代謝手術(shù)動物模型制備與應(yīng)用現(xiàn)狀

杜 磊，曲 伸

(同濟大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院，1.減重糖尿病代謝外科， 2.內(nèi)分泌代謝中心，上海 200072)

隨著社會經(jīng)濟發(fā)展、人們物質(zhì)生活水平提高，我國肥胖及糖尿病發(fā)病率逐年上升。2015年，我國成人超重及肥胖發(fā)病率分別為30.1%、11.9%[1]。肥胖與2型糖尿病、高血壓病、高脂血癥等多種代謝性疾病的發(fā)生密切相關(guān)。數(shù)據(jù)監(jiān)測顯示，2013年我國成人糖尿病患病率達(dá)10.4%[2]。肥胖與糖尿病嚴(yán)重影響居民健康質(zhì)量。近年來，以袖狀胃切除術(shù)(sleeve gastrectomy，SG)、胃旁路術(shù)(Roux-en-Y gastric bypass，RYGB)等術(shù)式為主的代謝外科發(fā)展迅速，2013年全球開展代謝手術(shù)達(dá)46.8萬例[3]。國內(nèi)代謝手術(shù)起步較晚，但發(fā)展勢頭良好[4]，在減體重降血糖方面效果明顯，成為治療肥胖及2型糖尿病的重要治療手段[5-7]。

代謝手術(shù)減重降糖的機制，不僅通過減少能量的攝入和吸收，還涉及其他通路機制。已有證據(jù)表明，代謝手術(shù)可改變神經(jīng)系統(tǒng)攝食中樞活動[8]。但其具體機制仍不明確，因此進一步研究代謝手術(shù)減重降糖等改變代謝的機制具有很大的科研及臨床價值。作為研究的基礎(chǔ)，多種代謝手術(shù)動物模型被創(chuàng)造并用于相關(guān)科學(xué)研究。本文概括總結(jié)常見代謝手術(shù)動物模型的制備方法及應(yīng)用狀況。

1 動物的選擇及代謝相關(guān)疾病動物模型的制備

1.1 實驗動物的選取

動物選擇范圍廣泛，能夠誘導(dǎo)模擬人類代謝性疾病生理狀態(tài)的動物，包括大鼠、小鼠、豬、貓、犬、猴等。通過施加一定的干預(yù)措施，制造代謝紊亂狀態(tài)，在此基礎(chǔ)上行袖狀胃切除術(shù)、胃旁路術(shù)等，監(jiān)測術(shù)后實驗動物生理生化及激素指標(biāo)的變化。基本可模擬人類罹患代謝性疾病、接受手術(shù)治療前后病理生理的改變。而綜合實驗操控難易程度、實驗可重復(fù)性、動物飼養(yǎng)準(zhǔn)備條件、經(jīng)濟因素等，代謝手術(shù)模型常選用大鼠[9-10]、小鼠[11]等小型哺乳動物，又以大鼠應(yīng)用最為普遍[12]。

1.2 代謝疾病模型的建立

動物實驗研究代謝手術(shù)對代謝相關(guān)疾病，如糖尿病、高脂血癥等的影響及其作用機制，在行手術(shù)干預(yù)之前往往需要建立實驗動物代謝紊亂的模型。以大鼠為例，根據(jù)其罹患肥胖、糖尿病的情況及相關(guān)疾病獲得方式，將實驗動物分為自發(fā)型、實驗型及轉(zhuǎn)基因型三類[13]。自發(fā)型代謝疾病大鼠，即通過篩選自然基因缺陷而易患肥胖或糖尿病等疾病大鼠，使之近親繁殖，從而培養(yǎng)特定疾病類型的大鼠，如ZDF(zucker diabetic fatty)大鼠、GK(Goto-Kakizaki)大鼠[14]、ZF(zucker fatty)大鼠等，其特征分別為肥胖伴糖尿病、非肥胖伴糖尿病、肥胖伴胰島素抵抗(非糖尿病)[12]。實驗型代謝疾病大鼠，即對正常大鼠施加特定的干預(yù)措施，從而造成某種代謝紊亂的動物模型。如通過胰腺切除、鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)誘導(dǎo)[15]、小劑量鏈脲佐菌素聯(lián)合高脂高糖飲食誘導(dǎo)[16]等建立糖尿病動物模型。轉(zhuǎn)基因型動物模型，及利用基因編輯技術(shù)改造大鼠基因，使之罹患糖尿病等相關(guān)疾病[17]。受制于技術(shù)難度及經(jīng)濟因素，動物實驗開展不及自發(fā)型、實驗型廣泛。

在制備代謝手術(shù)模型之前，尚需對所用動物代謝紊亂狀態(tài)進行評估。而以糖尿病動物模型為例，建模成功與否尚缺乏統(tǒng)一的評估標(biāo)準(zhǔn)。常見實驗動物的血糖生理水平見表1[18]。

綜合文獻(xiàn)報道，多以出現(xiàn)糖尿病多飲多尿癥狀及血糖達(dá)標(biāo)為主要判斷標(biāo)準(zhǔn)。其中血糖的標(biāo)準(zhǔn)，不同造模方法、不同文獻(xiàn)報道標(biāo)準(zhǔn)存在差異[12, 19-20]。

2 代謝手術(shù)動物模型的制備

2.1 動物的基本解剖生理特點

成功手術(shù)模型的設(shè)計與建立，需要熟悉實驗動物的正常生理結(jié)構(gòu)特點。代謝手術(shù)，包括袖狀胃切除術(shù)、Roux-en-Y胃旁路術(shù)、十二指腸-空腸轉(zhuǎn)流術(shù)等，主要在動物胃腸道器官上施加干預(yù)措施。因此開展代謝手術(shù)動物實驗，必須熟練掌握實驗動物的胃腸道正常生理結(jié)構(gòu)特點。常見實驗動物腸道長度見表2[18]。

表1 常見實驗動物血糖值

表2 常見實驗動物腸道長度

2.2 常見代謝手術(shù)動物模型制備方法[9-11, 21-33]

不同文獻(xiàn)報道代謝手術(shù)動物模型制備方法略有差異，但都遵循了以下基本程序方法：

2.2.1 術(shù)前準(zhǔn)備

根據(jù)不同實驗?zāi)康?，選取適當(dāng)種類及大小動物。以大鼠為例，參照研究設(shè)計，可選擇罹患不同代謝疾病的大鼠，如ZDF、GK大鼠等，也可選擇正常SD(Sprague-Dawley)大鼠。以體重200 g(施加干預(yù)前)左右的大鼠多見，此體重大鼠生理儲備能力較強、接受實驗干預(yù)存活率較高，且操作方便。施加干預(yù)前，往往給予3～7 d的適應(yīng)性喂養(yǎng)。在手術(shù)開始前，予以禁食12～24 h，不禁水。

2.2.2 麻醉及預(yù)防感染

麻醉方式多為腹腔注射全身麻醉，常用麻醉藥物有1%戊巴比妥鈉(3.5～4.5 mL/kg)。根據(jù)手術(shù)進程，必要時術(shù)中可追加麻醉藥物。也有學(xué)者采用濃度2%～5%異氟烷氣體吸入全身麻醉[11]。針對豬等較大體型哺乳動物，進行動物手術(shù)實驗麻醉方法相對復(fù)雜，一般需鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、肌肉松弛藥物配合使用，術(shù)前雞肉注射途徑麻醉誘導(dǎo)，術(shù)中靜脈全身麻醉維持[23]，更趨近于人類手術(shù)的麻醉方式。

代謝術(shù)式屬于胃腸道手術(shù)，Ⅱ類切口，術(shù)后腹腔感染是導(dǎo)致實驗動物死亡的常見并發(fā)癥，因此動物實驗開展代謝手術(shù)需要使用抗生素預(yù)防感染。常于術(shù)前半小時、術(shù)后前3天給予下肢肌肉注射抗菌素，所用抗菌藥物以青霉素類、頭孢菌素類常見，如青霉素(30 000 U/kg)、氟氯西林鈉(100 mg/kg)、頭孢唑啉(100 mg/kg)、頭孢替安(30 mg/kg)、頭孢曲松(60 mg/kg)。

2.2.3 手術(shù)操作基本流程

按照動物外科手術(shù)操作規(guī)范，術(shù)前常規(guī)備皮、碘伏溶液消毒術(shù)區(qū)、鋪無菌洞巾。受器械設(shè)備、操控技術(shù)可行性等條件限制，目前動物實驗開展代謝手術(shù)，當(dāng)實驗對象為大鼠、小鼠、兔等體型較小哺乳動物時常行開腹手術(shù)；而當(dāng)實驗對象為豬等體型較大動物時則可行腹腔鏡手術(shù)。

以大鼠為例，開腹手術(shù)以上腹部正中切口最為常見，長約2～4 cm，逐層進腹。以豬為實驗對象行腹腔鏡手術(shù)時，根據(jù)手術(shù)操作難易程度取4～5個5 mm的Trocar孔：首先選取生殖器頭側(cè)2 cm位置建立觀察孔；建立氣腹，壓力維持在10 mmHg左右；根據(jù)體型大小及腹部輪廓合理選擇各操作孔位置。下文以實驗動物鼠為例，介紹臨床開展最多的袖狀胃切除術(shù)、Roux-en-Y胃旁路術(shù)常規(guī)操作方法。

袖狀胃切除術(shù)：暴露胃組織，離斷肝胃韌帶、脾胃韌帶，沿大彎側(cè)分批離斷結(jié)扎網(wǎng)膜血管弓及胃短血管，分別于胃大彎側(cè)距幽門5 mm處、his角上下兩點，沿胃小彎走形各夾閉一把無損傷血管鉗，沿血管鉗離斷并移除約70%～80%大彎側(cè)胃組織，包含全部胃底。切緣消毒后用無菌縫線(大鼠用5-0或6-0；小鼠用9-0)間斷縫合切緣，徹底止血。將殘留胃回置原位。逐層關(guān)閉腹膜、肌肉、皮膚，完成袖狀胃手術(shù)操作。也有學(xué)者在對胃行袖狀切除之前，切開胃組織置入支撐管，以避免殘胃通道狹窄[26]。

Roux-en-Y胃旁路術(shù)：進入腹腔后，分離暴露胃腸組織，首先建立近端胃小囊，即從小彎側(cè)賁門下1 mm處至大彎側(cè)平分胃大彎中點到his角處離斷胃腔，使近端殘胃容積占比全胃的20%～30%左右。然后treitz韌帶遠(yuǎn)端10～20 cm(大鼠)、4 cm(小鼠)處離斷小腸。遠(yuǎn)端小腸與近端胃小囊于大彎側(cè)胃前壁或胃后壁行側(cè)側(cè)吻合。近端小腸與胃腸吻合口遠(yuǎn)端10～20 cm(大鼠)、6 cm(小鼠)處小腸行端側(cè)吻合。胃-腸及腸-腸吻合口一般采用6-0線(大鼠)、9-0線(小鼠)間斷縫合，針距1 mm左右。各吻合口直徑多取0.5～1.0 cm大小。徹底止血、沖洗腹腔后逐層關(guān)腹，術(shù)畢?，F(xiàn)行動物實驗中，不少學(xué)者在建立胃小囊時采用6-0絲線捆扎或縫扎來隔斷近、遠(yuǎn)端胃腔，取代直接離斷胃組織，以降低胃腸內(nèi)容物污染、腹腔感染的機率。

圍手術(shù)期的觀察處理對術(shù)后動物的存活至關(guān)重要。術(shù)前30 min及術(shù)后前3 d常需肌注抗生素預(yù)防感染、皮下注射生理鹽水(每次0.5 mL/kg，每天1～2次)維持水電解質(zhì)平衡。術(shù)后24 h禁食水，術(shù)后第2、3天口服葡糖糖注射液，3 d后流質(zhì)飲食，逐步過渡到正常飲食。術(shù)后及時觀察、對癥處理是影響動物存活的重要因素。

3 影響代謝手術(shù)動物模型制備的因素

文獻(xiàn)報道袖狀胃切除術(shù)動物模型建模成功率約為70%～95.24%[11, 25, 27]，Roux-en-Y胃旁路術(shù)建模成功率約為50%～83.34%[9, 11, 30, 32-33]，造成術(shù)中術(shù)后動物死亡的主要原因包括麻醉過深、出血、水電解質(zhì)紊亂、腹腔感染、吻合口梗阻、吻合口瘺、胃腸道缺血壞死等。影響術(shù)后動物存活即造模成功的因素，主要有以下幾點：

3.1 麻醉及手術(shù)操作技能

安全適度的麻醉方法與嫻熟高效的手術(shù)操作技能對動物實驗的成功開展至關(guān)重要。麻醉過淺影響手術(shù)進程，麻醉過深易致動物麻醉藥中毒。熟練的手術(shù)技能是成功建立動物手術(shù)模型的核心要素。富有經(jīng)驗的手術(shù)操作，能夠明顯降低術(shù)中出血、吻合口梗阻、吻合口瘺的機率，有效保護術(shù)區(qū)組織器官血供，縮短手術(shù)時間。因此，初涉動物實驗的科研人員進行培訓(xùn)、開展預(yù)實驗十分必要。結(jié)合相關(guān)資料，通過預(yù)實驗可以摸索實驗動物的理想麻醉條件、學(xué)習(xí)實驗動物的生理解剖特點、鍛煉手術(shù)操作技能。

3.2 科學(xué)合理的圍手術(shù)期支持措施

圍手術(shù)期密切觀察實驗動物并給予合理的對癥支持，可有效降低手術(shù)并發(fā)癥的發(fā)生率。如術(shù)前30 min及術(shù)后3 d肌注抗生素可有效預(yù)防控制感染；術(shù)中及術(shù)后3 d皮下注射適量生理鹽水有利于避免動物脫水，維持水電解質(zhì)平衡；術(shù)前及術(shù)后適當(dāng)時間的禁食水可減少腹腔感染、吻合口瘺的發(fā)生。

3.3 完備的動物實驗平臺

良好的動物飼養(yǎng)條件、清潔的手術(shù)操作平臺、充足的無菌手術(shù)器械耗材、規(guī)范的動物實驗管理流程等，可為代謝手術(shù)動物模型的成功建立提供很大的便利。

4 代謝手術(shù)模型在科學(xué)研究中的應(yīng)用

鑒于代謝手術(shù)可顯著改善患者肥胖、糖尿病、高血壓病、高脂血癥等代謝紊亂病理狀態(tài)，而其具體機制尚不明確，代謝手術(shù)動物模型便被廣泛用于相關(guān)基礎(chǔ)科學(xué)研究[12]，主要有以下幾點：

4.1 用于不同代謝手術(shù)方式改善代謝紊亂效果的研究

不同方式的代謝手術(shù)，均有減重降糖的效果，動物實驗成為研究對比不同術(shù)式改善代謝效果的重要手段。Abegg等[34]利用ZDF大鼠代謝手術(shù)模型，發(fā)現(xiàn)袖狀胃切除術(shù)或Roux-en-Y胃旁路術(shù)聯(lián)合術(shù)后胰島素的降糖減重效果明顯優(yōu)于藥物強化治療和飲食控制。Zheng等[24]利用飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠(C57BL/6J)建立代謝手術(shù)模型，發(fā)現(xiàn)Roux-en-Y胃旁路術(shù)在減輕體重、控制血糖方面與垂直袖狀胃切除術(shù)相比具有優(yōu)勢。

4.2 用于探索代謝手術(shù)減重降糖機制的研究

Erika等[35]研究ApoE3L.CETP小鼠手術(shù)模型，再次明確了RYGB可以明顯改善小鼠糖脂代謝，其中血甘油三酯、總鞘磷脂的降低及胰島素抵抗的改善依賴于體重的降低，而血總膽固醇、非高密度脂蛋白、總神經(jīng)酰胺的降低則為RYGB術(shù)特發(fā)性的改變，與體重的降低無關(guān)。Andrew等[36]利用SD大鼠建立RYGB和RYGB+迷走神經(jīng)肝支離斷模型，發(fā)現(xiàn)RYGB所致的體重降低、食欲改變、能量消耗與肝迷走神經(jīng)活動無關(guān)。Méndez-Giménez等[37]發(fā)現(xiàn)大鼠行袖狀胃切除術(shù)后水通道蛋白-7的表達(dá)上調(diào)，通過胰高血糖素樣肽-1促進胰島素的釋放，改善胰島素抵抗。郭偉等[38]研究發(fā)現(xiàn)RYGB術(shù)后肥胖大鼠腎糖異生關(guān)鍵酶表達(dá)下調(diào)、糖異生活動減弱，可能是手術(shù)改善大鼠糖代謝與胰島素抵抗的機制之一。Feng等[39]以自發(fā)性糖尿病小鼠為研究對象，在其尚未發(fā)病時實施預(yù)防性的袖狀胃切除術(shù)，發(fā)現(xiàn)袖狀胃切除術(shù)可以改善小鼠胰島細(xì)胞功能，并且這種作用與胰高血糖素樣肽-1有關(guān)。

4.3 用于探索代謝手術(shù)改善其他臟器功能的研究

由肥胖、2型糖尿病引起的代謝紊亂，往往導(dǎo)致多種代謝相關(guān)性疾病，如高血壓病、高脂血癥、脂肪肝、睡眠呼吸暫停綜合征、多囊卵巢綜合征、勃起功能障礙等，而代謝手術(shù)亦可明顯減輕上述疾病病理狀態(tài)[40-41]，推測其與代謝手術(shù)改變體內(nèi)不同激素水平有關(guān)，但具體機制尚不明確。在動物實驗水平，研究代謝手術(shù)對心血管、腎、生殖等系統(tǒng)的影響也是當(dāng)前熱點[12]。洪杰等[42]研究十二指腸空腸旁路術(shù)與全胃Roux-en-Y吻合術(shù)對SD大鼠水鈉平衡的影響，發(fā)現(xiàn)胃轉(zhuǎn)流術(shù)后SD大鼠24 h飲水量、尿量、尿鈉明顯增加，從電解質(zhì)角度提供了代謝手術(shù)影響血壓的研究方向。Zhang 等[43]研究發(fā)現(xiàn)袖狀胃切除術(shù)和十二指腸-空腸旁路術(shù)可以通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減少心肌細(xì)胞凋亡，改善糖尿病大鼠的心功能。此方面尚有許多研究，在此不贅述。

5 總結(jié)與展望

代謝手術(shù)良好的臨床治療效果、尚未明確的機制促使動物水平開展相關(guān)研究成為熱點。利用大鼠、小鼠、豬等常用實驗動物，已形成代謝手術(shù)常見術(shù)式的動物模型，且在醫(yī)學(xué)研究中廣泛應(yīng)用。目前關(guān)于判斷代謝紊亂如糖尿病模型成功與否，以及代謝手術(shù)曠置腸管長度尚缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。如何確立不同動物代謝紊亂的標(biāo)準(zhǔn)、手術(shù)離斷胃腸道的具體位置，更好的模擬人類代謝性疾病的病理生理狀態(tài)、手術(shù)帶來的具體影響，是未來建立代謝手術(shù)動物模型尚需進一步探索的課題。