秋刀魚中組胺菌的分離及其理化性質(zhì)研究

江 凱，王韋華，陳 偉，王利斌，湯海清，羅海波，郁志芳

（1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 食品學(xué)院，浙江 寧波 315100；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；3.浙江萬里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院 浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，浙江 寧波315100；4.南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 210043）

秋刀魚（Cololabis saira），俗稱竹刀魚，廣泛分布于西北太平洋公海及其沿岸海域，是一種重要的遠(yuǎn)洋經(jīng)濟(jì)魚類[1]。秋刀魚含有豐富的蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、礦物質(zhì)和維生素等，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，而且具有一定的抑制高血壓、心肌梗塞和動(dòng)脈硬化等作用，深受廣大消費(fèi)者喜愛[2]。然而，秋刀魚從捕撈到直接銷售或加工至少需要2個(gè)月，在貯藏銷售過程中經(jīng)常會(huì)因微生物的活動(dòng)產(chǎn)生大量生物胺尤其是組胺，而人體攝入8～40 mg組胺即可引起輕微中毒，嚴(yán)重的可致休克甚至死亡[3-4]。研究表明，青皮紅肉魚類（如鯖魚、鮐魚、金槍魚、秋刀魚、沙丁魚、鰹魚等）中組胺產(chǎn)生與組胺菌生長代謝直接相關(guān)，水產(chǎn)品在沒有受到組胺菌污染的情況下即使腐敗也不會(huì)產(chǎn)生組胺，抑制組胺菌的生長代謝有利于降低青皮紅肉魚類的組胺含量，因此對水產(chǎn)品中組胺菌的分離鑒定及其理化性質(zhì)的研究成為科研人員的重要課題。目前，研究人員已從鰹魚[5-6]、金槍魚[7]、鲅魚[8]、鯖魚[9]和發(fā)酵魚[10]等水產(chǎn)品中分離出了幾十種組胺菌，但不同的產(chǎn)品及不同的貯藏條件其優(yōu)勢組胺菌有較大差異。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 秋刀魚原料購自寧波南聯(lián)冷凍食品有限公司，取7條凍藏（-18℃）保存的秋刀魚用無菌袋裝好，于4℃放置5 d備用。

1.1.2 試劑 磷酸組胺、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、正戊醇、對硝基苯胺、亞硝酸鈉、鹽酸二甲基對苯二胺、α-萘酚、無水乙醇、高氯酸、氫氧化鈉、鹽酸、硼酸、酚酞、甲基紅、次甲基藍(lán)等均為分析純；蛋白胨、酵母浸膏、瓊脂、平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA），杭州百思生物技術(shù)有限公司；結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（VRBGA）、硫代硫酸鈉檸檬酸鹽膽鹽蔗糖（TCBS）、假單胞菌瓊脂基礎(chǔ)（CN基礎(chǔ)），杭州微生物試劑有限公司；假單胞菌CFC選擇培養(yǎng)基、大腸桿菌生化鑒定管（HBIG13）、腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定條（HBIG08）及相關(guān)試劑盒，青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器 THZ-98A恒溫調(diào)速多用振蕩器，金壇市維誠實(shí)驗(yàn)器材廠；G6全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)器，SHINESO迅數(shù)；SW-CJ-1F潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；智能恒溫恒濕箱，寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海維誠儀器有限公司；BSA224S-CW電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；UV2200型紫外可見分光光度計(jì)，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；自動(dòng)旋渦混合器，天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠；DHG-9247A電熱恒溫干燥箱，上海賀德實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SCIENTZ-09無菌均質(zhì)器，寧波新芝生物科技股份有限公司；MLS-3780高壓蒸汽滅菌器，三洋電機(jī)株式會(huì)社；AllegraTM64R臺式高速冷凍離心機(jī)，德國貝克曼公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 組胺選擇性培養(yǎng)基：酵母膏5 g、胰蛋白胨 5 g、L-組氨酸 20 g、氯化鈉 5 g、瓊脂 15 g、甲酚紅（0.5 g/100 mL）20 mL，蒸餾水定容至1 000mL，調(diào)pH值至6.5。組氨酸肉湯液體培養(yǎng)基：酵母膏3 g、蛋白胨10 g、L-組氨酸5 g、葡萄糖10 g，50%海水定容至1 000 mL，調(diào)pH值至6.5。半海水培養(yǎng)基：酵母膏 2.5 g、牛肉膏2.5 g、蛋白胨5 g、葡萄糖1 g、瓊脂20 g，50%海水定容至 1 000 mL，調(diào)pH值至7.0。半海水流動(dòng)培養(yǎng)基將瓊脂改為3 g，其余不變。以上培養(yǎng)基121℃蒸汽滅菌15～20 min，冷卻備用[3，9]。

1.2.2 菌株分離純化 無菌操作下稱取25 g秋刀魚中段（含內(nèi)臟）樣品絞碎后放入無菌袋，加入225mL 0.9%無菌生理鹽水，于均質(zhì)器中拍打3 min，按照 10 倍稀釋法稀釋為 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6備用。分別吸取不同稀釋度菌液0.1 mL于平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）培養(yǎng)基、半海水培養(yǎng)基、假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（VRBGA）培養(yǎng)基、硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖（TCBS）瓊脂培養(yǎng)基和假單胞菌瓊脂（CN）基礎(chǔ)培養(yǎng)基，置36±1℃培養(yǎng)48～72 h。根據(jù)菌落邊緣、顏色、大小、凹凸等特性，挑取不同菌落接種于胰胨大豆瓊脂（TSA）斜面，36±1℃培養(yǎng)48 h。將TSA斜面菌種接種于組胺選擇性培養(yǎng)基，36±1℃培養(yǎng)48 h，周圍顯紅色的菌落為組胺菌。

1.2.3 組胺定性檢測 參照陶志華等[3]的方法稍作修改。將單菌落接種于組氨酸肉湯液體培養(yǎng)基，36±1℃培養(yǎng)24～48 h，取1 mL培養(yǎng)液加入5 mL 80%乙醇，12 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的試管中，加入0.5～1 mL 0.5%甲酚紅溶液，振蕩后與空白對照（黃褐色）進(jìn)行比較，陽性組呈橙紅色。

1.2.4 組胺定量檢測 參照GB/T 5009.45—2003水產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法測定樣品中組胺含量[10]。

1.2.5 理化性質(zhì)分析 1）革蘭氏染色：參照文獻(xiàn)[11]所述革蘭氏染色法操作。

2）運(yùn)動(dòng)性檢測：用接種針取少量菌種接種于半流動(dòng)海水培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)管內(nèi)，36±1℃培養(yǎng)48 h后觀察。實(shí)驗(yàn)管內(nèi)培養(yǎng)基全部呈渾濁狀態(tài)為具有運(yùn)動(dòng)性，只在接種處生長的菌種為非運(yùn)動(dòng)性[12-13]。

3）HBIG13和HBIG08實(shí)驗(yàn)：挑取單菌落于無菌生理鹽水中振蕩均勻，每孔加入100 μL菌懸液，其中固體和半固體生化管采用穿刺接種，按照鑒定管/條說明書進(jìn)行操作。賴氨酸、鳥氨酸和氨基酸對照用滅菌的石蠟覆蓋液面。接種后蓋上蓋子，36±1℃培養(yǎng)48 h，根據(jù)顏色變化判定陽性和陰性[12-13]。

4）氧化酶實(shí)驗(yàn)：取白色潔凈濾紙沾取菌落，加鹽酸二甲基對苯二胺溶液一滴，陽性者呈現(xiàn)粉紅色，并逐漸加深；再加α-萘酚溶液一滴，陽性30 s內(nèi)呈現(xiàn)鮮藍(lán)色，陰性2 min內(nèi)不變色[12-13]。

5）過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)：用接種環(huán)取培養(yǎng)48 h的斜面菌種一小環(huán)涂抹于無菌載玻片上，滴1滴3%H2O2溶液，如有氣泡產(chǎn)生則為陽性，無氣泡產(chǎn)生則為陰性[12-13]。

6）糖分解實(shí)驗(yàn)：在組氨酸肉湯培養(yǎng)液實(shí)驗(yàn)管內(nèi)放入發(fā)酵管，121℃蒸汽滅菌20 min，冷卻至40℃左右，用接種針取少量菌種接種于實(shí)驗(yàn)管內(nèi)，36±1℃培養(yǎng)48 h后觀察。發(fā)酵管內(nèi)有氣體為陽性，否則為陰性[12-13]。

1.2.6 不同溫度對分離菌株組胺產(chǎn)生能力的影響吸取分離純化后的菌株培養(yǎng)液20 μL接種到5 mL組胺酸肉湯培養(yǎng)液中（pH 值 6.5），分別于 4±1、20±1、25±1、30±1 和 36±1 ℃靜置培養(yǎng) 24 h， 吸取 0.5mL均一的組胺酸肉湯培養(yǎng)液，加入1.5 mL 80%乙醇，8 000～10 000 r/min離心10 min，上清液按照GB/T 5009.45所述方法測定組胺濃度。

1.2.7 不同pH值對分離菌株組胺產(chǎn)生能力的影響吸取分離純化后的菌株培養(yǎng)液20 μL分別接種到5mL 不同 pH（4.5、5.5、6.5、7.5、8.5）的組胺酸肉湯培養(yǎng)液中，于36±1℃靜置培養(yǎng)72 h，每24 h取樣測定組胺濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)每個(gè)處理均重復(fù)3次，分別求其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，并用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS19.0進(jìn)行顯著性（LSD；p＜0.05）分析，用 Excel軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物分離

預(yù)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，新鮮秋刀魚菌落總數(shù)在（1.6～2.2）×102cfu/g之間，組胺菌數(shù)量較少，采用100、10-1、10-2稀釋度菌懸液均未分離獲得組胺菌，而秋刀魚在0～4℃低溫下貯藏期間菌落總數(shù)迅速上升，貯藏5 d已超過1.0×106cfu/g。因此，為獲得較好的分離效果，實(shí)驗(yàn)將秋刀魚于4℃放置5 d后進(jìn)行組胺菌分離。秋刀魚菌懸液通過PCA培養(yǎng)基、半海水培養(yǎng)基、CFC選擇性培養(yǎng)基、VRBGA培養(yǎng)基和TCBS瓊脂培養(yǎng)基初篩，獲得菌落特征不同的菌株10株，挑取單菌落接種到TSA斜面純化后，將其接種到組胺選擇性培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)有5株菌呈組胺陽性反應(yīng)，分別編號為菌株1～5并進(jìn)行理化特性分析。

2.2 菌株理化特性

表1顯示，菌株1～5均為革蘭氏陰性菌，菌株1、2 為非運(yùn)動(dòng)性，菌株 3、4、5 具有運(yùn)動(dòng)性，5 株菌均不產(chǎn)硫化氫，不能利用肌醇、山梨醇和核糖醇。根據(jù)表1理化特性分析結(jié)果參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[12]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[13]，初步確定 5株菌分別為哈夫尼菌屬（Hafnia）、志賀氏菌屬（Shigella）、變形菌屬（Proteus Hauser）、沙雷鐵氏菌屬（Serratia）和假單胞菌屬（Pseudomonas）。

表1 菌株鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of 5 isolated strains

2.3 不同培養(yǎng)溫度對分離菌株組胺產(chǎn)生能力的影響

圖1顯示，分離出的5株菌均有較強(qiáng)的組胺產(chǎn)生能力，培養(yǎng)24 h組胺質(zhì)量濃度在6.27～26.77 mg/mL之間。溫度對菌株1～5組胺產(chǎn)生能力均有顯著（p＜0.05）影響，20、25和36℃溫度下各菌株組胺產(chǎn)生能力較高，其最適溫度分別為20、36、36、20和25℃，培養(yǎng) 24 h后組胺質(zhì)量濃度分別為 24.87、23.12、21.47、26.77和24.52 mg/mL，表明此5株菌均為嗜溫菌且組胺產(chǎn)生能力較強(qiáng)。圖1還顯示，盡管4℃低溫下各菌株組胺產(chǎn)生能力受到顯著 （p＜0.05）抑制，但經(jīng)24 h培養(yǎng)后組胺質(zhì)量濃度仍達(dá)到較高水平（7.62～13.67 mg/mL），這可能與秋刀魚在4℃低溫貯藏條件下組胺含量仍快速上升有關(guān)。需要特別指出的是，30℃溫度下各菌株組胺產(chǎn)生能力均顯著（p＜0.05）降低，其中菌株1和菌株4組胺質(zhì)量濃度甚至低于4℃，表明30℃不適合此5株菌產(chǎn)生組胺。

圖1 不同培養(yǎng)溫度對分離菌株組胺產(chǎn)生能力的影響Fig.1 Effects of different incubation temperatures on the histamine producing capacity of 5 isolated bacteria

2.4 不同pH值和培養(yǎng)時(shí)間對分離菌株組胺產(chǎn)生能力的影響

圖2顯示，菌株1～5在pH值4.5～8.5范圍內(nèi)均能代謝產(chǎn)生組胺，pH值和培養(yǎng)時(shí)間對菌株1～5組胺產(chǎn)生能力有顯著（p<0.05）影響，各菌株分別在pH值為 8.5、7.5、6.5、6.5 和 7.5 的條件下培養(yǎng) 72 h 后表現(xiàn)出最大組胺質(zhì)量濃度，pH值4.5～5.5對各菌株組胺產(chǎn)生能力有顯著（p<0.05）抑制作用，表明該5株菌適宜在pH值6.5～8.5條件下生長產(chǎn)生組胺。需要特別指出的是，盡管菌株1～5在大多數(shù)pH值條件下，組胺產(chǎn)生量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長逐漸增加，但在少數(shù)pH值下有下降現(xiàn)象，如菌株1在pH值4.5和5.5、菌株2和菌株3在pH值6.5、菌株4在pH值4.5、菌株5在pH值4.5和7.5，是取樣誤差還是實(shí)驗(yàn)錯(cuò)誤，具體原因值得進(jìn)一步研究。

圖2 不同pH值和培養(yǎng)時(shí)間對分離菌株組胺產(chǎn)生能力的影響Fig.2 Effects of different pH value and incubation time on the histamine producing capacity of 5 isolated bacteria

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)一些細(xì)菌體內(nèi)具有較強(qiáng)活性的脫羧酶，可催化青皮紅肉魚類中的組氨酸脫羧而產(chǎn)生組胺，當(dāng)魚鮮度下降甚至腐敗后就會(huì)產(chǎn)生大量組胺，食用過量的組胺便有中毒的危險(xiǎn)，因此大量的研究也主要集中在組胺菌分離鑒定及其理化特性等方面[14]。表2總結(jié)了近年來科研人員在不同水產(chǎn)品中分離鑒定出的組胺菌，其中腸桿菌屬（Enterobacteriaspp.）、 假單胞菌屬 （Pseudomonasspp.）、 摩根菌屬（Morganellaspp.）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacterspp.）、肺炎桿菌屬 （Kielbasasspp.）、 芽孢桿菌屬（Bacillus）、 弧菌屬 （Vibriospp.） 和葡萄球菌屬（Staphylococcus）是水產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)較多的組胺菌屬，在適宜環(huán)境條件下這些菌的組胺產(chǎn)生能力大多能達(dá)到1 mg/mL以上，表明這些菌是導(dǎo)致青皮紅肉魚類組胺中毒的主要細(xì)菌，在貯藏及生產(chǎn)加工過程中應(yīng)進(jìn)行重點(diǎn)控制。此外，變形桿菌（Proteus vulgaris）、雷氏普羅威斯登菌（Providencia rettgeri）、嗜鹽鏈球菌（Tereagenococcus halophilus）和解鳥氨酸拉烏爾菌（Raoultella ornithinolytica）在少數(shù)水產(chǎn)品中也有發(fā)現(xiàn)，且具有較強(qiáng)的組胺產(chǎn)生能力。本實(shí)驗(yàn)從不新鮮的秋刀魚中不僅分離到假單胞菌屬（Pseudomonas）和變形菌屬（Proteus Hauser），而且還分離獲得3株新的組胺菌，分別為哈夫尼菌屬（Hafnia）、志賀氏菌屬 （Shigella）和沙雷鐵氏菌屬（Serratia），在適宜培養(yǎng)條件下5株菌的組胺產(chǎn)生能力均高達(dá)20 mg/mL以上，這可能是秋刀魚容易腐敗變質(zhì)的重要原因。

溫度和pH值是影響組胺菌產(chǎn)生組胺的重要因素，不同組胺菌適宜的溫度不同，同時(shí)受環(huán)境中氫離子濃度的影響。從表2可知，大部分組胺菌的適宜溫度和pH值分別在20～36℃和6.5～7.5范圍之間，屬于中溫菌，且適宜在中性偏堿性環(huán)境中生長產(chǎn)生組胺。研究表明，低溫和pH值5.5以下酸性環(huán)境能抑制水產(chǎn)品中組胺菌的活動(dòng)從而減少組胺的產(chǎn)生。童玲等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在0和4℃環(huán)境下，扁舵鰹中腸桿菌科 （Enterobacteriaceae）、假單胞菌屬（Pseudomonasspp.）和弧菌屬（Vibriospp.）等組胺菌生長繁殖受到抑制，其中弧菌屬在5 d貯藏期間幾乎停止生長。本實(shí)驗(yàn)研究獲得的5株菌適宜溫度分別為 20、36、36、20和 25℃，適宜 pH 值分別為 8.5、7.5、6.5、6.5和7.5，與前人研究結(jié)果基本一致。然而，盡管4℃低溫顯著（p<0.05）抑制了5株菌組胺產(chǎn)生能力，但經(jīng)24 h培養(yǎng)后仍能產(chǎn)生較高質(zhì)量濃度的組胺，這與弧菌屬（Vibriospp.）在低溫下的反應(yīng)不同。

根據(jù)目前已分離鑒定組胺菌的理化特性分析結(jié)果，不同組胺菌適宜的生長溫度、pH值及組胺產(chǎn)生能力大小均不相同，即使不同產(chǎn)品中分離得到的相同菌株其組胺產(chǎn)生能力也存在較大差異，尤其在凍藏（<-18℃）溫度下和腌漬過程中這些組胺菌的特性還知之甚少。在今后的研究中，通過分析不同組胺菌在-18℃或更低凍藏溫度條件下或低溫腌漬等過程中的生長及其理化特性，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢組胺菌群并提出針對性的控制措施，對維持青皮紅肉魚類鮮度確保食用安全具有重要的意義。

表2 不同菌株組胺產(chǎn)生能力Table 2 Bistamine producing capacity of different bacteria

4 結(jié)語

本研究分離獲得5株菌能產(chǎn)生組胺并初步鑒定為哈夫尼菌屬（Hafnia）、志賀氏菌屬（Shigella）、變形菌屬（Proteus Hauser）、沙雷鐵氏菌屬（Serratia）和假單胞菌屬（Pseudomonas）。5株菌在適宜的培養(yǎng)條件下均有較強(qiáng)的組胺產(chǎn)生能力，適宜培養(yǎng)溫度范圍為20～36℃，4℃下仍能產(chǎn)生大量組胺；在pH值4.5～8.5范圍內(nèi)均能生長，適宜pH值范圍為6.5～8.5。以上結(jié)果為秋刀魚組胺菌控制提供了理論依據(jù)。