具有降解對硝基酚功能的硝化菌

張辰媛 俞汐音 陳詩源 張永明

摘 要： 硝化細菌是城市污水處理廠水處理系統(tǒng)中的重要功能菌.該硝化菌能否抵御有毒污染物的沖擊，是衡量污水處理系統(tǒng)能否穩(wěn)定運行的指標之一.用對硝基酚（PNP）對普通的硝化菌進行馴化，得到一種具有降解PNP功能的硝化菌.結果表明：經(jīng)過馴化后的硝化細菌同時具有降解硝基酚和硝化功能.在含有質(zhì)量濃度為100 mg·L-1 PNP的溶液中，與普通硝化菌相比，經(jīng)過馴化后的硝化菌對NH4+-N去除速率高出33%.此外，馴化后的硝化菌對PNP的去除速率是普通硝化菌的33倍.

關鍵詞： 對硝基酚（PNP）; 硝化菌; 生物降解; 硝化反應

中圖分類號： TQ 174.75? 文獻標志碼： A? 文章編號： 10005137（2019）04040606

Abstract： Nitrifier is an important function bacteria in municipal wastewater treatment plant.It is one of the indexes to evaluate whether or not the wastewater treatment system including the nitrifier could operate stably with shock of toxic pollutants.Common nitrifying bacteria were acclimated with pnitrophenol （PNP） to obtain special nitrifying bacteria with function for biodegradation of PNP.Experimental results showed that the nitrifying bacteria had function for simultaneous ammonium N removal and PNP biodegradation.In the solution containing 100 mg·L-1 PNP，the acclimated nitrifying bacteria had a 33% higher removal rate of NH4+N than the common nitrifying bacteria.In addition，PNP removal rate with the acclimated bacteria was as 33 times as that with common bacteria.

Key words： pnitrophenol （PNP）; nitrifying bacteria; biodegradation; nitrification

0 前 言

隨著環(huán)境保護意識的日益加強，各種污水都需經(jīng)過適當處理后才能夠排放到自然環(huán)境中.其中生活污水的處理占有重要的份額.據(jù)統(tǒng)計，全國每年產(chǎn)生的生活污水近500億噸[1].對生活污水的處理，幾乎都是采用生物方法進行的.在生活污水處理中，硝化反應是重要的一個環(huán)節(jié)[2-4].因為硝化細菌的培養(yǎng)或馴化周期較長[5-7]，一旦硝化菌的生物活性受到影響，會導致污水處理廠的出水達不到排放標準[8-9].嚴重時，會導致整個污水處理廠的生物系統(tǒng)崩潰.此外，全國許多城鎮(zhèn)污水處理廠在處理生活污水的同時，往往會接納部分工業(yè)廢水進行混合處理.通常各個工廠在接入生活污水管網(wǎng)之前都需要進行一定程度的預處理，避免城鎮(zhèn)生活污水處理廠的活性污泥體系受到一定程度的沖擊而導致處理效率下降甚至造成污染事故.但是在現(xiàn)實中，因為一些工業(yè)廢水的預處理工藝不夠合理或突發(fā)事故等種種原因，一些帶有生物毒性的工業(yè)廢水會突然進入到生活污水體系.如何保證污水處理廠的微生物體系在遇到突如其來的含有生物毒性的工業(yè)廢水時，仍能正常進行生物反應，是各城鎮(zhèn)污水處理廠需要考慮的問題.其中很重要的一個方面是保證污水處理廠的硝化細菌在此情況下仍具有生物活性.

在各種工業(yè)廢水中，對硝基酚（PNP）是一種典型的、具有生物毒性的化學物質(zhì)[10-12].PNP在工業(yè)領域被廣泛地用作農(nóng)藥、醫(yī)藥、染料等精細化學品的中間體[13-15]，用于制造非那西丁、撲熱息痛、農(nóng)藥1605、顯影劑米妥爾、硫化草綠GN、硫化還原黑CL、硫化還原黑CLB、硫化還原藍RNX、硫化紅棕B3R，也用作皮革防霉劑以及酸值指示劑[16-18].在使用過程中，PNP往往會存在于這些行業(yè)的廢水中，并進入城鎮(zhèn)污水處理廠，從而有可能對污水處理廠的生物系統(tǒng)造成一定的毒害或沖擊[19-20].在本研究中，以PNP為對象，培養(yǎng)馴化出一種能耐受PNP毒性的硝化細菌，并與常規(guī)的硝化細菌進行比較，探討硝化細菌在遇到PNP時的特性，為提高城鎮(zhèn)污水處理廠的生物系統(tǒng)抵御有毒污染物的能力提供理論和實踐依據(jù).

1 材料與方法

1.1 化學試劑以及PNP和氯化銨溶液的制備

購置于上海探索平臺的PNP、氯化銨（NH4Cl）、磷酸二氫鉀（K2HPO3）、葡萄糖、碳酸氫鈉（NaHCO3）和一些微量元素均為分析純.培養(yǎng)基制備時，將10 g PNP和7.7 g NH4Cl分別溶解于1000 mL去離子水（18 MW，Millipore MilliQ凈水器，美國）中，得到10 g·L-1 PNP和含N量為2000 mg·L-1的NH4+N儲備溶液.通過將40 g NaHCO3溶解于1 L MilliQ去離子水中制備緩沖液，將21.75 g K2HPO3和4.26 g KH2PO3溶于1 L相同的水中，得到含碘營養(yǎng)液.

實驗時，將儲備溶液用自來水稀釋，以獲得所需要的初始PNP和NH4+N質(zhì)量濃度.每1 L實驗配水加入3 mL緩沖溶液、3 mL磷溶液和100 mg葡萄糖.

1.2 污泥馴化

污泥取自上海長橋水質(zhì)凈化廠.對所取污泥分為兩個階段進行馴化.第一階段，各取300 mL污泥置于2個1 L量筒中，加入20 mL的NH4+N儲備溶液，再定容至1000 mL，得到40 mg·L-1初始NH4+N溶液，同時加入250 mg葡萄糖作為碳源，加入10 mL的NaHCO3緩沖溶液和3 mL的磷營養(yǎng)溶液.每日曝氣23.5 h，再沉降0.5 h，倒出上清液.每天以同樣方法更換相同體積的新鮮培養(yǎng)基，在30 ℃條件下馴化4周，得到含有常規(guī)硝化菌的活性污泥.

在第二階段馴化時，將部分經(jīng)第一階段馴化后的污泥置于1 L體積的量筒中，并加入PNP，使其質(zhì)量濃度逐漸增加至100 mg·L-1，經(jīng)過2～3周的馴化得到具有降解PNP功能的硝化污泥.而另一部分含有常規(guī)硝化菌的活性污泥作為對比，仍維持第一階段的馴化方法不變.

1.3 硝化與PNP生物降解實驗

實驗分為兩組，使用2個250 mL的錐形瓶置于120 r·min-1，30 ℃的搖床中.其中，一個搖瓶加入普通硝化污泥，另一個搖瓶加入PNP馴化的硝化污泥，即2個搖瓶分別含有普通硝化菌和經(jīng)PNP馴化的硝化菌（以下簡稱馴化硝化菌）.第一組實驗，在2個搖瓶中加入等量NH4+N儲備溶液，得到50 mg·L-1的初始NH4+N溶液，同時加入等量緩沖液、磷營養(yǎng)溶液，定容至150 mL，以比較普通硝化菌和馴化硝化菌單獨進行硝化反應的反應速率.第二組實驗在第一組的基礎上，向2個搖瓶中增加PNP儲備液，使得加入的PNP質(zhì)量濃度為100 mg·L-1，其余物料完全一致，對比突然加入PNP時上述2種硝化菌硝化反應的受影響程度以及PNP的降解速率.每一組實驗均加入質(zhì)量濃度為100 mg·L-1的葡萄糖.對于所有實驗，以1 h為間隔取樣以測量PNP，NH4+N和NO3-N的質(zhì)量濃度.

1.4 分析方法

使用Ultimate 3000高效液相色譜儀測定PNP質(zhì)量濃度，檢測限為0.05 mg·L-1.流動相為甲醇/水溶液（V（甲醇）? ∶ V（水溶液）=70? ∶ 30），流速為1 mL·min-1，檢測波長254 nm，色譜柱為ZORBAX SBC18（5 μm，4.6 mm×250 mm，Agilent），柱溫為30 ℃.使用Autochem 1200全自動間斷分析儀測定NH4+N和NO3-N質(zhì)量濃度.每個液體樣品在測量前通過0.22 μm孔徑的膜過濾器（型號：MCE13mm，中國）過濾.

2 結果與討論

2.1 未加PNP時普通硝化菌與馴化硝化菌的比較

圖1所示是普通硝化菌和馴化硝化菌在未加PNP時硝化速率的比較（R為相關系數(shù)）.從圖1中可以看出，未加PNP時，2種硝化菌對NH4+N的去除速率和NO3-N生成速率幾乎一樣.由此可以看出，經(jīng)過PNP的馴化之后，微生物的硝化功能幾乎沒有變化.比較NH4+N的去除速率和NO3-N的生成速率可以發(fā)現(xiàn)，NH4+N的去除速率比NO3-N的生成速率略微快一些.這是因為在每一組實驗中，還加入了質(zhì)量濃度為100 mg·L-1的葡萄糖，導致部分NH4+N通過異養(yǎng)同化的方式去除，總的NH4+N去除速率（k）包括硝化速率（kN）和異養(yǎng)合成速率（kH），即：k=kN+kH.在沒有加入PNP時，kN占k的75%左右.

2.2 添加PNP時普通硝化菌與馴化的硝化菌的比較

圖2是將100 mg·L-1的PNP分別加入到50 mg·L-1（干重）的普通和馴化硝化細菌中時，硝化速率與PNP降解速率的比較.由圖2可以看出，當加入100 mg·L-1 PNP時，馴化硝化菌比普通硝化菌對NH4+N去除速率快33%.相比未加入PNP時，普通硝化菌對NH4+N去除速率則下降了88%，而馴化硝化細菌只下降41%.從圖2中還可以看出，馴化硝化菌在降解PNP時，馴化硝化菌對PNP的降解速率是普通硝化菌的32倍.同時，馴化硝化菌的NO3-N生成速率幾乎是普通硝化菌的2倍.在好氧條件下，PNP的生物降解途徑主要是通過單加氧反應得以降解[21].結果表明，經(jīng)過PNP馴化的硝化菌或微生物菌群既有硝化功能，又存在單加氧酶，因此，在突然接觸到PNP時，仍能保持較好的硝化速率，同時還具有對PNP的降解性能.

3 結 論

經(jīng)過PNP馴化過的硝化菌在突然接觸到PNP時，相比普通硝化菌仍能保持較高的硝化速率，同時還具有較好降解PNP的性能.該研究結果對于提高耐受有毒污染物沖擊的污水處理生物系統(tǒng)具有一定理論和實際意義.

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（責任編輯：郁 慧）