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    幼年期實(shí)驗(yàn)用食蟹猴血液學(xué)指標(biāo)測定與比較

    2019-11-01 06:23:14何鋼華廖金娥陳結(jié)文黃慶宇吳志恒陳梅麗
    中國比較醫(yī)學(xué)雜志 2019年10期
    關(guān)鍵詞:食蟹血液學(xué)雌性

    何鋼華,廖金娥,陳結(jié)文,黃慶宇,羅 群,吳志恒,陳梅麗,盧 麗*

    (1.廣州春盛生物研究院有限公司,廣州 510900; 2.廣東省實(shí)驗(yàn)動物監(jiān)測所(廣東省實(shí)驗(yàn)動物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室),廣州 510663)

    非人靈長類實(shí)驗(yàn)動物與人類的遺傳物質(zhì)有75%~98.5%的同源性[1],在系統(tǒng)發(fā)育上與人類接近,在生理學(xué)、解剖學(xué)、免疫學(xué)以及神經(jīng)學(xué)方面有許多相似之處[2],是研究人類健康和疾病的理想實(shí)驗(yàn)動物,其生物學(xué)特性對藥理學(xué)、毒理學(xué)及藥物安全性評價等方面的研究具有重要的意義[3]。廣東省非人靈長類實(shí)驗(yàn)動物存量達(dá)80 000只,占全國總存量1/3,以食蟹猴為主,每年出口歐美的標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)猴數(shù)量超過6000只[4],豐富的實(shí)驗(yàn)猴資源,是研究人類相關(guān)疾病及毒理學(xué)研究的良好模型動物[5]。但其在疾病模型的開發(fā)應(yīng)用方面仍然非常有限,自發(fā)性疾病模型的開發(fā)尚為欠缺,資源的附加值還有很大的提升空間。因此,建立廣東省內(nèi)幼年期具體年齡段實(shí)驗(yàn)用食蟹猴的血液學(xué)指標(biāo)參考值不僅對其應(yīng)用提供重要的參考意義,且對食蟹猴日常疾病的診斷及動物模型的開發(fā)意義深遠(yuǎn)。本實(shí)驗(yàn)對幼年期具體年齡段正常食蟹猴的血液學(xué)指標(biāo)測定,并進(jìn)行性別間比較,為其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動物

    1~2周歲(1≤x<2)食蟹猴273只,雌性124只,雄性149只;2~3周歲(2≤x<3)食蟹猴307只,雌性244只,雄性63只;3~4周歲(3≤x<4)食蟹猴273只,雌性124只,雄性149只。所選食蟹猴均為正常未用于實(shí)驗(yàn)的動物。級別:普通級;動物提供單位:廣東春盛生物科技發(fā)展有限公司[SCXK(粵)2014~0027]。飼養(yǎng)條件:于廣東春盛生物科技發(fā)展有限公司內(nèi)群居飼養(yǎng)[SYXK(粵)2015~0152],環(huán)境溫度:18℃~26℃,相對濕度40%~70%,照明:采用12 h/12 h晝夜明暗交替。已經(jīng)通過廣東省實(shí)驗(yàn)動物監(jiān)測所IACUC的審查,編號為:IACUC 2018002。在滿足實(shí)驗(yàn)動物3R原則的基礎(chǔ)上為實(shí)驗(yàn)動物提供充足的動物福利。

    1.2 主要試劑與儀器

    血紅細(xì)胞分析用稀釋液(CELLPACK DFL)、Hb溶血劑(SULFOLYSER)、WNR溶血劑(Lysercell WNR)、WDF溶血劑(Lysercell WDF)、WDF染色液(Fluorocell WDF)、WNR染色液(Fluorocell WNR)、PLT熒光染色液(Fluorocell PLT)(批號分別為:A7010、A7014、A8006、A7019、A7062、A7047、A7094,日本SYSMEX(希森美康)株式會社)。血液分析儀XN-1000 V[B1]型(日本Sysmex株式會社)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 標(biāo)本采集

    動物禁食12 h后,非麻醉狀態(tài)下使用2 mL含乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)真空采血管對實(shí)驗(yàn)動物采用前肢頭靜脈采血2 mL,保存樣本并于1.5 h送檢。

    1.3.2 血液學(xué)指標(biāo)測定

    使用Sysmex XN~1000 V 全自動血液分析儀對動物抗凝血進(jìn)行以下指標(biāo)測定:白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細(xì)胞比積(HCT)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白量(MCH)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)、紅細(xì)胞分布寬度-標(biāo)準(zhǔn)差(RDW-SD)、紅細(xì)胞分布寬度-變異系數(shù)(RDW-CV)、血小板分布寬度(PDW)、平均血小板體積(MPV)、大血小板比率(P-LCR)、血小板比積(PCT)、中性粒細(xì)胞(NEUT#)、淋巴細(xì)胞(LYMPH#)、單核細(xì)胞(MONO#)、嗜酸性粒細(xì)胞(EO#)、嗜堿性粒細(xì)胞(BASO#)、中性粒細(xì)胞百分比(NEUT%)、淋巴細(xì)胞百分比(LYMPH%)、單核細(xì)胞百分比(MONO%)、嗜酸性粒細(xì)胞百分比(EO%)、嗜堿性粒細(xì)胞百分比(BASO%)。

    1.3.3 參考值范圍建立

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 參考值范圍的建立

    2.2 1~2周歲(1≤x<2)食蟹猴血液學(xué)指標(biāo)

    雄性動物與雌性動物相比較,在紅細(xì)胞方面,雌雄動物沒有顯著性差異(P>0.05)。免疫細(xì)胞中LYMPH、BASO、NEUT指標(biāo)差異極顯著(P<0.01),其中雄性動物BASO和LYMPH顯著低于雌性動物,而NEUT則雄性動物顯著高于雌性動物(P<0.05)。血小板方面,PLT及P-LCR在雌雄動物間差異極顯著(P<0.01),PDW及MPV則在雌雄動物間差異顯著(P<0.05),除雄性動物PLT極顯著高于雌性動物外(P<0.01),P-LCR、PDW、MPV均顯著低于雌性動物(P<0.05)。其余指標(biāo)均沒有顯著性差異,詳見表2。

    2.3 2~3周歲(2≤x<3)食蟹猴血液學(xué)指標(biāo)

    2~3周歲雌雄食蟹猴血液學(xué)指標(biāo)相比較,紅細(xì)胞指標(biāo)除RDW-SD雄性動物顯著低于雌性動物外(P<0.05),其余指標(biāo)均沒有顯著性差異(P>0.05)。免疫細(xì)胞除BASO指標(biāo)雄性動物極顯著低于雌性動物外(P<0.01),其余指標(biāo)均無顯著性差異。而血小板方面,雄性動物PDW、MPV及P-LCR極顯著低于雌性動物(P<0.01),其余各指標(biāo)均無顯著性差異,詳見表3。

    表1 幼年期食蟹猴血液學(xué)指標(biāo)參考范圍

    注:1~2周歲(1≤x<2)、2~3周歲(2 ≤x<3)、3~4周歲(3 ≤x<4)食蟹猴數(shù)量分別為273、307、273只。

    Note. The number of cynomolgus monkeys aged 1-2 (1≤x<2), 2-3 (2≤x<3) and 3-4 (3≤x<4) years were 273, 307 and 273, respectively.

    表2 1~2周歲(1≤x<2)食蟹猴血液學(xué)指標(biāo)

    注:雄性動物149只,雌性動物124只;與雄性動物相比,*P<0.05,**P<0.01。

    Note. Number of male monkeys is 149 and female monkeys is 124. Compared with the males,*P<0.05,**P<0.01.

    表3 2~3周歲(2≤x<3)食蟹猴血液學(xué)指標(biāo)

    注:雄性動物63只,雌性動物244只;與雄性動物相比,*P<0.05,**P<0.01。

    Note. Number of male monkey is 63 and female monkey is 244. Compared with male,*P<0.05,**P<0.01.

    表4 3~4周歲(3≤x<4)食蟹猴血液學(xué)指標(biāo)

    注:雄性動物149只,雌性動物124只;與雄性動物相比,*P<0.05,**P<0.01。

    Note. Number of the male monkeys is 149 and female monkeys is 124. Compared with the males,*P<0.05,**P<0.01.

    2.4 3~4周歲(3≤x<4)食蟹猴血液學(xué)指標(biāo)

    雌雄動物相比較,紅細(xì)胞方面,雄性食蟹猴RBC顯著高于雌性,而MCV、RDW-SD則顯著低于雌性食蟹猴(P<0.05),其余各指標(biāo)均無顯著性差異(P>0.05);在免疫細(xì)胞方面,WBC差異顯著(P<0.05),而LYMPH、NEUT和EO差異極顯著(P<0.01),除NEUT雄性動物極顯著低于雌性動物外,雄性動物WBC、LYMPH、EO顯著高于雌性動物(P<0.05),其余各指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血小板方面,雄性動物PLT顯著高于雌性動物,而PDW顯著低于雄性動物(P<0.05),雄性動物MPV、P-LCR則極顯著低于雌性動物(P<0.01),其余各指標(biāo)無顯著性差異,詳見表4。

    2.5 各年齡段血液學(xué)變化趨勢

    免疫細(xì)胞計(jì)數(shù)方面,動物隨年齡的增長,其WBC、BASO呈下降趨勢;雌雄動物L(fēng)YMPH指標(biāo)在1~3周歲緩慢下降,而雄性動物則在3~4周歲呈上升趨勢;雌雄動物NEUT在1~4周歲呈上升趨勢,而雄性動物在1~3周歲上升,在3~4周歲下降,如圖1所示。

    血小板指數(shù)方面,MPV、PDW、P-LCR指標(biāo)雌性動物高于雄性動物且在隨年齡的增長而下降;相反,雄性動物PLT遠(yuǎn)高于雌性動物,且兩者均在1~2周歲緩慢減少而在3~4周歲時增加,如圖2所示。

    紅細(xì)胞方面,雌性動物和雄性動物RBC、HCT、HGB指標(biāo)在其兩歲以下均呈下降趨勢,而在3~4歲時增加且雄性高于雌性;雌性動物MCV、MCH在1~4周歲年齡段高于雄性動物,且均在1~2周歲呈上升趨勢,在3~4周歲呈下降趨勢,見圖3。

    圖1 免疫細(xì)胞計(jì)數(shù)各年齡段變化趨勢Figure 1 Trends of immune cell counts in different age groups

    圖2 血小板計(jì)數(shù)及血小板指數(shù)各年齡段變化趨勢Figure 2 Trends of platelet counts and platelet indexes in different age groups

    圖3 紅細(xì)胞計(jì)數(shù)及紅細(xì)胞指數(shù)各年齡段變化趨勢Figure 3 Trends of erythrocyte counts and erythrocyte indexes in different ages

    3 討論

    藥物的藥效學(xué)研究、非臨床安全性評價研究及臨床前安全性評價研究是新藥研發(fā)的核心內(nèi)容。非人靈長類實(shí)驗(yàn)動物是藥物新陳代謝研究的良好載體,在已研究的化合物中,71%證實(shí)藥物在猴體內(nèi)代謝和人體內(nèi)代謝近似性好[10],關(guān)于食蟹猴的血液學(xué)指標(biāo)數(shù)據(jù)目前已有報(bào)道[11-14],且本研究相關(guān)指標(biāo)與文獻(xiàn)報(bào)道存在差異。除了年齡和性別為主要影響因素外,動物個體年齡跨度較大,血液生理指標(biāo)多受地域來源、環(huán)境、采集及儲存方式、檢測儀器等多方面因素的影響而存在差異[15]。

    廣東春盛生物科技發(fā)展有限公司食蟹猴存欄多達(dá)20 000余頭,10多年來因廣東從化優(yōu)越的氣候環(huán)境和地理?xiàng)l件而穩(wěn)定繁育。根據(jù)獸醫(yī)的日常觀察與經(jīng)驗(yàn),1周歲的食蟹猴大致相當(dāng)于人類的4周歲,本研究隨機(jī)選用該公司幼年期不同年齡段正常實(shí)驗(yàn)用食蟹猴共853只進(jìn)行血液學(xué)指標(biāo)的測定與研究,大量的實(shí)驗(yàn)動物樣本量為其血液學(xué)參考值范圍的建立提供支撐,參考值范圍見表1。

    本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:年齡差異及性別差異可能對食蟹猴血液學(xué)某些指標(biāo)如RBC、HGB、WBC、LYMPH、PLT等存在影響。

    紅細(xì)胞方面,動物在3周歲前,雌性動物其紅細(xì)胞數(shù)量如HGB、HCT、MCV、MCH等普遍高于雄性動物,而在3~4周歲的年齡段,雄性動物紅細(xì)胞如RBC、HGB等明顯升高并高于雌性動物,見圖3。可能為幼年猴機(jī)體為滿足氣體交換,促進(jìn)新陳代謝而表現(xiàn)的正常狀況,而后期雄性動物紅細(xì)胞升高則可能與機(jī)體生長發(fā)育有關(guān),雄性激素分泌水平升高促進(jìn)蛋白合成,從而利于紅細(xì)胞生成;雄性食蟹猴RBC高于雌性,這也可能與雌性食蟹猴的月經(jīng)生理周期相關(guān),張曉鈿等[16]、Schuurman等[17]及Kwon等[18]亦先后報(bào)道了此問題,且檢測結(jié)果與本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。與石巧娟等[7]結(jié)果相比較,其幼年期組(18~36月齡)紅細(xì)胞以MCV、MCH偏低,其余指標(biāo)基本一致。王崇圳等[19]報(bào)道的結(jié)果中,其MCV及MCH指標(biāo)雄性動物高于雌性動物與本研究結(jié)果相反;與李偉等[20]結(jié)果比較,其4~6歲雌性群居食蟹猴RBC、HGB高于本研究結(jié)果,而其MCV及MCH偏低??赡転閭€體發(fā)育性成熟、環(huán)境氣候、地理位置、動物數(shù)量及動物應(yīng)激等因素所導(dǎo)致。與兒童的紅細(xì)胞參數(shù)相比較[21],其變化趨勢基本一致。

    免疫細(xì)胞方面,3周歲前動物的免疫細(xì)胞數(shù)量較多,在3~4周歲時多呈下降趨勢且雄性動物WBC、LYMPH高于雌性動物,見圖1??赡転槟暧椎氖承泛镆蛎庖呦到y(tǒng)、免疫器官尚未發(fā)育完善而高于其他年齡段;與相關(guān)已報(bào)道的文獻(xiàn)相比較,大致年齡段3~4周歲的食蟹猴其WBC、LYMPH指標(biāo)雄性高于雌性,與本研究結(jié)果相一致。與張曉鈿等[16]、劉士剛等[14]、石巧娟等[12]結(jié)果相比較,WBC及LYMPH指標(biāo)均為雄性動物高于雌性動物,而本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對偏高??赡芘c應(yīng)激誘導(dǎo)條件有關(guān),提示建立實(shí)驗(yàn)室生物數(shù)據(jù)時應(yīng)考慮到不同區(qū)域、動物不同性別、不同年齡及年齡跨度的不同而存在的差異性。參考正常人類不同年齡外周循環(huán)白細(xì)胞計(jì)數(shù),4~12周歲兒童免疫細(xì)胞隨年齡的增長而下降,其變化伴隨免疫系統(tǒng)發(fā)育成熟過程[21],也可能為地域性差異所導(dǎo)致[6],食蟹猴免疫細(xì)胞變化情況與人類相比較基本一致[21]。

    血小板方面,血小板指數(shù)(MPV、PDW、P-LCR)呈下降趨勢且雌性動物高于雄性動物,而PLT數(shù)量則雄性顯著高于雌性且在3~4周歲時呈上升趨勢,見圖2。可能為幼年動物生長發(fā)育階段,骨髓細(xì)胞增殖、分化為造血干細(xì)胞,血小板因巨核細(xì)胞的增多而呈調(diào)節(jié)性變化。與石巧娟等[12]、李巖等[13]研究結(jié)果相一致。與劉士剛等[14]結(jié)果相比,其3~5歲齡食蟹猴PLT指標(biāo)偏低,其余指標(biāo)基本一致。與李偉等[20]、田朝陽等[22]結(jié)果比較,其雌性動物PLT指標(biāo)均偏低,且隨年齡增加而呈下降趨勢,可能為動物數(shù)量、地域因素、年齡跨度大因素導(dǎo)致。這也提示動物隨年齡的增長其血小板計(jì)數(shù)有下降的趨勢[23]。本研究結(jié)果也顯示動物血小板指數(shù)隨年齡增長有所下降,PLT雄性動物高于雌性,可能由于雄性動物活潑好動而致使PLT高于雌性動物[23],亦可能雌性動物處于生理周期所引起。

    因幼年動物處于生長發(fā)育階段,而3~4周歲的食蟹猴恰好亦處于向性成熟階段過渡,因此血液學(xué)各指標(biāo)在該年齡段變化較大。本研究提供了較常用于實(shí)驗(yàn)的幼年期食蟹猴具體年齡段的背景數(shù)據(jù),初步建立廣東省內(nèi)幼年期食蟹猴血液學(xué)指標(biāo)參考值范圍,為應(yīng)用食蟹猴進(jìn)行藥物的藥效學(xué)研究及非臨床安全性評價研究等方面提供血液學(xué)指標(biāo)的參考及支撐數(shù)據(jù)。

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