膀胱癌中自噬相關(guān)基因Beclin1和Bcl2 mRNA表達(dá)相關(guān)性及其臨床意義

王振龍，湯 輝，李洪亮，薛玉泉，薛 力，鐘 鐵

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710004)

膀胱癌是常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，多表現(xiàn)為間歇性、無痛性血尿。在全球范圍內(nèi)，膀胱癌的發(fā)病率居惡性腫瘤第11位，在西方國家泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中的發(fā)病率僅次于前列腺癌，位居第2[1]，但在我國是發(fā)病率最高的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，根據(jù)《2012中國腫瘤登記年報(bào)》統(tǒng)計(jì)，我國膀胱癌發(fā)病率約為6.6/10萬人，在所有惡性腫瘤發(fā)病率中排第9位，發(fā)病年齡在51～70歲最常見，其中男性發(fā)病率約為女性的3～4倍[2]。根據(jù)膀胱癌浸潤(rùn)深度及轉(zhuǎn)移情況，可分為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌和肌層浸潤(rùn)性膀胱癌，非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌包括Tis、Ta、T1，肌層浸潤(rùn)性膀胱癌為T2以上。影響膀胱癌進(jìn)展的因素有腫瘤分期、分級(jí)、腫瘤大小和數(shù)量[3]。肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者的預(yù)后很差，與腫瘤浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)情況有關(guān)，5年總體生存率為25%～66%[4-5]。外科手術(shù)聯(lián)合術(shù)后膀胱灌注化療是常用的治療手段，但是1995至2015年期間，膀胱癌病死率并沒有得到顯著控制[6-7]。

膀胱癌是由多基因、多步驟調(diào)控異常所導(dǎo)致的惡性腫瘤。因此探究闡明膀胱癌發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)機(jī)制，可為找到針對(duì)性治療膀胱癌提供理論依據(jù)。自噬基因Beclin1和B淋巴細(xì)胞瘤2基因(B-cell lymphoma2，Bcl2)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8]，但在膀胱癌發(fā)病中的機(jī)制和關(guān)系研究?jī)H停留在蛋白水平，且聯(lián)合檢測(cè)這兩個(gè)基因的表達(dá)與膀胱癌相關(guān)性的報(bào)道很少。因此，本研究擬采用分支-DNA液相芯片法測(cè)定膀胱癌患者腫瘤組織和癌旁正常組織中Beclin1和Bcl2 mRNA水平，并分析Beclin1和Bcl2 mRNA表達(dá)水平與膀胱癌臨床病理特征的關(guān)系，為膀胱癌的臨床診斷、治療方案的選擇及療效預(yù)測(cè)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本收集2015年1月至2017年12月在西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科就診的膀胱癌患者組織標(biāo)本53例，均經(jīng)影像學(xué)檢查、實(shí)驗(yàn)室檢查及手術(shù)后病理證實(shí)。男性32例，女性21例；年齡38～81歲，中位年齡61歲。所有病例手術(shù)前均未接受放、化療，為初治病例。同期取距離腫瘤組織3 cm處癌旁組織20例作為正常組織對(duì)照組。

1.2 樣本制備腫瘤組織及癌旁正常組織用生理鹽水清洗干凈，再用10%的福爾馬林溶液(體積分?jǐn)?shù))固定16～24 h，用乙醇洗滌后，送至廣州益善醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所(中國廣州，廣州科學(xué)城)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 Beclin1和Bcl2 mRNA的表達(dá)檢測(cè)采用分支DNA-液相芯片法，同時(shí)檢測(cè)樣本中的Beclin1和Bcl2 mRNA表達(dá)。樣本裂解后經(jīng)由微球捕獲，利用擴(kuò)增探針特異雜交對(duì)信號(hào)放大，通過液相芯片儀讀數(shù)判斷結(jié)果，該方法能在一次反應(yīng)中對(duì)多基因mRNA的表達(dá)同時(shí)測(cè)定，具體操作如下：①將裂解液加入一定的待測(cè)樣品中，55～58 ℃環(huán)境下裂解120 min；②裂解后將其轉(zhuǎn)移到孵育板，加入探針-微球、延伸探針及緩沖液于55 ℃環(huán)境中震蕩孵育過夜；③第2 d把孵育板轉(zhuǎn)移到磁力架上靜置1 min，促使磁性微球沉積至底部，吸取上清液并棄之；④去除上清液后將洗滌液加入其中，震蕩洗滌1 min，隨后再把孵育板轉(zhuǎn)移到磁力架上靜置1 min，棄去上清液，反復(fù)3次；⑤雜交，加入延伸探針、標(biāo)記探針，在50 ℃下震蕩反應(yīng)60 min；⑥再次洗滌，將孵育板放在磁力架上靜置1 min，棄去上清液，洗滌2次；⑦接著加入鏈霉親和素-藻紅蛋白，于50 ℃環(huán)境下震蕩反應(yīng)30 min，然后將孵育板放置在磁力架上1 min，棄去上清，洗滌2次；⑧讀數(shù)，加入洗滌液后震蕩5 min，通過Luminex閱讀儀(Luminex公司，美國得克薩斯州)讀取數(shù)據(jù)，并分析獲得的檢測(cè)結(jié)果。

1.4 結(jié)果判定Beclin1、Bcl2 mRNA表達(dá)水平以高、中、低表示，表達(dá)水平大于或等于75%為高表達(dá)，65%～75%為中偏高表達(dá)，40%～65%為中表達(dá)，40%～25%為中偏低表達(dá)，小于25%為低表達(dá)。將高表達(dá)、中偏高表達(dá)記為高表達(dá)[Beclin1(+)、Bcl2(+)]；中表達(dá)、中偏低表達(dá)和低表達(dá)記為中低表達(dá)[Beclin1(-)、Bcl2(-)]，如圖1所示。

圖1 mRNA表達(dá)分布劃分圖

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 18.0軟件，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，配對(duì)資料的關(guān)聯(lián)性分析采用Person或Spearman相關(guān)系數(shù)來描述，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 膀胱癌組織和癌旁組織中Beclin1、Bcl2 mRNA的表達(dá)膀胱癌組織中Beclin1和Bcl2 mRNA的高表達(dá)率分別為45.3%和26.4%，均顯著低于癌旁正常組織的90.0%和55.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 膀胱癌組織和癌旁組織中Beclin1、Bcl2 mRNA的表達(dá) [例(%)]

2.2 Beclin1、Bcl2 mRNA表達(dá)與膀胱癌臨床病理的關(guān)系在膀胱癌組織中，Beclin1 mRNA的高表達(dá)率在不同病理分級(jí)、臨床分期、生長(zhǎng)方式以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Bcl2 mRNA高表達(dá)率在不同病理分級(jí)、臨床分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 不同病理分級(jí)、臨床分期、生長(zhǎng)方式以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)膀胱癌組織中Beclin1、Bcl2 mRNA的表達(dá) [例(%)]

2.3 膀胱癌中Beclin1和Bcl2 mRNA表達(dá)的相關(guān)性分析對(duì)53例膀胱癌組織中Beclin1和Bcl2 mRNA的高表達(dá)率和中低表達(dá)率進(jìn)行Spearman相關(guān)分析，結(jié)果顯示，膀胱癌組織中Beclin1和Bcl2 mRNA兩者的高表達(dá)率之間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.287,P=0.037)。

3 討 論

目前認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞增殖失控和細(xì)胞死亡抑制密切相關(guān)。細(xì)胞的3種程序性死亡方式分別為細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死和細(xì)胞自噬。細(xì)胞凋亡又稱Ⅰ型程序性死亡，是一種不同于壞死及自噬性死亡的細(xì)胞生理性死亡方式，它是受一系列基因調(diào)控的有序性死亡[9]。Bcl2基因是細(xì)胞凋亡抑制基因，在抑制細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。Bcl2基因編碼的蛋白質(zhì)可以抑制細(xì)胞凋亡途徑，延長(zhǎng)細(xì)胞生存并增加細(xì)胞分裂，導(dǎo)致細(xì)胞過度異常聚集，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在前列腺癌和乳腺癌組織中，Bcl2的表達(dá)顯著升高[10]。但是在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用未見相關(guān)報(bào)道。本研究中，凋亡抑制基因Bcl2 mRNA在膀胱癌組織中的高表達(dá)率低于癌旁正常組織，且隨著病理分級(jí)和臨床分期的升高，高表達(dá)率也逐漸升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中，凋亡抑制基因Bcl2發(fā)揮了重要作用。

細(xì)胞自噬也稱為Ⅱ型程序性死亡，是細(xì)胞利用溶酶體降解體內(nèi)多余的蛋白質(zhì)和亞細(xì)胞成分的催化過程[11]。研究表明，細(xì)胞自噬的發(fā)生與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[12]。自噬基因Beclin1是參與哺乳動(dòng)物自噬調(diào)控的特異性基因，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、分化和生長(zhǎng)的作用，可以通過提高細(xì)胞自噬從而抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。在肺癌細(xì)胞A549中敲除Beclin1基因，會(huì)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制細(xì)胞凋亡[13]。研究表明，Beclin1的表達(dá)在前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌組織中分別下降了40%、50%、75%[14]。本次研究結(jié)果顯示，膀胱癌組織中Beclin1 mRNA的高表達(dá)率低于癌旁正常組織。提示在膀胱癌發(fā)生早期，細(xì)胞自噬可能被抑制，與段振玲等[15]在卵巢癌中的研究結(jié)論相似。Beclin1 mRNA的高表達(dá)率與膀胱癌病理分級(jí)、生長(zhǎng)方式、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等預(yù)后影響因素有關(guān)(P<0.05)，腫瘤分化程度越低，Beclin1 mRNA高表達(dá)率越低。在惡性程度更高的膀胱癌(T2～T4期)中，Beclin1 mRNA高表達(dá)率更低。李飛等[16]采用免疫組化方法研究Beclin1蛋白在膀胱癌組織中的表達(dá)，本研究結(jié)果與之一致，表明在膀胱癌發(fā)展惡化過程中，Beclin1基因表達(dá)發(fā)揮重要作用，證明Beclin1可作為膀胱癌診斷和治療新的生物標(biāo)記物。

本研究采用分支DNA液相芯片技術(shù)檢測(cè)Beclin1和Bcl2 mRNA表達(dá)，與常用的mRNA表達(dá)檢測(cè)方法逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)不同，分支DNA液相芯片法可直接對(duì)樣本裂解并進(jìn)行檢測(cè)，不需要對(duì)樣本進(jìn)行RNA抽提、純化、逆轉(zhuǎn)錄和目標(biāo)片段擴(kuò)增，減少了積累誤差，因此，最大程度保證檢測(cè)結(jié)果的可靠性。同時(shí)通過擴(kuò)增探針進(jìn)行信號(hào)放大，極大程度提高了檢測(cè)的靈敏度。

本研究還進(jìn)一步分析了Beclin1和Bcl2 mRNA表達(dá)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)膀胱癌組織中Beclin1和Bcl2 mRNA兩者的高表達(dá)率之間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.287,P=0.037)。提示自噬和凋亡可能均參與了膀胱癌的發(fā)生發(fā)展，Bcl2表達(dá)對(duì)Beclin1相關(guān)的細(xì)胞自噬起負(fù)調(diào)節(jié)作用，其可能的機(jī)制是Beclin1的BH3區(qū)域可以和Bcl2結(jié)合，導(dǎo)致Beclin1調(diào)控的自噬作用減弱，細(xì)胞的凋亡抑制和增殖作用增強(qiáng)，該機(jī)制在卵巢癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中已被證實(shí)[17]。因此，可通過抑制Bcl2與Beclin1的BH3區(qū)域結(jié)合，從而進(jìn)行膀胱癌的治療。

綜上所述，在腫瘤發(fā)生發(fā)展的不同階段，多種基因發(fā)揮著不同的作用，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)Beclin1和Bcl2 mRNA表達(dá)異常與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，聯(lián)合檢測(cè)Beclin1和Bcl2 mRNA表達(dá)對(duì)于膀胱癌的臨床分期、預(yù)后判斷具有重要作用。但是由于膀胱癌發(fā)生發(fā)展的復(fù)雜性，且本實(shí)驗(yàn)并未深入研究Beclin1和Bcl2相互調(diào)控的分子機(jī)制，為精確了解膀胱癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找針對(duì)性的膀胱癌精準(zhǔn)治療方案，需要更深層次地研究膀胱癌中Beclin1和Bcl2 mRNA相互作用的調(diào)控機(jī)制。