耐利奈唑胺頭狀葡萄球菌耐藥性及患者臨床特征

方 芳，李雪寒，李一榮

(1. 武漢大學(xué)中南醫(yī)院檢驗科，湖北 武漢 430071； 2. 武漢大學(xué)，湖北 武漢 430071)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集某院微生物實驗室2018年6—10月分離的頭狀葡萄球菌共15株，其中分離自5例患者的7株頭狀葡萄球菌對利奈唑胺耐藥。標(biāo)準(zhǔn)菌株為頭狀葡萄球菌ATCC 29213和ATCC 25923，購自美國標(biāo)準(zhǔn)菌株保存中心。攜帶CFR耐藥基因的耐利奈唑胺頭狀葡萄球菌由北京大學(xué)人民醫(yī)院陳宏斌博士惠贈。

1.1.2 實驗材料 VITEK 2 Compact 全自動微生物分析系統(tǒng)和質(zhì)譜分析儀(VITEK MS IVD 3.0)為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品。限制性內(nèi)切酶Sma I、高保真及常規(guī) PCR試劑均購自大連TaKaRa公司。 Bio-RadT100PCR、脈沖場電泳系統(tǒng)及凝膠成像系統(tǒng)為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病例資料收集 查閱5例耐利奈唑胺頭狀葡萄球菌感染患者的電子病歷，了解基本信息，包括年齡、性別、科室、標(biāo)本類型、取樣時間、導(dǎo)管類型、住院時間和基礎(chǔ)疾病等資料。

1.2.2 菌株鑒定及敏感試驗 頭狀葡萄球菌鑒定采用VITEK 2 Compact 全自動微生物分析系統(tǒng)，采用質(zhì)譜分析方法進(jìn)行確認(rèn)?？咕幬锩舾性囼炓膊捎肰ITEK 2 Compact 全自動微生物分析系統(tǒng)完成，并采用美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)M100-S27進(jìn)行判斷。

1.2.3 基因組DNA提取 收集對數(shù)生長期的頭狀葡萄球菌懸液1 mL,3 000 r/min離心5 min，用溶葡萄球菌素和細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取沉淀中頭狀葡萄球菌的基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 耐藥基因檢測 提取細(xì)菌基因組DNA后，PCR引物及反應(yīng)條件見表1。PCR反應(yīng)總體積25 μL，其中mix 12.5 μL，滅菌蒸餾水7.5 μL，上下游引物各2 μL，模板DNA 1 μL。PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。rplC、rplD和3S rRNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測序。采用DNAMAN軟件，對核苷酸序列與大腸埃希菌K-12的核苷酸系列進(jìn)行比對分析。

表1 PCR引物序列及反應(yīng)條件

1.2.5 脈沖場凝膠電泳(PFGE)和聚類分析 頭狀葡萄球菌臨床分離株的基因組DNA經(jīng)Sma I酶切后進(jìn)行PFGE電泳，分析其同源性，具體方法見參考文獻(xiàn)[6]。主要步驟包括細(xì)菌包埋膠塊制作、細(xì)菌裂解、膠塊內(nèi)核酸的酶切、上樣、電泳、染色、脫色和圖像獲取。選用限制性內(nèi)切酶Sam I對試驗菌株進(jìn)行酶切(30℃，3 h)，選用限制性內(nèi)切酶Xba I對分子量標(biāo)準(zhǔn)參考菌株H9812進(jìn)行酶切(37℃，3 h)。電泳參數(shù)：電壓6 V/cm，電場角度120度，脈沖時間4～40 s，電泳時間18 h。電泳結(jié)束后，進(jìn)行染色、脫色后獲取圖像。采用BioNumerics軟件(Version 7.6)對電泳圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，設(shè)置Dice相關(guān)系數(shù)為1.5%，設(shè)置條帶位置差異容許度為1.5%，采用UPGMA方法分析菌株間的相似性，繪制聚類分析樹狀圖。

2 結(jié)果

2.1 病例資料 5例患者來自4個不同的科室，均有較嚴(yán)重的基礎(chǔ)疾病，住院時間均較長，其中3例患者深靜脈置管，1例同時深靜脈、腎透析置管。3例患者分別使用過利奈唑胺治療4～11 d。見表2。

2.2 藥敏結(jié)果 對7株耐利奈唑胺頭狀葡萄球菌進(jìn)行藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)均對苯唑西林耐藥，未發(fā)現(xiàn)對萬古霉素、替考拉寧耐藥的菌株，對利福平、四環(huán)素、奎奴普丁/達(dá)福普汀敏感。見表3。

表2 7株耐利奈唑胺頭狀葡萄球菌標(biāo)本來源及患者信息

RDC：腎透析導(dǎo)管;CVC：中心靜脈導(dǎo)管

表3 7株耐利奈唑胺頭狀葡萄球菌的藥敏試驗結(jié)果

R：耐藥；S：敏感

2.3 耐藥相關(guān)基因檢測 7株耐利奈唑胺頭狀葡萄球菌均未檢測到CFR基因。見圖1。用大腸埃希菌K-12進(jìn)行定位,分析23S rRNA全系列，發(fā)現(xiàn)7株耐藥株均存在23S rRNA 第V區(qū)G2576T和C2104T突變，其他功能區(qū)存在C1472T突變。部分位點(diǎn)的測序圖顯示是雙峰，可能與基因多態(tài)性有關(guān)。見圖2。7株耐藥株均未檢測到編碼L3和L4核糖體蛋白的rplC和rplD突變。

2.4 PFGE圖譜聚類分析 以差異帶大于3為不同PFGE圖譜，7株耐利奈唑胺頭狀葡萄球菌具有相同的PFGE圖譜，而8株利奈唑胺敏感的頭狀葡萄球菌呈現(xiàn)7種PFGE圖譜，見圖3。將15株頭狀葡萄球菌的PFGE圖譜和信息進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示7株耐藥株的同源性為96.3%，為同一克隆系，見圖4。

注：第1—8泳道分別為菌株 991(LR)、698(LR)、006(LR)、573(LR)、338(LR)、348(LR)、550(LR)、240(LS); 9泳道為陽性對照，10泳道為陰性對照，M為Marker DL764;LR: 利奈唑胺耐藥頭狀葡萄球菌;LS: 利奈唑胺敏感頭狀葡萄球菌

圖17株耐利奈唑胺頭狀葡萄球菌CFR基因檢測電泳圖

Figure1Electrophoresis map of CFR gene detection of 7 LRSC strains

圖2 含G2576和C2104T突變的23S rRNA系列測序圖

注：M為Lambda PFGE Marker; 第1—15泳道分別為菌株345(LR)、 991(LR)、447(LS)、137(LS)、188(LS)、890(LS)、006(LR)、698(LR)、780(LS)、785(LS)、550(LR)、 240(LS)、993(LS)、338(LR)、573(LR); LR: 利奈唑胺耐藥頭狀葡萄球菌;LS: 利奈唑胺敏感頭狀葡萄球菌

圖315株頭狀葡萄球菌PFGE圖譜

Figure3PFGE map of 15 strains ofS.capitis

圖4 15株頭狀葡萄球菌PFGE聚類分析圖

3 討論

本組研究顯示，7株耐利奈唑胺頭狀葡萄球菌均對苯唑西林耐藥，并呈現(xiàn)多重耐藥，未在我國上市的喹努普丁/達(dá)福普汀對利奈唑胺耐藥的葡萄球菌表現(xiàn)較強(qiáng)的體外抗菌活性，為利奈唑胺耐藥革蘭陽性菌感染的治療帶來了希望。7株耐藥株大部分分離自血流感染患者。這些患者均有基礎(chǔ)疾病，住院時間都很長，大部分在介入治療前使用過利奈唑胺進(jìn)行治療，大部分深靜脈置管，表明基礎(chǔ)疾病、長時間住院、之前長療程使用利奈唑胺治療和深靜脈置管的患者更容易感染此類菌。值得注意的是，4號患者兩次在血液里分離出耐利奈唑胺頭狀葡萄球菌，兩次檢出時間前后間隔一個多月，表明耐利奈唑胺頭狀葡萄球菌很容易在患者的皮膚或環(huán)境中長期定植，易造成醫(yī)院感染，提示醫(yī)院一旦出現(xiàn)此類菌應(yīng)嚴(yán)格做好醫(yī)院感染監(jiān)控、消毒和隔離。同時提示未使用利奈唑胺治療的患者也可能攜帶耐利奈唑胺葡萄球菌，因此，對于長期住院或免疫力低下的感染患者，應(yīng)定期送檢標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，以便及時調(diào)整抗菌藥物和發(fā)現(xiàn)耐藥菌并采取相應(yīng)的措施遏制其傳播。利奈唑胺耐藥株目前在葡萄球菌中仍不常見[7]，與利奈唑胺由化學(xué)合成，并且作用于蛋白質(zhì)合成的早期，不易與其他抑制蛋白質(zhì)合成的抗生素產(chǎn)生交叉耐藥的特性相關(guān)[8]。

近年來，因耐藥基因CFR導(dǎo)致的耐藥越來越多的引起人們的關(guān)注，除葡萄球菌，其還存在于其他革蘭陽性球菌以及革蘭陰性桿菌中[3]。CFR通過編碼rRNA甲基轉(zhuǎn)移酶，引起細(xì)菌核糖體23S rRNA的2503位腺嘌呤殘基甲基化，干擾抗菌藥物的定位以及與細(xì)菌核糖體的結(jié)合而導(dǎo)致耐藥[9]。CFR基因最早在2000年從牛體內(nèi)培養(yǎng)出的松鼠葡萄球菌中分離[10]，該基因主要存在于質(zhì)粒中，可以引起氯霉素和氟苯尼考共同耐藥，能在葡萄球菌屬細(xì)菌間水平傳播[11]。因此，CFR基因可在微生物群內(nèi)播散，大大增加了利奈唑胺耐藥株流行的可能性。本研究中的7株耐藥菌均未檢出CFR耐藥基因。

本院已出現(xiàn)耐利奈唑胺頭狀葡萄球菌。本研究通過對利奈唑胺耐藥機(jī)制進(jìn)行深入研究，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致本院出現(xiàn)耐利奈唑胺頭狀葡萄球菌的主要原因是23S rRNA V區(qū) G2576T和C2104T兩個位點(diǎn)突變,與之前報道[12]一致。同時其他功能區(qū)存在C1472T突變，這個位點(diǎn)的突變與耐藥是否相關(guān)有待進(jìn)一步考證。23S rRNA V區(qū)基因突變是由于葡萄球菌23S rRNA在染色體中存在多個拷貝數(shù)，基因突變是自發(fā)形成的，因此，耐藥性形成過程緩慢，并且這種突變大部分出現(xiàn)在長期使用利奈唑胺治療的患者中。23S rRNA突變是導(dǎo)致腸球菌屬和葡萄球菌屬臨床株發(fā)生耐藥最常見的機(jī)制，其中G2576T、T2500A、G2447T是最常見的突變位點(diǎn)[13]。據(jù)文獻(xiàn)[14-16]報道，G2576臨床株突變與利奈唑胺長療程地使用及使用劑量密切相關(guān),提示臨床醫(yī)生應(yīng)合理地使用利奈唑胺進(jìn)行治療。

7株耐藥株均未檢測到編碼L3和L4核糖體蛋白的rplC和rplD突變，由編碼L3、L4核糖體蛋白rplC和rplD基因突變導(dǎo)致葡萄球菌對利奈唑胺耐藥在其耐藥機(jī)制中不常見。L3和L4核糖體蛋白的突變主要發(fā)生在核糖體轉(zhuǎn)移酶(PTC)中心區(qū)，通過改變23S rRNA的穩(wěn)定性和構(gòu)型而導(dǎo)致利奈唑胺敏感性降低[11,17]。

PFEG聚類分析顯示，7株耐藥頭狀葡萄球菌是同一克隆系，可能是醫(yī)院感染導(dǎo)致的，提示醫(yī)院應(yīng)控制患者的住院時間，加強(qiáng)對抗菌藥物使用的管理,并主動監(jiān)測利奈唑胺耐藥的陽性球菌，一旦出現(xiàn)此類耐藥菌，應(yīng)積極地采取消毒和隔離措施，控制利奈唑胺耐藥菌的傳播。