白藜蘆醇抑制膀胱癌細(xì)胞體外侵襲能力的研究

張 棟，楊小杰，雒啟東，付德來(lái)，李釗倫，張 鵬，種 鐵

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710004)

白藜蘆醇(resveratrol，Res)是廣泛存在于葡萄、花生和多種藥用植物中的一種多酚類化合物，其具有抗炎、抗氧化、保護(hù)心血管及抗腫瘤等多種生物學(xué)作用[1-3]，但其在膀胱癌中的作用少有報(bào)道。我們前期研究發(fā)現(xiàn)Res可抑制膀胱癌5637和T24細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，本研究通過(guò)觀察Res對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞的遷移及侵襲能力的作用，探討Res對(duì)膀胱癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力的影響及其機(jī)制，為膀胱癌的治療提供新的思路與策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料膀胱癌T24細(xì)胞株購(gòu)自上海中科院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。主要試劑Res購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，基質(zhì)膠(Matrigel)購(gòu)自美國(guó)BD公司，RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，MMP-2與MMP-9抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清(體積分?jǐn)?shù))的RPMI 1640培養(yǎng)基在37.5 ℃、5% CO2(體積分?jǐn)?shù))的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，以1.25 g/L胰酶和0.2 g/L乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)的混合液消化傳代。

1.2.2劃痕試驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期T24細(xì)胞接種至6孔板，待其面積匯合至接種板的90%后，用尖端粗細(xì)相同的10 μL槍頭劃數(shù)條直線，洗去刮起漂浮的細(xì)胞，加入30 μmol/L Res或二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，于24、48 h后采集圖像，觀察細(xì)胞遷移情況。

1.2.3體外侵襲實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用24孔、膜孔徑8 μm的Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞的體外侵襲能力。將Matrigel與無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基按1∶5的比例稀釋后，每室50 μL鋪于Transwell小室上室底部，置于37 ℃培養(yǎng)箱待其凝固。30 μmol/L Res處理24 h后，將100 μL含有5×104個(gè) T24細(xì)胞的懸液接種于Transwell上室，每種細(xì)胞復(fù)種3室，同時(shí)復(fù)種DMSO對(duì)照組；下室加1 mL含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。于37.5 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h與48 h后取出小室，用磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffered saline，PBS)清洗，棉簽擦拭上室附著的細(xì)胞。將已經(jīng)侵入下層并貼附于微孔濾膜的細(xì)胞用40 g/L多聚甲醛固定5 min，吉姆薩(Giemsa)染色8 min，PBS清洗3次。顯微鏡下觀察，每張微孔濾膜隨機(jī)選3個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.4實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time polymerase chain reaction，RTPCR) 檢測(cè)MMP-2與MMP-9的表達(dá)Trizol試劑提取細(xì)胞RNA后，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，59 ℃ 15 s，擴(kuò)增50個(gè)循環(huán)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算Ct值，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算2-ΔΔCt值。引物序列如下：MMP-2上游引物：5′-CCCACTGCGGTTTTCTCGAAT-3′，MMP-2下游引物：5′-CAAAGGGGTATCCATCGCCAT-3′，MMP-9上游引物：5′-AGACCTGGGCAGATTCCAAAC-3′，MMP-9下游引物：5′-CGGCAAGTCTTCCGAGTAGT-3′。

1.2.5蛋白印跡試驗(yàn)(Western blot) T24細(xì)胞按每孔1×106個(gè)密度接種至6孔板。用30 μmol/L Res培養(yǎng)24 h與48 h后，冰PBS小心洗滌，蛋白提取液提取總蛋白。12.5% SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，用MMP-2、MMP-9抗體4 ℃孵育過(guò)夜。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育0.5 h，蛋白條帶ECL試劑盒顯色發(fā)光。

2 結(jié) 果

2.1 Res可抑制膀胱癌T24細(xì)胞的遷移能力30 μmol/L Res處理膀胱癌T24細(xì)胞24 h與48 h后，檢測(cè)T24細(xì)胞遷移能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Res顯著抑制T24細(xì)胞體外遷移能力，Res組較對(duì)照組細(xì)胞遷移能力顯著降低(圖1)。

2.2 Res可抑制膀胱癌T24細(xì)胞體外侵襲能力在驗(yàn)證了Res可抑制T24細(xì)胞體外遷移能力后，我們進(jìn)而檢測(cè)了Res對(duì)T24細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果表明：30 μmol/L Res處理膀胱癌T24細(xì)胞24 h后，其侵襲能力受到顯著抑制(P<0.05，圖2)。

2.3 Res可抑制膀胱癌T24細(xì)胞MMP-2與MMP-9的表達(dá)Res處理T24細(xì)胞24 h與48 h后，應(yīng)用Real-time PCR與Western blot檢測(cè)MMP-2與MMP-9的表達(dá)變化。結(jié)果提示，Res可從mRNA與蛋白水平顯著抑制T24細(xì)胞MMP-2與MMP-9的表達(dá)，且呈時(shí)間依賴性(P<0.05,圖3)。

圖1 劃痕試驗(yàn)檢測(cè)Res及DSMO不同培養(yǎng)時(shí)間的遷移能力

圖2 Transwell小室檢測(cè)Res和DMSO在不同培養(yǎng)時(shí)間的侵襲能力

圖3 Real-time PCR及Western blot檢測(cè)Res作用下膀胱癌T24中MMP-2與MMP-9的表達(dá)

A：Res處理后Real-time PCR檢測(cè)MMP-2與MMP-9的表達(dá)量，*P<0.05；B：Res處理后Western blot檢測(cè)MMP-2與MMP-9的表達(dá)。

3 討 論

Res是一種含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物，廣泛存在于蓼科植物虎杖的根莖與根，豆科植物花生的種子，葡萄科植物葡萄果實(shí)的皮與籽等[4-5]。Res最初在1924年被發(fā)現(xiàn)，但近年來(lái)才逐漸受到重視并廣泛加以研究。目前的研究表明Res具有抗炎、抗氧化、抑制動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成以及抗腫瘤等多種生物學(xué)功能[1-3,6-8]，其中抗腫瘤作用最令人關(guān)注。Res對(duì)多種實(shí)體腫瘤如肝細(xì)胞癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等具有顯著的抑制作用[9-11]，但對(duì)膀胱癌的作用目前知之甚少。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，Res可抑制膀胱癌5637和T24細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且可以提高膀胱癌細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用[12]。本研究中我們檢測(cè)了Res對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響。Res處理T24細(xì)胞24 h與48 h后，膀胱癌細(xì)胞體外遷移能力顯著下降。我們進(jìn)而應(yīng)用Matrigel模仿細(xì)胞外基質(zhì)測(cè)定Res對(duì)T24細(xì)胞侵襲能力的影響，發(fā)現(xiàn)Res處理T24細(xì)胞24 h與48 h后，對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)較Res處理組細(xì)胞穿膜數(shù)顯著增多(P<0.05)，提示Res可抑制T24細(xì)胞體外遷移與侵襲能力。

腫瘤微環(huán)境是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，是指由腫瘤局部的各種細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、酶和細(xì)胞因子等共同構(gòu)成的微環(huán)境。其中細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)是腫瘤的天然組織學(xué)屏障，ECM或基膜的降解是腫瘤侵襲與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[13-14]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是一個(gè)大家族，主要功能是降解ECM，在胚胎發(fā)育、血管生成、纖維化疾病及惡性腫瘤的浸潤(rùn)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等病理生理過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。其中Ⅳ型膠原酶為研究最多的一類，它主要有兩種形式：一種被糖化，分子量為92 ku，命名為MMP-9；另一種非糖化，分子量為72 ku，被稱為MMP-2。當(dāng)前對(duì)MMP-2，MMP-9的研究較深入，MMP-2和MMP-9又稱明膠酶或Ⅳ型膠原酶，可以通過(guò)降解基膜主要成分Ⅳ型膠原，促進(jìn)多種惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[15-16]。最近的研究顯示：Res能明顯抑制肺癌、乳腺癌細(xì)胞及膠質(zhì)瘤細(xì)胞MMP-2和MMP-9表達(dá)[17-19]。本研究結(jié)果顯示Res處理膀胱癌細(xì)胞后，細(xì)胞侵襲能力顯著下降，且細(xì)胞中MMP-2和MMP-9表達(dá)水平明顯降低，提示Res可能通過(guò)抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)從而抑制膀胱癌細(xì)胞的侵襲能力。

綜上，我們的結(jié)果證實(shí)Res可能通過(guò)下調(diào)膀胱癌T24細(xì)胞中的MMP-2與MMP-9的表達(dá)而抑制其體外遷移與侵襲能力，Res可能成為臨床膀胱癌治療的新策略。