染料木素對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力的影響

康曉軍，李燕

(鞏義市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 鞏義451200)

大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是一種具有多項(xiàng)分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞[1]，在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用前景[2-5]。研究表明，BMSCs可能有助于脊髓修復(fù)[6]，同時在治療多種罕見病中可能具有一定意義。例如，研究證實(shí)BMSCs能夠改善心肌缺血損傷后修復(fù)，這可能通過分泌調(diào)節(jié)因子產(chǎn)生效應(yīng)[7,8]，通過某些化合物，比如透明質(zhì)酸作用后，這種保護(hù)效應(yīng)可能更明顯[9]。近年來越來越多的研究聚焦在中藥以及中藥中天然單體化合物在BMSCs中的調(diào)控效應(yīng)上。淫羊藿素作用于BMSCs后，細(xì)胞增殖加快，這為細(xì)胞的擴(kuò)增與大量獲取提供了新穎的途徑[10]，這可能與EGF產(chǎn)生相似的效應(yīng)[11]。在定向分化方面，也有研究者證實(shí)中藥具有積極效應(yīng)[12,13]。

染料木素是來源于大豆中的天然黃酮化合物，在先前的研究中，具有包括抗炎，抗氧化，抗腫瘤和調(diào)節(jié)血脂等生物學(xué)活性[14,15]。但是沒有研究報(bào)道其在干細(xì)胞增殖過程中具有調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)只在探索染料木素對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增值能力的影響并初步證實(shí)其作用機(jī)制，為染料木素進(jìn)一步應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動物：SD大鼠2只，鼠齡3～4周，

購于重慶第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心(動物許可證號 SCXK(渝)2012-0005)。 主要試劑：FBS、DMEM低糖型培養(yǎng)基購于Hyclone公司。兔抗大鼠CD29-FITC(MA182001)、CD 45-FITC(MA182348)、CD 90-FITC(MA182247)抗體購于美國BD公司。成骨(RASMX-90021)、成脂(MKCMA-90031)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒購于賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司。CCK-8試劑盒購于日本同仁公司(RK-067)。兔抗人 β-actin(QC-074)、Bcl-2(QC-134)和 Bax(QC-027)一抗和偶聯(lián)辣根過氧化物酶羊抗兔二抗(QC-1679)購于美國CST公司。染料木素(ST-215439)購于美國西格瑪公司。所有的引物由上海生工合成。凋亡檢測試劑盒(S0185)購自碧云天試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提取與培養(yǎng) 頸椎脫臼法處死大鼠后于無菌條件下分離四肢長骨并去除殘留組織。用注射器吸取DMEM低糖型培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，隨后離心搜集細(xì)胞。重懸后接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%的CO2以及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每3d換液一次，當(dāng)貼壁細(xì)胞融合度為80%～90%時傳代培養(yǎng)。使用第3代(P3)細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)鑒定BMSCs表型 P3大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞融合度為90%時，消化重懸細(xì)胞，洗滌后分別加入 CD 29-FITC、CD45-FITC、CD90-FITC抗體各 2 μL，37℃避光孵育 30 min， 預(yù)冷的PBS洗滌2遍，用0.5 mL濃度為1%的多聚甲醛重懸固定30 min，流式細(xì)胞儀(美國，貝克曼，F(xiàn)C500)檢測熒光強(qiáng)度。

1.2.3 成骨成脂分化鑒定 P3大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞按照每孔2×105個細(xì)胞接種至6孔板中，培養(yǎng)融合度至60%～70%，加入成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基2ml。隨后按照試劑盒說明書進(jìn)行誘導(dǎo)分化。成脂誘導(dǎo)分化時6孔板中要求細(xì)胞融合度為100%或者過融合，按照試劑盒說明書進(jìn)行誘導(dǎo)和染色，于顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 通過CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 P3大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞按照每孔2×103個細(xì)胞接種至96孔板中，適應(yīng)培養(yǎng)過夜后，使用20μg/ml的染料木素處理細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)7d，每天同一時間加入培養(yǎng)基10%體積的CCK-8試劑，孵育2h后在酶標(biāo)儀450nm波長處檢測吸光度值。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 P3大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以每孔1×106個細(xì)胞密度接種于6孔板中，貼壁生長24h后，使用20 μg/ml的染料木素處理細(xì)胞48h，同時搜集上清中的細(xì)胞和貼壁細(xì)胞重懸后，按照AV/PI凋亡檢測試劑盒說明書孵育抗體，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡檢測。

1.2.6 實(shí)時熒光定量PCR P3大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞消化重懸后以5×105個/孔的密度接種于6孔板中，適應(yīng)生長過夜后，加入終濃度為20 μg/ml的染料木素處理細(xì)胞48h，以未加染料木素的細(xì)胞作為陰性對照，按照total RNA提取試劑盒說明書操作，提取細(xì)胞total RNA。吸光度法檢測RNA濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，構(gòu)建cDNA。加入相應(yīng)試劑和熒光染料SYRB后，執(zhí)行熒光定量PCR儀器進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性 15 s；95℃變性 5 s；65℃退火 30 s；40 個循環(huán)。最后結(jié)果以2-△△ct進(jìn)行計(jì)算。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。引物序列如下所示：

1.2.7 蛋白印記法檢測相關(guān)蛋白表達(dá)水平 P3大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞消化重懸后以5×105個/孔的密度接種于6孔板中，適應(yīng)生長過夜后，加入終濃度為20 μg/ml的染料木素處理細(xì)胞48h，以未加染料木素的細(xì)胞作為陰性對照，加入相應(yīng)體積的R細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白。通過BCA法檢測蛋白濃度并變形蛋白。配制SDS-PAGE凝膠后，對變性蛋白溶液進(jìn)行凝膠分離，轉(zhuǎn)移進(jìn)入PVDF膜上，使用5%的BSA常溫封閉2 h，切膜后分別加入已經(jīng)稀釋完畢的兔抗人β-actin、Bcl-2和Bax一抗，4℃孵育過夜。TBST清洗后加入已經(jīng)稀釋完畢的HRP偶聯(lián)羊抗兔二抗，室溫孵育2 h。清洗后使用專用的ECL進(jìn)行曝光。最終結(jié)果以β-actin作為內(nèi)參，統(tǒng)計(jì)各組蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)方法 所有的結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組間差異比較使用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠BMSCs的鑒定 提取原代細(xì)胞后，經(jīng)過為期兩周的純化和培養(yǎng)，BMSCs逐漸成簇生長，見圖1A。通過成骨成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的定向誘導(dǎo)后，提取的細(xì)胞具有多項(xiàng)分化的能力，見圖1B、1C。流式細(xì)胞儀鑒定提取細(xì)胞表型，CD45陰性表達(dá)，CD29和CD90陽性表達(dá)，見圖1D。上述結(jié)果表明提取的細(xì)胞為大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

圖1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定

2.2 染料木素對BMSCs增殖能力的影響 細(xì)胞培養(yǎng)至P3后，以一定密度接種至96孔板中，使用不同濃度的染料木素處理細(xì)胞后，觀察BMSCs生長情況。結(jié)果表明染料木素顯著抑制BMSCs生長的其實(shí)濃度為20 μg/ml(P＜0.05)。在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取20 μg/ml的染料木素作為后續(xù)作用濃度，檢測其增殖曲線。結(jié)果表明染料木素顯著抑制BMSCs的生長，P＜0.05。 見圖 2。

圖2 染料木素抑制BMSCs的增殖，*P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 染料木素對BMSCs凋亡的影響 細(xì)胞培養(yǎng)至P3后，以一定密度接種至6孔板中，使用染料木素處理細(xì)胞后，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果表明染料木素誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡,P＜0.05。見圖3。2.4染料木素對BMSCs凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響細(xì)胞培養(yǎng)至P3后，以一定密度接種至6孔板中，使用染料木素處理細(xì)胞后，提取細(xì)胞總蛋白和總RNA并檢測凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明，不論是在轉(zhuǎn)錄水平還是翻譯水平，染料木素都顯著上調(diào)BMSCs細(xì)胞Bax的表達(dá)水平，同時下調(diào)Bcl-2的表達(dá)水平，P＜0.05。 見圖4。

圖3 染料木素誘導(dǎo)BMSCs發(fā)生凋亡，*P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 染料木素調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，*P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)論

近年來，干細(xì)胞在多種疾病中的有益作用逐漸被發(fā)現(xiàn)[16]。隨著提取技術(shù)不斷完善[17,18]以及低免疫原等特性的發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)中受到重視。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種來源于骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞，增殖能力較強(qiáng)，免疫原性較低，在細(xì)胞移植過程中具有較好的耐受性。但是目前關(guān)于干細(xì)胞定向分化為特定類型細(xì)胞的研究進(jìn)展并不順利，一方面，是分化效率較低，另一方面，是因?yàn)榉只墒於容^差，分化完成的細(xì)胞移植后與機(jī)體并未在功能上形成一個有機(jī)的整體[19]。干細(xì)胞的增殖與分化處于動態(tài)平衡，因此抑制干細(xì)胞的增殖能力，可能有助于其分化[20]。染料木素已經(jīng)報(bào)道能夠抑制多種細(xì)胞的增殖，因此本研究旨在探索其在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的作用。

結(jié)果證實(shí)染料木素能夠抑制大鼠BMSCs的增殖。當(dāng)使用染料木素處理細(xì)胞后，細(xì)胞倍增時間顯著升高。在機(jī)制研究中，通過流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)染料木素能夠誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，該效應(yīng)可能是通過上調(diào)Bax基因的表達(dá)同時下調(diào)Bcl-2的表達(dá)所致。Bcl-2和Bax是內(nèi)源性線粒體凋亡途徑中的關(guān)鍵分子，二者處于動態(tài)平衡過程中[21,22]。當(dāng)二者的比例發(fā)生變化后，內(nèi)源性凋亡途徑被激活，細(xì)胞啟動凋亡過程[23,24]。我們的結(jié)果與先前的研究相符。

總之，本文證實(shí)染料木素能夠抑制大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，該效應(yīng)與其調(diào)節(jié)了內(nèi)源性線粒體凋亡途徑Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)水平相關(guān)。這可能有助于大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為特定類型的細(xì)胞，值得進(jìn)一步研究。