的色譜條件進行測定，記錄峰面積。

1.2.5地黃配方顆粒特征圖譜的方法學考察。

1.2.5.1精密度試驗。按照“1.2.3.2”方法制備供試品溶液，精密吸取同一供試品溶液10 μL，連續(xù)進樣5次，按照“?1.2.1”的色譜條件進行測定，記錄相對峰面積，并計算RSD。

1.2.5.2穩(wěn)定性試驗。按照“1.2.3.2”方法制備供試品溶液，精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別在0、2、4、6、8、12、24、36 h進樣，按照“1.2.1”的色譜條件進行測定，記錄相對峰面積，并計算RSD。

1.2.5.3

重復性試驗。試驗精密稱取同一樣品6份，按照?“1.2.3.2”方法制備供試品溶液，按照“1.2.1”的色譜條件進行測定，記錄相對峰面積，并計算RSD。

1.2.5.4

HPLC地黃配方顆粒特征峰及相對保留時間的確定。將15批地黃配方顆粒樣品分別按照“1.2.3.2”方法制備供試品溶液，進而按照“1.2.1”的色譜條件進樣檢測，確定毛蕊花糖苷特征峰，并選定峰面積相對較大、重復性好的作為參照峰（S），依據(jù)《中國藥典》2015年版關于中藥特征圖譜的規(guī)定，計算各特征峰與S峰的相對保留時間。

1.2.5.5

不同批次地黃配方顆粒HPLC特征圖譜的比較。分別按照“1.2.3.2”方法制備供試品溶液，進而按照“1.2.1”的色譜條件進樣檢測，比較不同批次地黃配方顆粒HPLC特征圖譜中峰數(shù)目及相對峰面積，并計算其RSD。

2結果與分析

2.1毛蕊花糖苷含量測定的方法學考察

2.1.1線性關系考察。按照“1.2.4.1”方法操作，測得峰面積分別為1.938 7、2.025 3、2.718 5、5.357 0、4.451 5、?5.318 0，以毛蕊花糖苷峰面積（Y）為縱坐標、對照品濃度（X）為橫坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程Y=17.72X+?1.852（R2=?0.999 6），表明毛蕊花糖苷在4.89～?195.68 μg/mL呈現(xiàn)良好的線性關系。

2.1.2精密度試驗。按照“1.2.4.2”方法操作，測得峰面積分別為3.127 8、?3.127 7、3.127 9、3.127 7、3.127 8，計算得峰面積的RSD為0.002 8%，表明精密度良好。

2.1.3穩(wěn)定性試驗。按照“1.2.4.3”方法操作，測得毛蕊花糖苷峰面積分別為3.127 7、3.127 8、3.127 9、3.127 2、?3.127 3、?3.127 5，峰面積的RSD為0.009 %，表明供試品溶液在?36 h內(nèi)?穩(wěn)定。

2.1.4重復性試驗。按照“1.2.4.4”方法操作，測得毛蕊花糖苷的峰面積分別為3.127 3、3.127 1、3.127 7、3.127 2、?3.128 0、3.127 2，其RSD為0.011 3%，表明該方法重復性?良好。

2.1.5回收率試驗。從表1可以看出，回收率平均值為?101.57%，RSD為1.29%，可見回收率、RSD均符合要求，說明該方法準確度良好。

2.1.6樣品的測定。從表2可以看出，相同批次地黃飲片制備的配方顆粒的毛蕊花糖苷含量測定結果相近，表明配方顆粒的制備工藝相對穩(wěn)定。

2.2地黃配方顆粒特征圖譜的方法學考察

2.2.1精密度試驗。按照“1.2.5.1”方法操作，測得色譜峰面積分別為3.127 1、3.126 9、3.127 2、3.127 3、3.127 6，相對峰面積的RSD為0.008 3%，說明儀器精密度?良好。

2.2.2穩(wěn)定性試驗。按照“1.2.5.2”方法操作，測得色譜峰面積分別為3.127 4、3.126 8、3.127 4、3.127 6、3.127 0、3.127 3、?3.126 8、3.127 9，相對峰面積的RSD為0.012 4%，符合特征圖譜要求，表明供試品溶液在36 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.2.3重復性試驗。按照“1.2.5.3”方法操作，測得色譜峰面積分別為3.127 7、3.127 8、3.127 4、3.127 6、3.127 0、?3.127 9，相對峰面積的RSD為0.010 4%，表明該方法重復性良好。

2.2.4HPLC地黃配方顆粒特征峰及相對保留時間的確定。由圖1可知，15批地黃配方顆HPLC特征圖譜有8個特征峰，其中5號峰為毛蕊花糖苷，峰面積相對較大，重復性好，作為參照峰（S）。從表3可以看出，各共有峰的相對保留時間的平均值分別為0.362（峰1）、0.587（峰2）、0.727（峰3）、?0.840（峰4）、1.077（峰6）、1.251（峰7）、3.658（峰8）。

2.2.5

不同批次地黃配方顆粒HPLC特征圖譜的比較。從表3、4和圖1可以看出，不同批次地黃配方顆粒HPLC特征圖譜的特征峰數(shù)目及相對峰面積有一定差異，其共有峰平均相對峰面積分別為0.427（峰1）、0.273（峰2）、0.148（峰3）、?0.165（峰4）、0.135（峰6）、0.294（峰7）、0.632（峰8），各峰RSD值分別為23.31%、18.81%、20.76%、31.92%、24.40%、?29.56%、23.67%。

3結論與討論

此次研究在含量測定的色譜條件的基礎上進行特征圖譜的色譜條件優(yōu)化，同時比較不同廠家不同型號色譜柱下各峰的分離情況，發(fā)現(xiàn)Welch Xtimate C?18色譜柱各峰的分離效果良好，優(yōu)于其他色譜柱，故需要規(guī)定色譜柱。另考察不同柱溫下（20、25、30、35 ℃）色譜峰分離情況，發(fā)現(xiàn)25 ℃時各峰的分離效果良好，故確定柱溫為25 ℃。對15批地黃配方顆粒的特征圖譜進行比較分析，發(fā)現(xiàn)來源于不同產(chǎn)地顆粒的色譜峰整體形貌特征具有一定的相似性，個別色譜峰存在差

異，同時綜合分析各批次地黃配方顆粒的HPLC特征圖譜，共確定8個共有峰，其中將5號峰（毛蕊花糖苷色譜峰）作為參照峰。比較各峰相對保留時間和相對峰面積發(fā)現(xiàn)，其相對保留時間較為穩(wěn)定，而不同批次顆粒的相對峰面積的RSD較大，具有一定的批間差異，推測其原因可能由于藥材本身具有一定的差異。取地黃飲片粉末按照“1.2.3.2”方法制備供試品溶液，以“1.2.1”色譜條件進樣檢測，得到特征圖譜，與相應顆粒的特征圖譜進行比較，發(fā)現(xiàn)飲片與顆粒之間具有一定的物質(zhì)傳遞關系，二者整體形貌特征基本一致。該試驗建立了地黃配方顆粒的含量測定方法，并建立了地黃配方顆粒特征圖譜，確定15批配方顆粒的8個共有特征峰，可從全面控制配方顆粒的質(zhì)量，為其工藝研究及質(zhì)量標準的建立提供了參考依據(jù)。

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