銀杏葉正丁醇部位化學(xué)成分及其抗氧化活性研究

浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 杭州 310053

銀杏（Ginkgo biloba L.）作為銀杏科唯一幸存的物種，有“活化石”之稱(chēng)，已被國(guó)際自然保護(hù)聯(lián)盟（International Union for Conservation of Nature，IUCN）紅色名錄[1]和《中國(guó)植物紅皮書(shū)》[2]列為瀕危植物?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究認(rèn)為，銀杏提取物具有廣泛的生物活性，包括清除自由基、改善血液流變學(xué)指標(biāo)、保護(hù)血管、增強(qiáng)認(rèn)知能力、抗血小板活化等[3]。銀杏葉為我國(guó)特色中藥材，近幾年來(lái)引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。銀杏葉化學(xué)成分復(fù)雜、種類(lèi)繁多，目前絕大部分研究集中于對(duì)黃酮類(lèi)和萜內(nèi)酯類(lèi)活性成分的研究，這兩類(lèi)成分主要分布于銀杏葉的石油醚和乙酸乙酯部位，而對(duì)于其正丁醇部位的化學(xué)及藥理研究較少，故本實(shí)驗(yàn)對(duì)銀杏葉正丁醇部位進(jìn)行系統(tǒng)研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥品試劑和主要消耗品 銀杏葉購(gòu)于云南?？瞪锟萍加邢薰荆ㄅ?hào)：20160702）；1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、維生素 C（vitamin C，Vit C）、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）、2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azino bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司 （批號(hào)：W27F10E81251、J04A10R84808、25D8N51258、Y27A10K87055）；過(guò)硫酸鉀購(gòu)于上海展云化工有限公司（批號(hào)：190103）；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）均購(gòu)于美國(guó)TEDIA公司（批號(hào)：19015156、19055131）；純凈水購(gòu)于杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司（批號(hào)：20190220）；其余試劑均為分析純。柱色譜硅膠（100～200目、200～300目）和薄層色譜硅膠 GF254購(gòu)于青島海洋化工有限公司（批號(hào)：0180026、0180192、20180318）；聚酰胺（60～90目）購(gòu)于江蘇長(zhǎng)豐化工有限公司（批號(hào)：20181115）；XB-C18填料購(gòu)于禹城化工（上海）有限公司（批號(hào)：401M014）。

1.1.2 主要儀器 BioTek Cytation 1細(xì)胞成像多功能酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)BioTek公司；Bruker AVANCEⅢ600MHz核磁共振儀購(gòu)于瑞士 Bruker公司；SHIMADZU LC-MS 8050液質(zhì)聯(lián)用儀購(gòu)于日本島津公司；Agilent 1260高效液相色譜和Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）均購(gòu)于美國(guó)安捷倫公司；島津LC-20A半制備液相色譜儀、Shim-pack GIST色譜柱（20mm×250mm，5μm）均購(gòu)于日本島津公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購(gòu)于瑞士Buchi公司；冷凍干燥機(jī)購(gòu)于上海比朗儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取和分離 將10kg干燥銀杏葉粉碎，分別用10倍量70%乙醇加熱回流提取3次，每次1h，合并所有提取液，減壓濃縮干燥，得到銀杏葉醇提總浸膏3.5kg。銀杏葉總浸膏用水均勻混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇分級(jí)萃取，萃取液減壓濃縮，分別得到石油醚部位385g、乙酸乙酯部位388g、正丁醇部位600g。取正丁醇部位300g經(jīng)聚酰胺色譜柱，依次用水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇洗脫，經(jīng)分析合并得到5個(gè)餾分Fr.A1～A5。Fr.A1（3.6g）以二氯甲烷-甲醇（1:0-0:1）為洗脫溶劑，經(jīng)硅膠色譜柱，分離得到8個(gè)餾分 Fr.B1～B8。Fr.B2（211mg）經(jīng)半制備液相甲醇-水（3:7）純化，得到化合物1（28.1mg）。Fr.A3（21g）以二氯甲烷-甲醇（50:1-0:1）為洗脫溶劑，經(jīng)硅膠色譜柱，分離得到9個(gè)餾分Fr.C1～C9。Fr.C8（3.4g）經(jīng)反相十八烷基硅烷鍵合硅膠（octade-cylsilyl，ODS）色譜柱處理后得到流分 Fr.C8.a～Fr.C8.h。Fr.C8.b（1.7g）經(jīng)開(kāi)放ODS柱色譜處理和半制備液相分離純化后得到化合物2（41mg）和化合物3（8.4mg）。Fr.C8.d（32mg）、Fr.C8.e（59mg）、Fr.C8.g（17mg）分別經(jīng)半制備液相分離純化得到化合物4（15.8mg）、化合物 5（19.8mg）和化合物 6（4.8mg）?；衔?1～6 結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

1.2.2 抗氧化活性測(cè)定 化合物抗氧化活性分別采用1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除法和 2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azino bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS)自由基清除法測(cè)定。

1.2.2.1 DPPH自由基清除法 用無(wú)水乙醇將DPPH配制成 2×10-3mol·L-1溶液，4℃避光保存。將 Vit C 和Trolox分別用純凈水和無(wú)水乙醇配制成2×10-3mol·L-1溶液，化合物3～6分別用無(wú)水乙醇配制成2×10-3mol·L-1溶液，化合物1、2分別用無(wú)水乙醇配制成4×10-3mol·L-1溶液，使用前以純凈水或無(wú)水乙醇稀釋成所需濃度。

參考段世廉等[4]的方法并加以改進(jìn)，將不同濃度的供試品溶液 60μL和 1×10-4mol·L-1DPPH 溶液140μL加入96孔板各孔中，選擇常用抗氧化劑Vit C和Trolox作為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)以不加DPPH（以140μL無(wú)水乙醇代替DPPH）的各濃度供試品溶液作為對(duì)照，以消除供試品本身顏色對(duì)測(cè)定結(jié)果的干擾，并設(shè)DPPH空白對(duì)照（以60μL無(wú)水乙醇代替供試品），每組平行設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將96孔板放入酶標(biāo)儀中，振蕩1min，室溫避光保存15min后測(cè)定其在517nm處的吸光度A，按如下公式計(jì)算供試品的自由基清除率。

其中AS為各濃度供試品吸光度的平均值；AC為供試品本身的吸收本底；A0為DPPH空白對(duì)照吸光度的平均值。采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算半數(shù)清除率（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.2.2.2 ABTS自由基清除法 用純凈水將ABTS和過(guò)硫酸鉀分別配制成 7×10-3mol·L-1和 2.45×10-3mol·L-1的溶液，等體積混合后，室溫避光條件下靜置12～16h。測(cè)定前，將上述混合液用純凈水稀釋20倍，使其在734nm下的吸光度為0.7±0.02，制得ABTS工作液，備用。將Trolox用無(wú)水乙醇配制成2×10-3mol·L-1溶液，化合物2用無(wú)水乙醇配制成2×10-3mol·L-1溶液，其余化合物分別用無(wú)水乙醇配制成4×10-3mol·L-1溶液，使用前用無(wú)水乙醇稀釋至所需濃度。

參考樂(lè)世俊等[5]的方法并加以改進(jìn)，將不同濃度的供試品溶液60μL和ABTS工作液140μL加入96孔板各孔中，以Trolox作為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)設(shè)ABTS空白對(duì)照（以60μL無(wú)水乙醇代替供試品），每組平行設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將96孔板放入酶標(biāo)儀中，振蕩1min，室溫避光保存90min后測(cè)定其在734nm處的吸光度A，按如下公式計(jì)算供試品的自由基清除率。

其中AS為各濃度供試品吸光度的平均值；A0為ABTS空白對(duì)照吸光度的平均值。采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算IC50。

圖1 化合物1～6化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of compounds 1～6

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

2.1.1 化合物1 為黃色油狀物。電噴霧電離-質(zhì)譜（electrospray ionization-mass spectrometry,ESI-MS）m/z:127.06[M+H]+，分子式為 C6H6O3。1H-NMR(600MHz,CD3OD)δ:9.53(1H,s,CHO)，7.38(1H,d,J=2.4Hz,H-3)，6.58(1H,d,J=2.3Hz,H-3)，4.60(2H,s,CH2OH);13C-NMR(150MHz,CD3OD)δ:179.4(CHO)，163.2(C-5)，153.9(C-2)，124.8(C-3)，110.9(C-4)，57.6(CH2OH)。光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報(bào)道的基本一致，故確定該化合物為5-羥甲基糠醛。

2.1.2 化合物2 為黃色無(wú)定形粉末。ESI-MS m/z:617.15[M+Na]+，分子式為C27H31O15。1H-NMR(600MHz,CD3SOCD3)δ:12.53(1H,S,OH)，7.76(2H,d,J=8.7Hz,H-2′,6′)，6.91(2H,d,J=8.7Hz,H-3′,5′)，6.39(1H,d,J=1.8Hz,H-8)，6.19(1H,d,J=1.8Hz,H-6)，5.56(1H,s,H-1′′)，4.24(2H,d,J=7.8Hz,H-1′′′)，4.08(2H,d,J=2.4Hz,H-2′′)，0.86(3H,d,J=6.1Hz,H-6′′)；13C-NMR(150MHz,CD3SOCD3)δ:177.6(C-4)，164.8(C-7)，161.3(C-5)，160.1(C-4′)，157.0(C-2)，156.6(C-9)，134.5(C-3)，130.6(C-2′,6′)，120.4(C-1′)，115.4(C-3′,5′)，106.1(C-1′′′)，104.0(C-10)，100.9(C-1′′)，98.9(C-6)，93.8(C-8)，81.3(C-2′′),76.7(C-3′′′)，76.3(C-5′′′)，73.9(C-2′′′)，71.7(C-4′′)，70.4(C-5′′)，70.2(C-3′′)，69.3(C-4′′′)，60.5(C-6′′′)，17.4(C-6′′)。光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道的基本一致，故確定該化合物為山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷。

2.1.3 化合物3 為黃色無(wú)定形粉末。ESI-MS m/z:617.15[M+Na]+，分子式為 C27H31O15。1H-NMR(600MHz,CD3SOCD3)δ:12.52(1H,s,OH)，7.97(2H,d,J=8.8Hz,H-2′,6′)，6.87(2H,d,J=8.8Hz,H-3′,5′)，6.36(1H,d,J=1.8Hz,H-8)，6.16(1H,d,J=1.8Hz,H-6)，5.29(1H,d,J=7.6Hz,H-1′′)，4.38(1H,d,J=1.2Hz,H-1′′′)，0.98(3H,d,J=6.2Hz,H-6′′′)；13C-NMR(150MHz,CD3SOCD3)δ:177.2(C-4)，163.9(C-7)，161.1(C-5)，159.9(C-4′)，156.6(C-2)，156.6(C-9)，133.2(C-3)，130.9(C-2′)，130.8(C-6′)，120.9(C-1′)，115.1(C-3′,5′)，103.7(C-10)，100.8(C-1′′)，100.8(C-1′′′)，98.8(C-6)，93.9(C-8)，76.4(C-3′′)，75.7(C-5′′)，74.2(C-2′′)，71.8(C-4′′′)，70.6(C-3′′′)，70.4(C-2′′′)，69.9(C-4′′)，68.3(C-5′′′)，66.9(C-6′′)，17.7(C-6′′′)。光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道的基本一致，故確定該化合物為山奈酚-3-O-β-D-蕓香糖苷。

2.1.4 化合物4 為無(wú)色油狀物。ESI-MS m/z:279.15[M+H]+，分子式為 C16H22O4。1H-NMR(600MHz,CD3OD)δ:7.71(2H,dd,J=5.7,3.3Hz,H-3,6)，7.61(2H,dd,J=5.7,3.3Hz,H-4,5)，4.28(4H,t,J=6.6Hz,H-8,8′)，1.71(4H,m,H-9,9′)，1.45(4H,m,H-10,10′)，0.97(6H,t,J=7.4Hz,11,11′-CH3)；13C-NMR(150MHz,CD3OD)δ:169.3(C-7,7′)，133.6(C-1,2)，132.3(C-4,5)，129.9(C-3,6)，66.6(C-8,8′)，31.7(C-9,9′)，20.2(C-10,10′)，14.0(C-11,11′)。光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道的基本一致，故確定該化合物為鄰苯二甲酸二丁酯。

2.1.5 化合物5 為白色無(wú)定形粉末。ESI-MS m/z:699.40[M+Na]+，分子式為 C33H56O14。1H-NMR(600MHz,CD3OD)δ:5.37-5.29(6H,m,H-9,10,12,13,15,16)，4.23(1H,d,J=7.4Hz,H-1′′)，4.13(1H,d,J=4.4Hz,H-1′′′)，3.97(1H,m,H-2′)，2.79(4H,t,J=6.0Hz,H2-11,14)，2.34(2H,t,J=7.5Hz,H2-2)，2.06(4H,m,H2-8,17)，1.38-1.30(10H,m,H2-3,4,5,6,7)，0.96(3H,t,J=7.5Hz,H3-18)；13C-NMR(150MHz,CD3OD)δ:175.5(C-1)，132.7,131.1,129.2,129.2,128.8,128.2(C-9,10,12,13,15,16)，105.3(C-1′′)，100.5(C-1′′′)，74.6(C-3′′)，74.5(C-5′′)，72.5(C-2′′)，72.5(C-5′′′)，72.1(C-1′)，71.4(C-3′′′)，71.0(C-4′′′)，70.2(C-2′′′)，70.1(C-4′′)，69.6(C-2′)，67.7(C-6′′)，66.6(C-3′)，62.7(C-6′′′)，34.9(C-2)，30.7,30.3,30.2,30.2,28.2,26.5,26.4,26.0(C-4,5,6,7,8,11,14,17)，21.5(C-3)，14.7(C-18)。光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道的基本一致，故確定該化合物為姜糖脂A。

2.1.6 化合物6 為白色無(wú)定形粉末。ESI-MS m/z:391.35[M+H]+，分子式為 C24H38O4。1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ:7.70(2H,dd,J=5.7,3.3Hz,H-3,6)，7.53(2H,dd,J=5.7,3.3Hz,H-4,5)，4.21(4H,m,H-1′,1′′)，1.67(2H,m,H-2′,2′′)，1.42(4H,m,H-a′,a′′)，1.35(4H,dd,J=8.6,4.5Hz,H-3′,3′′)，1.31(8H,m,H-3′,3′′,4′,4′′)，0.91(6H,t,J=7.6Hz,H-b′,b′′)，0.89(6H,m,H-6′,6′′)；13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:168.0(C=O)，132.7(C-1,2)，131.1(C-3,6)，129.0(C-4,5)，68.4(C-1′,1′′)，39.0(C-2′,2′′)，30.6(C-3′,3′′)，29.2(C-4′,4′′)，24.0(C-a′,a′′)，23.2(C-5′,5′′)，14.3(C-6′,6′′)，11.2(C-b′,b′′)。光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道的基本一致，故確定該化合物為鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯。

2.2 抗氧化活性評(píng)價(jià)

2.2.1 對(duì)DPPH自由基的清除作用 陽(yáng)性藥Vit C和 Trolox 分別在濃度為 （21.91±0.41）μmol·L-1和（24.13±0.32）μmol·L-1時(shí)即可達(dá)到半數(shù)清除的效果，而化合物1、2的IC50值明顯大于陽(yáng)性藥物，表明其對(duì)DPPH僅具有較弱的自由基清除效果，而其他化合物在所設(shè)濃度范圍內(nèi)均未達(dá)到半數(shù)清除效果。結(jié)果表明化合物1、2具有一定的抗氧化活性。見(jiàn)表1。

2.2.2 對(duì)ABTS自由基的清除作用 化合物2對(duì)ABTS自由基有較好的清除效果，雖然其清除效果不如陽(yáng)性藥 Trolox，后者的 IC50為（17.31±0.20）μmol·L-1，但在分離得到的化合物中效果最佳?；衔?、3對(duì)ABTS自由基僅具有較弱的清除能力，而其他化合物在所設(shè)濃度范圍內(nèi)均未達(dá)到半數(shù)清除效果?；衔?、3均為山奈酚的雙糖苷，且雙糖均為1分子葡萄糖和l分子鼠李糖組成的寡聚糖，區(qū)別在于山奈酚-3-O-β-D-蕓香糖苷（3）為葡萄糖6位羥基取代，而山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷（2）為葡萄糖2位羥基取代，保留其醛基，具有還原性，最終導(dǎo)致其抗氧化能力的差異。見(jiàn)表1。

3 討論

隨著現(xiàn)代理論的完善和技術(shù)的發(fā)展，對(duì)于銀杏中生物活性成分的研究日益深入，本實(shí)驗(yàn)對(duì)銀杏葉正丁醇部位進(jìn)行了系統(tǒng)分離，得到了6個(gè)化合物，包括2個(gè)黃酮苷類(lèi)和4個(gè)其他類(lèi)化合物，且4個(gè)其他類(lèi)化合物均為該植物中首次分離得到。在這些化合物中，5-羥甲基糠醛（1）可通過(guò)清除細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS），影響胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)抑制A375細(xì)胞的增殖，并通過(guò)提高胞內(nèi)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）酶活性，減少丙二醛（malondialdehyde，MDA）產(chǎn)生來(lái)抑制紅細(xì)胞溶血，證明其一定的抗氧化作用[12]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。鄰苯二甲酸二丁酯（4）可模擬雌激素效應(yīng)進(jìn)而促進(jìn)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖[13]，可導(dǎo)致小鼠巨噬細(xì)胞活性降低和細(xì)胞膜損傷[14]，能引起大鼠離體胸主動(dòng)脈收縮[15]等，具有一定的毒性作用。鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（6）對(duì)肝臟、腎臟、呼吸系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)均能產(chǎn)生毒性作用[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果豐富了銀杏的化學(xué)組成，為闡明銀杏的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，科學(xué)評(píng)價(jià)藥物作用，控制藥品質(zhì)量，提供了一定的理論依據(jù)。

表1 化合物1～6的抗氧化活性比較（±s,n=3）Tab.1 Comparison on antioxidant activity among compounds 1～6（±s,n=3)

表1 化合物1～6的抗氧化活性比較（±s,n=3）Tab.1 Comparison on antioxidant activity among compounds 1～6（±s,n=3)

化合物IC50（μmol·L-1）DPPH ABTS Vit C Trolox-1 2 3 4 5 6 21.91±0.41 24.13±0.32 1 156.49±45.37 529.85±11.36＞1 000＞1 000＞1 000＞1 000 17.31±0.20 843.06±8.94 87.48±2.28 200.86±11.72＞1 000＞1 000＞1 000